表面增强拉曼光谱磁免疫分析研究进展.pdf

第 卷第期光散射学报V o l N o 年月THEJ OUR NA LO FL I GHTS C A T T E R I NGJ u n 文章编号:()表面增强拉曼光谱磁免疫分析研究进展张晨杰,姚建林(苏州大学材料与化学化工学部 苏州 )摘要:基于表面增强拉曼光谱的磁免疫分析(简称S E R S磁免疫)因其可实现样品的快速分离、富集、和无损检测以及具有灵敏度高、精准及快速等优点而备受关注.本文综述了S E R S磁免疫分析基本原理及国内外的研究进展,并介绍了S E R S磁免疫与微流控、侧向流动分析及荧光联用检测技术以解决其在微量快速检测、多组分分析及不同位点分析方面的困难;最后针对影响S E R S磁免疫灵敏度提升的途径等进行展望.关键词:S E R S;磁免疫;联用技术;灵敏度;标记分子中图分类号:O 文献标志码:Ad o i:/j i s s n 收稿日期:,修改日期:基金项目:国家自然科学基金(N o ,)作者简介:张晨杰(),男,博士研究生,主要从事表面增强拉曼光谱研究,E m a i l:z h a n g c j s u d a e d u c n通讯作者:姚建林(),男,教授,主要从事表面增强谱学研究E m a i l:j l y a o s u d a e d u c nR e s e a r c hp r o g r e s s i nm a g n e t i c i mm u n o a s s a yb a s e do ns u r f a c ee n h a n c e dR a m a ns p e c t r o s c o p yZ HANGC h e n j i e,YAOJ i a n l i n(C o l l e g e o fC h e m i s t r y,C h e m i c a lE n g i n e e r i n ga n dM a t e r i a lS c i e n c e s,S o o c h o wU n i v e r s i t y,S u z h o u )A b s t r a c t:S u r f a c ee n h a n c e dR a m a ns p e c t r o s c o p y(S E R S)b a s e dm a g n e t i ci mm u n o a s s a yh a sa t t r a c t e dc o n s i d e r a b l ea t t e n t i o nd u et oi t sa b i l i t yt oa c h i e v er a p i ds e p a r a t i o n,e n r i c h m e n t,a n dn o n d e s t r u c t i v ed e t e c t i o no f t a r g e t sw i t hh i g hs e n s i t i v i t y,a c c u r a c ya n de f f i c i e n c y H e r e i n,t h ep r i n c i p l eo fS E R Sb a s e dm a g n e t i c i mm u n o a s s a ya n d i t sp r a c t i c a l a p p l i c a t i o n sw e r e r e v i e w e d;S E R Sb a s e dm a g n e t i c i mm u n o a s s a yc o m b i n e dw i t hm i c r o f l u i d i c,l a t e r a l f l o wa n a l y s i s,a n df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n t e c h n i q u e sw a s i n t r o d u c e d t os o l v e t h ed i f f i c u l t i e s i nr a p i dd e t e c t i o no f t r a c ea m o u n t s,m u l t i c o m p o n e n t a n a l y s i sa n d i d e n t i f i c a t i o no fd i f f e r e n t s i t e s f o ro v e r c o m i n gt h ed r a w b a c ki nl a c k i n gt h es p a t i o t e m p o r a l r e s o l u t i o n F i n a l l y,s e v e r a lm e t h o d st oi m p r o v e t h e s e n s i t i v i t ya n d f e a s i b i l i t yo f S E R Sb a s e dm a g n e t i c i mm u n o a s s a yw e r ep r o s p e c t e d K e yw o r d s:S E R S;M a g n e t i c i mm u n o a s s a y;C o m b i n e dd e t e c t i o nt e c h n o l o g y;S e n s i t i v i t y;l a b e l l e dm o l e c u l e s引言免疫分析法是利用抗原抗体选择性识别以及特异性结合反应的原理,对生物分子、药物、激素等各类物质进行分析检测的方法.按照是否加入标记示踪物,免疫分析法可分为非标记免疫与标记免疫分析法.前者仅通过抗原抗体结合时理化性质的变化来判断反应发生及进行程度,相较于非标记免疫分析法,标记免疫分析法的应用范围更为广泛,意义也更为重大.它是一种将敏感性的易测定示踪物质加到特异性抗原或者抗体上,通过测量示踪物质的信号从而间接获得目标待测物的含量.标记免疫分析法可细分为放射免疫分析(R I A)、荧 光免疫分析(F I A)、酶联 免 疫 分 析光散射学报第 卷(E L I S A)、化学发光免疫分析(C L I A)等一系列的检测手段.目前,标记免疫分析法在临床诊断、药物分析、食品安全及环境监测等研究领域中发挥着越来越重要的作用.然而,传统的免疫分析方法因所需设备价格高昂、操作流程复杂和耗时较长等缺点无法满足人们日益增长的检测需求,发展一种高灵敏度、快速、便捷的免疫分析方法十分迫切.表面增强拉曼光谱(s u r f a c ee n h a n c e dR a m a ns p e c t r o s c o p y,S E R S)是一种具有单分子检测灵敏度的表面分析技术,其具有许多突出的优点,如S E R S谱峰较窄可避免多种物质检测时特征峰的重叠效应,同时它不受水干扰可应用于生物细胞体系中,且不受光致褪色的影响,可长时间测试.但将S E R S应用到生物细胞体系也有许多困难,如生物细胞内成分复杂,导致S E R S谱图复杂,为谱图解析带来了技术上的困难.近年来,研究者将S E R S技术与标记免疫分析技术相结合,发展了一种基于S E R S的标记免疫分析法,S E R S标记免疫技术是在生物免疫应答的基础上发展起来的,“三明治”结构最早于上世纪八十年代由R o h r小组提出,即基底上的固相抗体与标记抗体通过与抗原的结合形成“固相抗体待测抗原标记抗体”夹心复合物,通过对标记分子S E R S信号的识别进行免疫分析.而将其运用到生物体系中,可通过其高灵敏度和高选择性的特点对生物分子进行识别和检测,从而可获得与表面或界面分子的构象、活性及取向等相关信息,以实现表界面物种的超灵敏检测.S E R S磁免疫的发展历程基于固相基底的S E R S标记免疫分析技术是一种检测目标分子的有效方法,但其也存在比较明显的缺陷,例如:固相基底上的免疫分析法所经历的组装时间长、清洗过程冗长繁琐;由于固相基底和免疫溶胶间进行的是异相反应,抗体抗原免疫复合物的组装效率低,极大程度上限制其检测灵敏度.为简化实验步骤、提高检测灵敏度,研究者提出一方面在免疫A u溶胶上组装具有双官能团的分子(如对巯基苯甲酸,MB A),MB A可通过巯基(S H)与A u纳米粒子相连,MB A的羧基端(C O OH)可与抗体抗原蛋白质中的氨基(NH)相连.MB A不仅是标记分子也是连接剂,无需在金纳米粒子表面为抗体或抗原留出空位,可提高标记分子的吸附量,提高S E R S检测灵敏度.P o r t e r等人报道了采用双官能团标记分子提高检测的灵敏度,其待测抗原的检出限达到了p gm L;另一方面研究者提出以免疫磁珠代替固相基底构建“三明治”结构,发展了S E R S磁免疫技术.其相较于固相基底免疫有几大优势:()纳米粒子比固相平面基底有着更大的比表面积,可捕获更多的目标待测物以提高灵敏度;()磁珠、抗原和标记免疫溶胶均在液相中可充分接触,省去了繁杂的组装过程,节省了孵化时间;()免疫形成的复合物可轻松地通过磁场将其与反应混合物分离,省去繁琐清洗步骤;()通过外磁场,可迅速将目标物富集至很小的体积,有利于提高检测灵敏度;()通过延长磁场作用时间或加大磁场强度,可使富集的复合物在磁场作用下进一步减小间距使粒子间的耦合作用进一步增强,进一步提高了标记分子的S E R S信号强度,实现对目标抗原的超灵敏度检测.S E R S磁免疫自诞生以来发展迅速,本文综述了非竞争性S E R S磁免疫和竞争性S E R S磁免疫在国内外的研究进展及应用,讨论了S E R S磁免疫与其他技术联用技术,最后针对S E R S磁免疫目前存在的问题展望了S E R S磁免疫未来的研究方向.S E R S磁免疫原理及应用 非竞争性S E R S磁免疫:“三明治”结构大分子抗原因其表面可供吸附的活性识别位点较多,根据抗原抗体的特异性结合作用常搭建“磁珠抗体目标抗原标记分子、抗体修饰的免疫溶胶”的“三明治”结构复合物实现对目标抗原的检测.图为非竞争性S E R S磁分离免疫检测法的基本原理,将抗原加入到免疫磁珠(免疫修饰的磁性内核A u外壳层的纳米粒子)和标记免疫A u纳米粒子的混合物中,由于抗体和抗原之间的特异性结合可形成如下三种结构:标记免疫A u纳米粒子之间相互连接;免疫磁珠之间的相互连接;标记免疫A u纳米粒子和免疫磁珠之间相互连接.当施加额外的磁场时,只有连有免疫磁珠的结构会被定向富集,即第和第种复合结构.而第种复合结构未被定向富集且仍留在溶液中,部分随其他复合结构富集的复合物可简单地通过清洗除去以消除其S E R S信号的干扰.在S E R S检测过程中只有第种结构,即免疫A u纳第期张晨杰:表面增强拉曼光谱磁免疫分析研究进展米粒子和免疫磁珠之间相互连接中包含S E R S探针,在激光照射下可以产生S E R S信号.其S E R S信号强度与目标分析物的含量在一定浓度范围内呈正相关性,以此实现对目标分析物的高灵敏检测.图“三明治”S E R S磁免疫分析示意图F i g S c h e m a t i cd i a g r a mo f m a g n e t i c i mm u n o a s s a yb a s e do nS E R Sb a s e do ns a n d w i c hs t r u c t u r e本课题组C h e n等人以溶液中的目标抗原分子为桥梁,将抗体修饰的免疫 F eOA u与抗体修饰的免疫A u纳米粒子通过“三明治”结构进行组装,并引入外磁场磁富集免疫复合物,对其进行S E R S检测,复合物的S E R S信号强度与目标抗原浓度在一定浓度范围内呈正相关性,其检测限可达到 f gm L,较三明治结构S E R S免疫分析的灵敏度提高了个数量级.该方法集修饰、组装、分离、检测于一体,简化了固相基底上繁琐的实验操作步骤,通过对溶液相中免疫复合物的磁富集作用即可完成检测,简单快速、特异性高.非竞争性磁免疫在医疗诊疗方面应用广泛,目前已有许多研究者针对肿瘤标志物进行定量检测.Z h o u等人在二元磁性核壳纳米粒子F eOA u表面修饰检测抗体,在A u纳米粒子表面修饰标记分子和捕获抗体,通过在溶液中加入前列腺特异性抗原(P S A)构建“三明治”结构并引入外磁场富集夹心复合物的方法实现了对P S A低浓度的检测.H u等人采用S E R S磁免疫方式,分别在免疫磁珠F eOA g和免疫A g溶胶表面修饰配体用于与C反应蛋白连接以形成“三明治”结构.其检测限为 p gm L.检测灵敏度优于S P R、电化学法、荧光法、电泳、比色法、E L I S A等方法.本课题组的G e等人也以“三明治”磁免疫分析法对人附睾蛋白(HE)抗原的浓度进行了检测,所得复合物的S E R S信号强度与HE 抗原的浓度在p gm L n gm L的范围内呈现良好 的 线 性 关 系,检 测 限 约 为 f gm L.S o n g等人运用磁免疫分析技术构建“三明治”结构对癌胚抗原(C E A)进行检测,其检测限可达 f gm L.随后,S o n g等人更进一步,在F eOA u磁珠表面同时修饰C E A抗体和神经元特异性烯醇化酶(N S E)抗体形成免疫磁珠,并分别制备了两种不同S E R S信号的标记免疫A u溶胶,采用磁免疫“三明治”结构实现了人血清标本中肺癌相关的两种蛋白标记物C E A和N S E的同时检 测,其 检 测 限 分 别 为 p gm L和 p gm L.Q i u等 人 更 进 一 步,利 用S E R S磁免疫构建的“三明治”结构,在 分钟内成功在活癌细胞表面高灵敏地检测肿瘤标志物C E A(如图 b),其检测限达到 细胞m L.S E R S磁免疫除了可以应用于肿瘤标志物的检测,还可以用于病毒检测.对于未知病毒,构建S E R S磁免疫对病毒进行高灵敏检测的难点是寻找到合适的适配体用于与待测物产生特异性作用.G u a n等人基于A C E 竞争的适配体选择策略和机器学习筛选算法寻找到三种具有特异性的配体,然后构建免疫磁珠和标记免疫A u溶胶,捕获S A R S C o V 病毒形成“三明治”结构复合物(如图 c).在未对样品进行任何前处理的情况下,在外加磁场下,该“三明治”结构配合物可以在分钟内通过磁体从溶液中分离出来,从而能够捕获、分离和富集目标蛋白,实现对S A R S C o V 病毒的快速检测,其检测限可 达 每 微 升 个 病光散射学报第 卷毒.A n t o i n e等人利用对s c F v数据库的生物筛选,分离出了结合S A R S C o V 刺突蛋白的单链F v(s c F v)重组抗体片段.将s c F v s偶联到磁性纳米颗粒和标记A u溶胶上,构建“三明治”结构用于快速、高灵敏、现场识别S A R S C o V ,实现了 f gm L的刺突蛋白的检测限,需要指出的是该方法对S A R S C o V 的变异体同样适用.S e b b a等人发展了一种简单的免疫检测方法,他们通过在磁珠上修饰三种不同的特异性抗体,在标记免疫A u溶胶表面修饰三种不同的抗体和探针分子,利用抗体与病毒的组氨酸蛋白抗原的特异性结合构建“三明治”结构可在 分钟内完成单个或批处理血液样本中埃博拉病毒、拉沙热病毒和疟疾的同时检测.其对埃博拉的检测具有 敏感性和 特异性,而疟疾检测具有 敏感性和 特异性.通过该策略可在疫情大流行情况下对发热患者进行快速的病原体筛查分诊.(a)(b)(c)图S E R S磁免疫“三明治”结构用于C反应蛋白(a)S A R S C o V (c)的检测;(b)在细胞表面对C E A的检测 F i g S c h e m e o f S E R S b a s e dm a g n e t i c i mm u n o s e n s o r f o rC r e a c t i v ep r o t e i n(a);S A R S C o V (c);D e t e c t i o no fC E Ao nC e l lS u r f a c e(b)常规的免疫“三明治”结构中,标记免疫溶胶和免疫磁珠上抗体或适配体相同,虽具有较好的特异性,但无法适用于同一类物质,葡萄球菌蛋白A(P A)是 一 种 从 大 多 数 金 黄 色 葡 萄 球 菌(S a u r e u s)的细胞壁分离的表面蛋白,具有四个F c结合结构域,可以特异性地附着在各种抗体的F c区域.Z h o u等人提出了一种通用的细菌S E R S标记检测系统,该系统集成了磁性捕获、游离抗体标记和P A S E R S标记结合.他们首先在纳米磁珠上修饰适配体构建免疫磁珠,将其加入到待测液中用于捕获待测细菌,随后将特异性抗体加入到溶液中用于标记靶细菌并提供丰富的F c区域位点,随后将P A修饰的标记免疫A u溶胶加入,构建免疫磁珠靶细菌抗体标记免疫A u溶胶“三明治”结构用于定量捕获细菌.对大肠杆菌、单核乳杆菌和伤寒杆菌分别获得了、和 细胞每毫升的检测限,理论上该方法可适用于除金黄色葡萄球菌外所有食源性致病菌的快速精准的检测.与S E R S磁免疫常用的适配体如抗体抗原相比,通过碱基互补配对形成的D NA具有更高的特异性.Z h a n g等人利用D NA的碱基互补,分别在磁珠和标记A g纳米粒子上修饰与目标D NA具有碱基互补的D NA片段,利用D NA碱基互补配对第期张晨杰:表面增强拉曼光谱磁免疫分析研究进展图S E R S磁免疫结构用于多组分D NA(a);重金属离子H g与A g的检测(b)F i g S c h e m eo fS E R S b a s e dm a g n e t i ci mm u n o s e n s o r f o rt h ed e t e c t i o no ft h r e ed i f f e r e n tt y p e so fD NA(a);H ga n dA g(b)的特异性构建“三明治”结构,利用标记免疫A g纳米粒子上的S E R S探针分子的信号来测定目标D NA的含量,该方法具有区分单碱基错配D NA链的能力.且其检测限达到 n M.N g o等人利用S E R S磁免疫“三明治”结构和D NA碱基互补配对灵敏检测恶性疟原虫的特异性D NA序列,其检测限可达 n M,且通过该方法可区分单碱基错配的野生型和突变型疟疾虫原虫的特定D NA序列.图 a为L i等人利用D NA碱基互补的原理构建“三明治”结构检测目标D NA,通过在磁珠上标记三种不同的D NA序列并在标记免疫溶胶上标记不同的D NA序列和探针分子,实现了三种不同D NA的同时检测,其检测限可达 p M.以往的磁免疫“三明治”结构一般需要磁性纳米颗粒和修饰有抗体和S E R S标记探针的贵金属纳米颗粒组成的双粒子测定方案,磁性纳米颗粒用于富集,而标记免疫贵金属纳米颗粒用作S E R S探针.Z h a n g等人将标记免疫贵金属纳米溶胶更换为标记免疫D NA,构建磁珠A u纳米粒子目标D NA标记免疫D NA“三明治”结构,实现对目标D NA的定量检测,该方法对不同的D NA可实现 n M n M的检测限,通过该种方式构建三明治结构可进一步减少测试时间及操作难度.利用D NA碱基配对还可构建“三明治”结构应用到重金属离子的检测,C u i小组基于胸腺嘧啶胸腺嘧啶错配对(T H g T)和胞嘧啶胞嘧啶错配对(C A g C)对H g和A g的特异性,在磁珠和标记溶胶上分别修饰相应的碱基对,这两个序列中的捕获片段除个T(或C)位点外是互补的(碱基片段如图 b).捕获片段之间的碱基对结合能不足以使它们完全杂交.但T T错配碱基对可光散射学报第 卷以有效捕获H g形成T H g T桥,C C错配碱基对可以只识别A g形成C A g C桥.由此构建“三明治”结构(如图 b),通过该方法可同时灵敏地检测H g和A g,其检测限分别低至 n M和n M.基于S E R S的“三明治”磁免疫分析方法已经相对成熟.从单组份到多组份检测;从简单的抗体/抗原到D NA、病毒及细菌的检测;从实验室标准样品到实际样品的迅速检测等均表明该技术在免疫分析中发挥着极其重要的作用.竞争性磁免疫小分子半抗原因其尺寸较小缺少足够的识别和结合位点,不能采用类似大分子抗原的“三明治”免疫分析法进行检测,而需采用竞争免疫分析法.所谓竞争免疫法,它是基于磁珠上的包被抗原与溶液中的待测小分子半抗原竞争抗体修饰的标记免疫溶胶的基本原理逐步发展起来的.其原理如图所示,将抗原修饰的免疫磁珠A u纳米粒子、修饰有标记分子与特异性抗体的标记免疫A u纳米粒子和目标小分子半抗原溶液混合,在溶液中免疫磁珠A u纳米粒子和游离的目标分子竞争标记免疫A u纳米粒子上抗体的结合位点,结果可能形成两种复合物:、标记免疫A u纳米粒子目标小分子半抗原;、免疫磁珠A u纳米粒子标记免疫A u纳米粒子;在施加磁场后,由于复合物没有磁性无法被磁场富集仍留在溶液中,仅复合物会被磁富集并产生S E R S信号.由于标记免疫A u纳米粒子总数一定,因此目标小分子半抗原浓度越大,被其争夺走的标记免疫A u纳米粒子数目也越多,能够与免疫磁珠A u纳米粒子作用的剩余免疫A u纳米粒子数就越少,S E R S信号越弱.因此复合物的S E R S信号强度与溶液中所含目标分子的浓度呈负相关,其S E R S强度可作为溶液中所含目标分子浓度的半定量依据.图竞争性S E R S磁免疫分析示意图 F i g S c h e m a t i cd i a g r a mo fS E R S b a s e dm a g n e t i cc o m p e t i t i v e i mm u n o a s s a y 本课题组F a n g等人运用竞争法代替“三明治”法,减少了抗原抗体的反应次数(“三明治”法中反应次数为两次),有效提高抗原与抗体的结合效率,同时引入N i纳米粒子等磁性材料提高磁富集的程度.探针分子MB A分子的S E R S信号强度随着黄曲霉素(A F B)浓度的增大而减弱.对该浓度相关的S E R S光谱图进一步分析,以MB A的谱峰 强 度 为 基 准,根 据 一 系 列A F B浓 度 下 的S E R S谱峰强度,设定空白样品所得的S E R S峰强为B,含有A F B时的S E R S峰强为B,相对强度B/B ,以A F B的对数浓度为横坐标,相对强度为纵坐标,建立了标准竞争抑制曲线,该相对强度和A F B的浓度呈现良好的负相关性,其对A F B 的检测限为 f gm L.W a n g等人也构建了竞争性S E R S磁免疫的方式检测抗病毒药物金刚烷胺(AMD).磁分离后未与捕获探针结合的游离信号探针的拉曼信号强度与目标分析物中AMD浓度呈正相关.由此实现对AMD含量的测定,其检测限达 gL,并且可应用于鸡肉、鸡蛋、牛奶等真实食品样品中AMD的分析,研究结果表明了基于S E R S的免疫分析方法具有 良 好 的 准 确 性 和 可 靠 性.与 其 他 报 道 的AMD检测方法进行对比,证明了所提出的S E R S免疫传感策略在AMD分析中具有快速、准确、敏感的 优 点,可 应 用 于AMD污 染 食 品 的 快 速 筛第期张晨杰:表面增强拉曼光谱磁免疫分析研究进展选.H u课题组利用S E R S竞争磁免疫技术对溶液中残留的小分子物质氯霉素(C A P)进行了超灵敏度检测.在溶液中,目标分子C A P半抗原将与修饰C A P B S A包被抗原的标记A u纳米粒子竞争免疫磁珠表面修饰的C A P抗体,竞争免疫反应完成后,研究者检测磁富集后的上清液中未被结合的剩余免疫A u纳米粒子,其S E R S信号随着待测物浓度呈正相 关性,其检测 限可达p gm L.W e i等人采用S E R S竞争磁免疫法检测瘦肉精克伦特罗(C L),并将该方法用于检测实际样品猪毛中C L的含量,其检测限为 f gm L.进一步研究发现通过改变C L抗体及C L包被抗原在F eOA u以及A u两种纳米粒子表面的修饰位置,分别制备了C L抗体修饰的标记免疫A u纳米粒子与C L包被抗原修饰的免疫F eOA u纳米粒子或C L包被抗原修饰的标记免疫A u纳米粒子与C L抗体修饰的免疫F eOA u纳米粒子(如图).结果表明,抗体修饰在免疫A u溶胶表面时其在低浓度克伦特罗的检测表现优,高浓度的检测不佳,后者则正好相反.(a)(b)图抗体修饰在标记A u纳米粒子上(a)和抗体修饰在磁珠上(b)的示意图及S E R S相对强度随抗原浓度的关系图 F i g S t r u c t u r a ld i a g r a ma n dS E R Ss p e c t r ao fc a l i b r a t i o nc u r v e sa s w e l la sr e l a t i o n s h i p sb e t w e e nr e l a t i v eS E R S i n t e n s i t i e s a n d c o n c e n t r a t i o n so fC Lf o rt h et w od i f f e r e n tc o n f i g u r a t i o n 竞争性S E R S磁免疫可应用于医疗诊疗中检测体液/血液中的小分子.V i l l a等人利用竞争性S E R S磁免疫用于正常生理浓度下皮质醇的测定.他们对比了磁珠和固相基底采用竞争免疫法测试皮质醇的结果 表 明 两 种 基 底 的 检 测 限 相 近,但S E R S磁免疫法不仅获得了更好的精度和更宽的线性范围,因为信号是直接从溶液中收集到的,避免了耗时的洗涤步骤.L i u等人通过竞争性S E R S磁免疫的方式测定游离的睾酮,其最低检测限为 f gm L.C h o o小组基于竞争性S E R S磁免疫用于高灵敏度的激素雌二醇(E)的定量,靶标E 和标记免疫A u溶胶与固定在磁珠表面的抗E 抗体发生竞争反应.通过磁铁吸引免疫磁复合物并对其进行S E R S检测,通过标记在免疫A u溶胶表面的探针分子的S E R S信号与E 的负相关性来测定E 标记物的含量,其检测限为 p gm L.该小组还将其应用到了实际血样中,获得了比市售的E L I S A试剂盒更高的检测灵敏度.C h o o小组进一步采用竞争S E R S磁免疫法实现了对肌酸激酶同工酶MB(C K MB)和肌钙蛋白I(c T n I)这两种典型的心脏标志物的同时定量分析检测,其检测限分别为 p gm L与 p gm L,这为急性心肌梗死的早期诊断提供了一定帮助.小分子的测定除了采用目标分子与免疫磁珠对标记免疫分子的竞争策略外,溶液中待测小分子也可与“三明治”结构中的抗原进行反应破坏“三明治”结构以此实现对特定目标物质的检测.D u小组使用“三明治”结构实现了对刀豆球蛋白A的高灵敏度S E R S磁免疫检测,检测限达到 p gm L.在葡萄糖存在下,葡萄糖和“三明治”结构竞争与刀豆球蛋白A的结合.随着葡萄糖浓度的提高,“三明治”结构被严重破坏,S E R S信号降低,从而实现了对葡萄糖的检测,其检测限达到 M.Y u a n小组利用D NA链与碳纳米管的 作用,将碳纳米管作为标记分子固定在免疫磁珠上构建准“三明治”结构.当溶液中存在H g,利用胸腺嘧啶胸腺嘧啶错配对(T H g T)来破坏D NA链与碳纳米管的 作用,使碳纳米管从磁珠上脱离,进而导致S E R S信号的衰减,由此实现H g的测定.图展示了L u等人构建的发夹结构的磁性传感器检测四环素抗性基因(t e t A)D NA片段的原理图,该发夹结构D NA序列在温度变化过程中会可逆地打开并变成线性,若溶液中存在t e t AD NA片段,则t e t AD NA将与发夹结构杂交使该结构保持线性.在此变化过程中由于探针分子C y 会远离纳米粒子表面,进而降低其S E R S信号,根据C y 的S E R S信号与目标t e t A光散射学报第 卷D NA浓度呈反向相关性,实现了目标D NA含量的测试.其检测限为p M 图发夹结构核酸序列磁性S E R S免疫测定目标基因的示意图 F i g S c h e m a t i cd i a g r a mo f t h e t a r g e tg e n e f o rm a g n e t i cS E R S i mm u n o a s s a yo f t h eh a i r p i ns t r u c t u r en u c l e i ca c i ds e q u e n c e 由上述研究可知,竞争性S E R S免疫分析法在小分子检测方面灵敏度高、特异性好,但该技术仍处于不断优化和发展中,同时该方法涉及的多组份检测及相关的非特异性吸附研究也亟待发展.S E R S磁免疫与其他技术的联用 S E R S磁免疫微流控联用S E R S磁免疫虽然相较于传统的固相免疫方法,其样品孵化时间、样品清洗及处理步骤已有所优化,但也存在无法进行连续测定、需要的样品量及试剂量较大等局限性.微流控芯片又称芯片实验室,其可在一块芯片上完成采样、稀释、添加试剂、反应、分离、检测等步骤,具有反应时间短、样品量低、试剂消耗低等特点.通过将S E R S免疫与微流控技术相结合,研究人员能够检测微量生物分子的同时大幅减少采样孵化分析时间.相比于直接将抗体锚定在微流控芯片上构建固相基底免疫方法,采用磁免疫具有更高效率,其原因是磁珠不仅具有较大的比表面积,能够偶联更多的抗体;而且基于磁珠的固定方式不影响芯片的重复使用,若撤去磁场,磁珠便可被清洗,重新施加磁场便可连续测定不同的样品.Y a p等人利用微流控芯片,采用磁珠与标记免疫溶胶构建“三明治”结构检测兔I g G蛋白,能够检测低至p gm L的兔I g G蛋白.他们发现相较于常规免疫测定,采用微流控芯片可以将测定时间从小时大幅缩短至 分钟,检测特异性也提高约 .A h i等人采用S E R S磁免疫的方法在微流控芯片上约小时内完成了h C G分子的捕获、“三明治”结构的形成和S E R S的测量,该方法与传统的L C M S、E L I S A、及分子印迹等方法具有相当的检测灵敏度,但其具有耗时短及预处理步骤简单等优点.因此,该方法可作为男性尿液样本中h C G检测的替代方法.C h o o课题组设计了一种多分支结构的微流控芯片,其可在多个通道内逐次将分析物稀释以减少样品的制备时间,同时采用“三明治”免疫分析法定 量 检 测 了 兔I g G,其 检 测 限 为 n gm L.后续该课题组继续研究,解决了微流控芯片内磁复合物清洗困难的难题,通过S E R S检测上清液中未结合的纳米粒子(如图 b),构建了S E R S强度与P S A浓度的反向相关关系,实现了 n gm L的高灵敏检测.(a)(b)图基于抗原抗体相互作用的微流体系统与S E R S相结合用于生物标志物检测的示意图:(a)对磁复合物检测;(b)对上层清液检测 F i g S c h e m a t i cd i a g r a mo fm i c r o f l u i d i cs y s t e mc o m b i n e dw i t hS E R S f o rb i o m a r k e r d e t e c t i o nb a s e do na n t i g e n a n t i b o d y i n t e r a c t i o n s:(a)D e t e c t i o no fm a g n e t i cc o m p o s i t e s;(b)D e t e c t i o no fu p p e r c l e a r l i q u i d 第期张晨杰:表面增强拉曼光谱磁免疫分析研究进展 S E R S磁免疫侧流免疫层析联用对复杂环境中多种药物的残留进行直接、方便和灵敏的监测非常重要,但极具挑战性.S E R S磁免疫具有高度的特异性,但免疫磁珠并不具有分离能力,面对多组分分析时,目前常用的方法包含:,合成不同的免疫磁珠和免疫A u溶胶,逐批次将免疫磁珠和免疫A u溶胶加入到混合样中,对多组分样品待测物逐个进行磁分离,并对其进行S E R S检测,以达到不同组分的分离及定性定量检测.本课题组C h e n等人利用免疫磁珠,通过将不同抗体修饰的免疫磁性粒子依次加入到溶液中捕获特异性抗原的方法,实现了对溶液中三组份抗原的逐次分离再进行S E R S检测,实现了对三种不同抗体抗原的分离检测.虽然通过该方法可对不同组分进行分离检测,但其操作略繁琐;,在不同的免疫磁珠或免疫A u溶胶上修饰不同的探针分子,一次性加入到多组分样品中,利用不同探针分子谱峰差异性,可一次完成多组分的定性定量检测.但该方法针对三组分甚至更多组分存在谱峰复杂,难以分辨的问题.面对这些问题,研究者提出 将 基 于S E R S的 侧 流 免 疫 层 析(L F A)即S E R S L F A.其原理如图 a,通过其与磁免疫进行进一步联用,可实现多组分的分离检测.W a n g等人将S E R S磁免疫与免疫分析试纸结合实现了集磁富集、S E R S免疫于一体的S E R S磁免疫侧流免疫层析条,用于快速、高灵敏度和定量检测两种呼吸道病毒.免疫磁珠既能对溶液中的目标病毒进行特异性识别和磁富集,又可在试纸条上形成三 明 治 结 构 以 达 到 分 离 效 果,通 过S E R S信号强度来反映待测病毒的含量,实现了对甲型H N 流感病毒和人腺病毒(HA d V)的同时检测,检出限分别为 p f um L和 p f um L,其 灵 敏 度 比 标 准 胶 体 金 试 纸 法 高 倍.L i u等人通过S E R S L F A实现全血样中血清淀粉样蛋白A(S AA)和C反应蛋白(C R P)的双通道快速S E R S检测有效鉴别病毒感染,并判断病毒感染的程度,S AA和C R P的最低检测限度达 n gm L和 n gm L.L i u等人也采用S E R S磁免疫 L F A的方法同时超灵敏地检测三种呼吸道病毒甲型流感病毒(H N)、新型冠状病毒(S A R S C o V )和呼吸道合胞病毒(R S V).基于抗原抗体反应,在测试(T)线上形成标记免疫磁珠目标病毒抗体的“三明治”结构.通过测量S E R S L F A条带三个T线上的S E R S信号来实现对H N、S A R S C o V 和R S V病毒的定量检测,其检测 灵 敏 度 是 传 统L F A条 的 倍.S h e n等人利用树莓状F eOA u磁性颗粒作为标记免疫磁珠,在免疫层析纸条上对临床血清样本中肿瘤生物标志物如前列腺特异性抗原、甲胎蛋白和癌胚抗原实现了超敏、同时和定量检测,其检测限分别为 p gm L,p gm L和 p gm L.W a n g小组后续用两种探针分子和四种抗体构建了种不同的标记免疫磁珠(示意图如图 b),将磁珠放入到实际样品中实现对目标物的捕获和富集,随后将标记免疫磁珠目标物免疫复合物重新分散在缓冲液中,加到L F A条的样品垫上.采用竞争免疫的方式在 分钟内实现了对实际样品中常用药物卡那霉素、莱克多巴胺、克伦特罗和氯霉素的同时、快速和灵敏检测,其检测限低至p gm L 水平.S E R S磁免疫与荧光复合检测当目标分子浓度较低时,S E R S磁免疫所测得的S E R S谱峰强度与目标物浓度之间存在较好的线性关系,但该方法也存在饱和浓度,并不能用于高浓度物质的检测.而在较高目标物浓度下,荧