流式细胞仪技术应用和分析专家讲座.pptx

流式细胞仪概述一、概述一、概述 流式细胞仪（流式细胞仪（FlowCytometerFlowCytometer简称简称FCMFCM）是一项集激光技术、电子物理技术、光）是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体新型高科技仪技术、单克隆抗体技术为一体新型高科技仪器。器。概括来说，流式细胞术就是对于处于概括来说，流式细胞术就是对于处于快速直线流动快速直线流动状态中状态中细胞或生物颗粒细胞或生物颗粒进行多进行多参数、快速定量分析和分选技术。参数、快速定量分析和分选技术。流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第1页流式细胞仪机型流式细胞仪机型1.1.台式机台式机 检测和分析检测和分析 B.D.:FACSCalibur;LSRII;LSRIB.D.:FACSCalibur;LSRII;LSRI2.2.大型机大型机 分选细胞分选细胞 B.D.:FACSVantage B.D.:FACSVantage；FACSAriaFACSAria Beckman Coulter:MoFlo Beckman Coulter:MoFlo（DAKODAKO）流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第2页流式细胞仪主要技术指标流式细胞仪主要技术指标 1 1 1 1流式细胞仪分析速度：流式细胞仪分析速度：流式细胞仪分析速度：流式细胞仪分析速度：普通检测普通检测普通检测普通检测10001000100010005000500050005000个细胞个细胞个细胞个细胞/秒秒秒秒,大型机可达每秒上万个大型机可达每秒上万个大型机可达每秒上万个大型机可达每秒上万个细胞。细胞。细胞。细胞。2 2 2 2荧光检测灵敏度：普通能测出单个细胞上荧光检测灵敏度：普通能测出单个细胞上荧光检测灵敏度：普通能测出单个细胞上荧光检测灵敏度：普通能测出单个细胞上600600600600个荧光分子个荧光分子个荧光分子个荧光分子,两个细胞间荧光差两个细胞间荧光差两个细胞间荧光差两个细胞间荧光差5%5%5%5%即可区分。即可区分。即可区分。即可区分。3 3 3 3前向角散射（前向角散射（前向角散射（前向角散射（FSCFSCFSCFSC）光检测灵敏度：前向角散射（）光检测灵敏度：前向角散射（）光检测灵敏度：前向角散射（）光检测灵敏度：前向角散射（FSCFSCFSCFSC）反）反）反）反应被测细胞大小应被测细胞大小应被测细胞大小应被测细胞大小,普通流式细胞仪能够测量到普通流式细胞仪能够测量到普通流式细胞仪能够测量到普通流式细胞仪能够测量到0.2m0.2m0.2m0.2m.5m.5m.5m.5m。4 4 4 4分辨率：通惯用变异系数分辨率：通惯用变异系数分辨率：通惯用变异系数分辨率：通惯用变异系数CVCVCVCV值来表示，值来表示，值来表示，值来表示，,普通流式细胞仪能普通流式细胞仪能普通流式细胞仪能普通流式细胞仪能够到达够到达够到达够到达2.0%,2.0%,2.0%,APC-cy7,alexa 647FITC,PE,PE-cy7,PE-cy5,APCAPC-cy7,alexa 647FITC,PE,PE-cy7,PE-cy5,APCAPC-cy7,alexa 647FITC,PE,PE-cy7,PE-cy5,APCAPC-cy7,alexa 647FITC,alexa488alexa488alexa488alexa488n nF/PF/PF/PF/P FITC,PerCP:2-9;APC,PE:1;FITC,PerCP:2-9;APC,PE:1;FITC,PerCP:2-9;APC,PE:1;FITC,PerCP:2-9;APC,PE:1;PE-Cy7,APC-Cy7:1,N;PE-Cy7,APC-Cy7:1,N;PE-Cy7,APC-Cy7:1,N;PE-Cy7,APC-Cy7:1,N;n n抗原密度抗原密度抗原密度抗原密度 高丰度抗原：任何荧光素；低丰度抗原：高丰度抗原：任何荧光素；低丰度抗原：高丰度抗原：任何荧光素；低丰度抗原：高丰度抗原：任何荧光素；低丰度抗原：PEPEPEPE，APCAPCAPCAPCn n染色指数染色指数染色指数染色指数n n自发荧光自发荧光自发荧光自发荧光 高：高：高：高：APCAPCAPCAPC；低：低：低：低：FITCFITCFITCFITCn n非特异形结合非特异形结合非特异形结合非特异形结合 FcR;FcR;FcR;FcR;荧光本身荧光本身荧光本身荧光本身流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第35页直接标识直接标识n n特异性信号特异性信号:弱弱n n非特异性结合非特异性结合:低低n n对照：相同荧光对照：相同荧光素标识同型对照；素标识同型对照；或者预先用抗体或者预先用抗体起源动物血清封起源动物血清封闭闭流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第36页间接标识间接标识n n特异性信号特异性信号:强强,5-6 2nd Ab/1st Ab;n n非特异性结合非特异性结合:高高n n对照：一抗起源同对照：一抗起源同型对照或血清型对照或血清二抗二抗流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第37页Avidin-Biotin method biotinylated primary Abbiotinavidinbiotinylated dye流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第38页荧光抗体搭配荧光抗体搭配n n理论上，不一样通道检测参数能够同时进理论上，不一样通道检测参数能够同时进行检测。不过假如进行行检测。不过假如进行3 3个荧光参数检测，个荧光参数检测，尽可能选择只需要调整一对参数之间赔偿尽可能选择只需要调整一对参数之间赔偿荧光。荧光。如，如，FL1+FL2+FL4;FL1+FL3+FL4;FL1+FL2+FL4;FL1+FL3+FL4;注意：注意：PE-Cy5PE-Cy5和和APCAPC不能同时检测。不能同时检测。流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第39页流式细胞仪数据显示和分析流式细胞仪数据显示和分析n n一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。1 1 1 1单参数数据显示和分析单参数数据显示和分析单参数数据显示和分析单参数数据显示和分析 一维直方图一维直方图一维直方图一维直方图 横坐标：散射光横坐标：散射光横坐标：散射光横坐标：散射光(FSC or SSC-(FSC or SSC-(FSC or SSC-(FSC or SSC-线性线性线性线性)或荧光或荧光或荧光或荧光信号信号信号信号(FL1,2,3,4-(FL1,2,3,4-(FL1,2,3,4-(FL1,2,3,4-对数对数对数对数)相对强度值；相对强度值；相对强度值；相对强度值；纵坐标：表示细胞数。纵坐标：表示细胞数。纵坐标：表示细胞数。纵坐标：表示细胞数。依据阴性对照设定适当依据阴性对照设定适当依据阴性对照设定适当依据阴性对照设定适当“门门门门”（直线门），（直线门），（直线门），（直线门），仪器计算机就会给出测定值（包含阳性细胞仪器计算机就会给出测定值（包含阳性细胞仪器计算机就会给出测定值（包含阳性细胞仪器计算机就会给出测定值（包含阳性细胞%和平和平和平和平均荧光强度）。均荧光强度）。均荧光强度）。均荧光强度）。流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第40页流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第41页2.2.2.2.双参数数据显示和分析双参数数据显示和分析双参数数据显示和分析双参数数据显示和分析 表示：一维直方图、二维点阵图、等高线图表示：一维直方图、二维点阵图、等高线图表示：一维直方图、二维点阵图、等高线图表示：一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。和密度图显示和分析。和密度图显示和分析。和密度图显示和分析。二维图：横坐标二维图：横坐标二维图：横坐标二维图：横坐标-FSC/SSC/FL1/2/3/4-FSC/SSC/FL1/2/3/4-FSC/SSC/FL1/2/3/4-FSC/SSC/FL1/2/3/4；纵坐；纵坐；纵坐；纵坐标标标标-FSC/SSC/FL1/2/3/4-FSC/SSC/FL1/2/3/4-FSC/SSC/FL1/2/3/4-FSC/SSC/FL1/2/3/4 依据阴性对照设置依据阴性对照设置依据阴性对照设置依据阴性对照设置“四方格四方格四方格四方格”标尺标尺标尺标尺,分为四个分为四个分为四个分为四个区：区：区：区：LL-LL-LL-LL-双阴性；双阴性；双阴性；双阴性；LRLRLRLR和和和和UL-UL-UL-UL-单阳性；单阳性；单阳性；单阳性；UR-UR-UR-UR-双阳性；每双阳性；每双阳性；每双阳性；每个区都能够用个区都能够用个区都能够用个区都能够用%和平均荧光强度表示。也能够设置和平均荧光强度表示。也能够设置和平均荧光强度表示。也能够设置和平均荧光强度表示。也能够设置“门门门门”。流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第42页流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第43页流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第44页3 3三参数数据显示和分析三参数数据显示和分析 用每两个数据组成一对（可组成用每两个数据组成一对（可组成6 6对对数据）数据）表示：一维直方图、二维点阵图、等表示：一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。高线图和密度图显示和分析。流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第45页数据分析数据分析n n率率率率(%gate)(%gate)(%gate)(%gate)n n平均荧光强度平均荧光强度平均荧光强度平均荧光强度 算数平均荧光强度算数平均荧光强度算数平均荧光强度算数平均荧光强度(mean fluoresence intensity,MFI)(mean fluoresence intensity,MFI)(mean fluoresence intensity,MFI)(mean fluoresence intensity,MFI)MFI=(x1+x2+x3.+xn)/n MFI=(x1+x2+x3.+xn)/n MFI=(x1+x2+x3.+xn)/n MFI=(x1+x2+x3.+xn)/n 正态分布数据使用正态分布数据使用正态分布数据使用正态分布数据使用 几何平均荧光强度几何平均荧光强度几何平均荧光强度几何平均荧光强度(geomean fluoresence intensity,(geomean fluoresence intensity,(geomean fluoresence intensity,(geomean fluoresence intensity,GMFI)GMFI)GMFI)GMFI)GMFI=(x1*x2*x3.*xn)nth root.GMFI=(x1*x2*x3.*xn)nth root.GMFI=(x1*x2*x3.*xn)nth root.GMFI=(x1*x2*x3.*xn)nth root.经对数转换后呈正态分布经对数转换后呈正态分布经对数转换后呈正态分布经对数转换后呈正态分布 举例：有五个细胞，其荧光强度分别为举例：有五个细胞，其荧光强度分别为举例：有五个细胞，其荧光强度分别为举例：有五个细胞，其荧光强度分别为1,100,100,1,100,100,1,100,100,1,100,100,100,10000100,10000100,10000100,10000 MFI=1+100*3+10000/5=2060 MFI=1+100*3+10000/5=2060 MFI=1+100*3+10000/5=2060 MFI=1+100*3+10000/5=2060 GMFI=(1*1003*10000)GMFI=(1*1003*10000)GMFI=(1*1003*10000)GMFI=(1*1003*10000)1/51/51/51/5=100=100=100=100 中位数中位数中位数中位数(median)=100(median)=100(median)=100(median)=100 变异系数变异系数变异系数变异系数（CVCVCVCV）=100=100=100=100流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第46页率和平均荧光强度应用率和平均荧光强度应用n n普通说来，普通说来，%和和MFI/GMFIMFI/GMFI都能够用来表示所都能够用来表示所关注细胞群体某个参数度量。有时候关注细胞群体某个参数度量。有时候%没有没有改变，不过改变，不过MFI/GMFIMFI/GMFI有改变。有改变。流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第47页流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第48页流式细胞仪应用流式细胞仪应用n n细胞周期检测细胞周期检测细胞周期检测细胞周期检测 细胞周期：细胞周期：细胞周期：细胞周期：G1G1G1G1期、期、期、期、S S S S期、期、期、期、G2G2G2G2期和期和期和期和M M M M期。期。期。期。各期细胞各期细胞各期细胞各期细胞DNADNADNADNA含量以下：含量以下：含量以下：含量以下：G1(M1)=2C G1(M1)=2C G1(M1)=2C G1(M1)=2C；G2G2G2G2和和和和M(M2)=4CM(M2)=4CM(M2)=4CM(M2)=4C；S(M3)=2C-4CS(M3)=2C-4CS(M3)=2C-4CS(M3)=2C-4C。正常细胞：各周期时相细胞数百分比是恒定；正常细胞：各周期时相细胞数百分比是恒定；正常细胞：各周期时相细胞数百分比是恒定；正常细胞：各周期时相细胞数百分比是恒定；恶性病变：各周期时相细胞数百分比是非均一。恶性病变：各周期时相细胞数百分比是非均一。恶性病变：各周期时相细胞数百分比是非均一。恶性病变：各周期时相细胞数百分比是非均一。总倾向是：异倍体百分比升高；异倍体肿瘤恶性程总倾向是：异倍体百分比升高；异倍体肿瘤恶性程总倾向是：异倍体百分比升高；异倍体肿瘤恶性程总倾向是：异倍体百分比升高；异倍体肿瘤恶性程度高、复发率高、转移率高及死亡率高；二倍体及度高、复发率高、转移率高及死亡率高；二倍体及度高、复发率高、转移率高及死亡率高；二倍体及度高、复发率高、转移率高及死亡率高；二倍体及近二倍体肿瘤预后很好。近二倍体肿瘤预后很好。近二倍体肿瘤预后很好。近二倍体肿瘤预后很好。流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第49页流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第50页DNADNADNADNA指数：表示指数：表示指数：表示指数：表示DNADNADNADNA含量异常程度。含量异常程度。含量异常程度。含量异常程度。标准二倍体细胞：普通样品应采取同种或同个体正常细胞。标准二倍体细胞：普通样品应采取同种或同个体正常细胞。标准二倍体细胞：普通样品应采取同种或同个体正常细胞。标准二倍体细胞：普通样品应采取同种或同个体正常细胞。血液学研究中通常以正常人外周血淋巴细胞作为标准二倍体血液学研究中通常以正常人外周血淋巴细胞作为标准二倍体血液学研究中通常以正常人外周血淋巴细胞作为标准二倍体血液学研究中通常以正常人外周血淋巴细胞作为标准二倍体细胞。细胞。细胞。细胞。需要指出是，在汇报需要指出是，在汇报需要指出是，在汇报需要指出是，在汇报DNADNADNADNA测定结果时必需包含测定结果时必需包含测定结果时必需包含测定结果时必需包含G0/G1G0/G1G0/G1G0/G1峰变异系峰变异系峰变异系峰变异系数，即数，即数，即数，即C.VC.VC.VC.V值，若有多个值，若有多个值，若有多个值，若有多个DNADNADNADNA干系则要给出各个干系则要给出各个干系则要给出各个干系则要给出各个G0/G1G0/G1G0/G1G0/G1峰峰峰峰C.VC.VC.VC.V值。值。值。值。用于肿瘤临床诊疗总体依据是：用于肿瘤临床诊疗总体依据是：用于肿瘤临床诊疗总体依据是：用于肿瘤临床诊疗总体依据是：a.a.a.a.正常二倍体正常二倍体正常二倍体正常二倍体DI=1.0DI=1.0DI=1.0DI=1.0，判断为阴性；，判断为阴性；，判断为阴性；，判断为阴性；b.b.b.b.出现二个或多个能够分辨出现二个或多个能够分辨出现二个或多个能够分辨出现二个或多个能够分辨G0/G1G0/G1G0/G1G0/G1峰则可判断为阳性；峰则可判断为阳性；峰则可判断为阳性；峰则可判断为阳性；c.c.c.c.虽无显著虽无显著虽无显著虽无显著G0/G1G0/G1G0/G1G0/G1峰分化现象，但峰峰分化现象，但峰峰分化现象，但峰峰分化现象，但峰C.VC.VC.VC.V值较大，则可依据值较大，则可依据值较大，则可依据值较大，则可依据DIDIDIDI数个及其它有判别意义征状给出参考性诊疗。数个及其它有判别意义征状给出参考性诊疗。数个及其它有判别意义征状给出参考性诊疗。数个及其它有判别意义征状给出参考性诊疗。流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第51页应用范围：应用范围：应用范围：应用范围：1.1.临床肿瘤：测试肿瘤细胞对药品敏感性；临床肿瘤：测试肿瘤细胞对药品敏感性；2.2.临床微生物：对细菌临床微生物：对细菌DNADNA和和RNARNA含量进行测含量进行测量，进行微生物判定、医学常规中细菌抗量，进行微生物判定、医学常规中细菌抗生素敏感试验和传染活性测定。生素敏感试验和传染活性测定。凋亡检测：出现亚凋亡峰。凋亡检测：出现亚凋亡峰。流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第52页n n免疫表型分析免疫表型分析免疫表型分析免疫表型分析1.1.1.1.对外周血或免疫器官中白细胞免疫荧光分析对外周血或免疫器官中白细胞免疫荧光分析对外周血或免疫器官中白细胞免疫荧光分析对外周血或免疫器官中白细胞免疫荧光分析 依据细胞表面分化抗原能够进行：依据细胞表面分化抗原能够进行：依据细胞表面分化抗原能够进行：依据细胞表面分化抗原能够进行：亚群判定亚群判定亚群判定亚群判定：CD3+CD4+/CD3+CD8+T;CD19+B;CD56+CD16+NK;CD3+CD4+/CD3+CD8+T;CD19+B;CD56+CD16+NK;CD3+CD4+/CD3+CD8+T;CD19+B;CD56+CD16+NK;CD3+CD4+/CD3+CD8+T;CD19+B;CD56+CD16+NK;CD14+Mo;CD34+HSC,CD11c+HLA-DR+DC;CD123+BDCA2+pDC;CD14+Mo;CD34+HSC,CD11c+HLA-DR+DC;CD123+BDCA2+pDC;CD14+Mo;CD34+HSC,CD11c+HLA-DR+DC;CD123+BDCA2+pDC;CD14+Mo;CD34+HSC,CD11c+HLA-DR+DC;CD123+BDCA2+pDC;etc.etc.etc.etc.特定亚群绝对数和百分比检测特定亚群绝对数和百分比检测特定亚群绝对数和百分比检测特定亚群绝对数和百分比检测：AIDs AIDs AIDs AIDs：CD4+T/CD8+TCD4+T/CD8+TCD4+T/CD8+TCD4+T/CD8+T降低：降低：降低：降低：CD4+TCD4+TCD4+TCD4+T细胞绝对数降低细胞绝对数降低细胞绝对数降低细胞绝对数降低 SLESLESLESLE：粒细胞和淋巴细胞绝对数降低；：粒细胞和淋巴细胞绝对数降低；：粒细胞和淋巴细胞绝对数降低；：粒细胞和淋巴细胞绝对数降低；特定亚群一些分子表示改变特定亚群一些分子表示改变特定亚群一些分子表示改变特定亚群一些分子表示改变：CD3+CD4+T CD3+CD4+T CD3+CD4+T CD3+CD4+T细胞表示细胞表示细胞表示细胞表示CD25CD25CD25CD25水平；表示水平；表示水平；表示水平；表示CCR7CCR7CCR7CCR7水平水平水平水平 寻找新亚群寻找新亚群寻找新亚群寻找新亚群：FoxP3+Treg;CD11b+Gr1+MSC;NK1.1+NK;FoxP3+Treg;CD11b+Gr1+MSC;NK1.1+NK;FoxP3+Treg;CD11b+Gr1+MSC;NK1.1+NK;FoxP3+Treg;CD11b+Gr1+MSC;NK1.1+NK;信号分子表示和活化信号分子表示和活化信号分子表示和活化信号分子表示和活化：CpGCpGCpGCpG刺激刺激刺激刺激PBMCsPBMCsPBMCsPBMCs后，后，后，后，CD123+BDCA2+pDCCD123+BDCA2+pDCCD123+BDCA2+pDCCD123+BDCA2+pDC 中中中中p-P38p-P38p-P38p-P38表示；表示；表示；表示；细胞因子分泌细胞因子分泌细胞因子分泌细胞因子分泌：anti-CD3+anti-CD28anti-CD3+anti-CD28anti-CD3+anti-CD28anti-CD3+anti-CD28刺激刺激刺激刺激PBMCsPBMCsPBMCsPBMCs后，后，后，后，CD3+CD4+TCD3+CD4+TCD3+CD4+TCD3+CD4+T细胞分泌细胞分泌细胞分泌细胞分泌IFN-IFN-IFN-IFN-水平水平水平水平流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第53页信号分子表示和活化信号分子表示和活化 Western Blot:Western Blot:只能检测整体细胞表示只能检测整体细胞表示情况，不能够区分是那个亚群表示情况；情况，不能够区分是那个亚群表示情况；而且而且WBWB检测需要一定数量细胞，少许细胞检测需要一定数量细胞，少许细胞有可能检测不出来。有可能检测不出来。细胞因子表示：细胞因子表示：ELISAELISA只能检测上清中分泌，一样不能只能检测上清中分泌，一样不能够区分是那个亚群分泌；假如样品量少只够区分是那个亚群分泌；假如样品量少只能检测一个细胞因子。能检测一个细胞因子。流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第54页流式细胞术检测信号分子活化流式细胞术检测信号分子活化流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第55页流式细胞术检测细胞因子分泌流式细胞术检测细胞因子分泌流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第56页流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第57页n n白血病白血病/淋巴瘤免疫分型；淋巴瘤免疫分型；判断起源：髓系判断起源：髓系判断起源：髓系判断起源：髓系/淋巴系淋巴系淋巴系淋巴系;T;T;T;T系系系系/B/B/B/B系系系系 判断分期：判断分期：判断分期：判断分期：判断预后：判断预后：判断预后：判断预后：比如：比如：比如：比如：CALLACALLACALLACALLA仅存在于仅存在于仅存在于仅存在于B B B B细胞正常发育期前细胞正常发育期前细胞正常发育期前细胞正常发育期前B B B B细胞、细胞、细胞、细胞、早期早期早期早期B B B B细胞以及细胞以及细胞以及细胞以及80%80%80%80%90%90%90%90%急性淋巴细胞性白血病。急性淋巴细胞性白血病。急性淋巴细胞性白血病。急性淋巴细胞性白血病。所以，检测所以，检测所以，检测所以，检测CALLACALLACALLACALLA表示情况能够区分淋巴细胞性和表示情况能够区分淋巴细胞性和表示情况能够区分淋巴细胞性和表示情况能够区分淋巴细胞性和髓性白血病。用髓性白血病。用髓性白血病。用髓性白血病。用CALLACALLACALLACALLA结合其它一些成熟结合其它一些成熟结合其它一些成熟结合其它一些成熟B B B B细胞表细胞表细胞表细胞表面标志，如面标志，如面标志，如面标志，如CD19CD19CD19CD19，CD20CD20CD20CD20，CD24CD24CD24CD24（B4B4B4B4，B1B1B1B1，BA-1BA-1BA-1BA-1）将能证实大部分将能证实大部分将能证实大部分将能证实大部分B B B B细胞起源肿瘤。细胞起源肿瘤。细胞起源肿瘤。细胞起源肿瘤。流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第58页nHLAHLA组织配型及组织配型及HLAHLA与一些疾病关系；与一些疾病关系；HLA-B27HLA-B27检测：强制性脊柱炎检测：强制性脊柱炎 移植：移植：HLAHLA配型配型n干祖细胞定量及成份分析；干祖细胞定量及成份分析；流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第59页n n定量分析定量分析定量分析定量分析 免疫球蛋白类型和量：血清中免疫球蛋白类型和量：血清中免疫球蛋白类型和量：血清中免疫球蛋白类型和量：血清中IgM;IgG1,IgM;IgG1,IgM;IgG1,IgM;IgG1,IgG2a,IgG2b;IgG3;IgEIgG2a,IgG2b;IgG3;IgEIgG2a,IgG2b;IgG3;IgEIgG2a,IgG2b;IgG3;IgE等。等。等。等。细胞因子分泌：血清或培养上清细胞因子分泌：血清或培养上清细胞因子分泌：血清或培养上清细胞因子分泌：血清或培养上清 CBA flex set(BD):CBA flex set(BD):CBA flex set(BD):CBA flex set(BD):能够同时检测少许上清能够同时检测少许上清能够同时检测少许上清能够同时检测少许上清中中中中各种细胞因子各种细胞因子各种细胞因子各种细胞因子/趋化因子趋化因子趋化因子趋化因子/免疫球蛋白类型和亚类免疫球蛋白类型和亚类免疫球蛋白类型和亚类免疫球蛋白类型和亚类/信号分子信号分子信号分子信号分子表示和定量。表示和定量。表示和定量。表示和定量。n n细胞功效分析细胞功效分析细胞功效分析细胞功效分析 如：吞噬功效如：吞噬功效如：吞噬功效如：吞噬功效-采取荧光标识大分子（糖类采取荧光标识大分子（糖类采取荧光标识大分子（糖类采取荧光标识大分子（糖类-dextran;dextran;dextran;dextran;蛋白蛋白蛋白蛋白-OVA-OVA-OVA-OVA）；细胞增殖水平）；细胞增殖水平）；细胞增殖水平）；细胞增殖水平-CFSE-CFSE-CFSE-CFSEn n细胞凋亡研究细胞凋亡研究细胞凋亡研究细胞凋亡研究 AnnexinV/PIAnnexinV/PIAnnexinV/PIAnnexinV/PI 细胞周期细胞周期细胞周期细胞周期流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第60页FACSArray FACSLSRII FACSCaliburRed/NIR APC/APC-Cy7FL4/FL3YellowPEFL2 Parameters reporter流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第61页n n定量分析定量分析定量分析定量分析 免疫球蛋白类型和量：血清中免疫球蛋白类型和量：血清中免疫球蛋白类型和量：血清中免疫球蛋白类型和量：血清中IgM;IgG1,IgM;IgG1,IgM;IgG1,IgM;IgG1,IgG2a,IgG2b;IgG3;IgEIgG2a,IgG2b;IgG3;IgEIgG2a,IgG2b;IgG3;IgEIgG2a,IgG2b;IgG3;IgE等。等。等。等。细胞因子分泌：血清或培养上清细胞因子分泌：血清或培养上清细胞因子分泌：血清或培养上清细胞因子分泌：血清或培养上清 CBA flex set(BD):CBA flex set(BD):CBA flex set(BD):CBA flex set(BD):能够同时检测少许上清能够同时检测少许上清能够同时检测少许上清能够同时检测少许上清中各种细胞因子中各种细胞因子中各种细胞因子中各种细胞因子/趋化因子趋化因子趋化因子趋化因子/免疫球蛋白类型和亚类免疫球蛋白类型和亚类免疫球蛋白类型和亚类免疫球蛋白类型和亚类/信号分子表示和定量。信号分子表示和定量。信号分子表示和定量。信号分子表示和定量。n n细胞功效分析细胞功效分析细胞功效分析细胞功效分析 如：吞噬功效如：吞噬功效如：吞噬功效如：吞噬功效-采取荧光标识大分子（糖类采取荧光标识大分子（糖类采取荧光标识大分子（糖类采取荧光标识大分子（糖类-dextran;dextran;dextran;dextran;蛋白蛋白蛋白蛋白-OVA-OVA-OVA-OVA）；细胞增殖水平）；细胞增殖水平）；细胞增殖水平）；细胞增殖水平-CFSE-CFSE-CFSE-CFSEn n细胞凋亡研究细胞凋亡研究细胞凋亡研究细胞凋亡研究 AnnexinV/PI,R123AnnexinV/PI,R123AnnexinV/PI,R123AnnexinV/PI,R123 细胞周期细胞周期细胞周期细胞周期流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第62页吞噬功效检测吞噬功效检测-不一样亚群和不一样功效状态不一样亚群和不一样功效状态DCDC吞噬吞噬OVAOVA水水平平流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第63页增殖功效检测增殖功效检测-不一样亚群和不一样功效状态不一样亚群和不一样功效状态DCDC诱导诱导T T细胞增细胞增殖殖流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第64页n n定量分析定量分析定量分析定量分析 免疫球蛋白类型和量：血清中免疫球蛋白类型和量：血清中免疫球蛋白类型和量：血清中免疫球蛋白类型和量：血清中IgM;IgG1,IgM;IgG1,IgM;IgG1,IgM;IgG1,IgG2a,IgG2b;IgG3;IgEIgG2a,IgG2b;IgG3;IgEIgG2a,IgG2b;IgG3;IgEIgG2a,IgG2b;IgG3;IgE等。等。等。等。细胞因子分泌：血清或培养上清细胞因子分泌：血清或培养上清细胞因子分泌：血清或培养上清细胞因子分泌：血清或培养上清 CBA flex set(BD):CBA flex set(BD):CBA flex set(BD):CBA flex set(BD):能够同时检测少许上清能够同时检测少许上清能够同时检测少许上清能够同时检测少许上清中各种细胞因子中各种细胞因子中各种细胞因子中各种细胞因子/趋化因子趋化因子趋化因子趋化因子/免疫球蛋白类型和亚类免疫球蛋白类型和亚类免疫球蛋白类型和亚类免疫球蛋白类型和亚类/信号分子表示和定量。信号分子表示和定量。信号分子表示和定量。信号分子表示和定量。n n细胞功效分析细胞功效分析细胞功效分析细胞功效分析 如：吞噬功效如：吞噬功效如：吞噬功效如：吞噬功效-采取荧光标识大分子（糖类采取荧光标识大分子（糖类采取荧光标识大分子（糖类采取荧光标识大分子（糖类-dextran;dextran;dextran;dextran;蛋白蛋白蛋白蛋白-OVA-OVA-OVA-OVA）；细胞增殖水平）；细胞增殖水平）；细胞增殖水平）；细胞增殖水平-CFSE-CFSE-CFSE-CFSEn n细胞凋亡研究细胞凋亡研究细胞凋亡研究细胞凋亡研究 AnnexinV/PIAnnexinV/PIAnnexinV/PIAnnexinV/PI；R123R123R123R123 细胞周期细胞周期细胞周期细胞周期流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第65页FASFAS信号诱导信号诱导DCDC凋亡情况凋亡情况流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第66页NKNK细胞杀伤靶细胞细胞杀伤靶细胞流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第67页n n样品起源：样品起源：全血；骨髓；脾脏；淋巴结；扁桃体；肝全血；骨髓；脾脏；淋巴结；扁桃体；肝脏；肺脏；等脏；肺脏；等n n样品制备：样品制备：全血和脾脏样品有时需要去除红细胞；全血和脾脏样品有时需要去除红细胞；实体器官有时需要去除组织细胞。实体器官有时需要去除组织细胞。新鲜样品（新鲜样品（2-42-4小时内检测）和固定样品小时内检测）和固定样品(1W(1W内检测）内检测）样品处理样品处理流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第68页染色步骤中影响原因：染色步骤中影响原因：染色步骤中影响原因：染色步骤中影响原因：n n细胞数细胞数细胞数细胞数n n试剂浓度滴定试剂浓度滴定试剂浓度滴定试剂浓度滴定(1*10(1*10(1*10(1*106 6 6 6/ml-20/ml-20/ml-20/ml-20ulululul)n nFcFcFcFc受体封闭受体封闭受体封闭受体封闭(抗体起源动物血清封闭；同型对照抗体起源动物血清封闭；同型对照抗体起源动物血清封闭；同型对照抗体起源动物血清封闭；同型对照）n n反应体积反应体积反应体积反应体积n n反应温度（反应温度（反应温度（反应温度（RT-15RT-15RT-15RT-15；4 4 4 4 C C C C30-6030-6030-6030-60）n n反应时间反应时间反应时间反应时间n npHpHpHpH值值值值n n洗涤洗涤洗涤洗涤及固定及固定及固定及固定染色过程中各种对照设定染色过程中各种对照设定染色过程中各种对照设定染色过程中各种对照设定n n阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照n n同型对照（阴性对照）同型对照（阴性对照）同型对照（阴性对照）同型对照（阴性对照）n n自发荧光对照（空白对照）自发荧光对照（空白对照）自发荧光对照（空白对照）自发荧光对照（空白对照）n n阳性对照阳性对照阳性对照阳性对照n n阳性试剂对照阳性试剂对照阳性试剂对照阳性试剂对照n n阳性方法学对照阳性方法学对照阳性方法学对照阳性方法学对照n n标准品标准品标准品标准品流式细胞仪技术应用和分析专家讲座第69页