分子生物学基因治疗专家讲座.pptx

基因治疗基因治疗Gene Therapy分子生物学基因治疗第1页一、概念一、概念经典基因治疗经典基因治疗：指正常基因整合入细胞指正常基因整合入细胞基因组以校正或置换致病基因一个治疗基因组以校正或置换致病基因一个治疗方法。方法。广义基因治疗广义基因治疗：将某种遗传物质转移到将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以患者细胞内，使其在体内发挥作用，以到达治疗疾病目标方法。到达治疗疾病目标方法。分子生物学基因治疗第2页1.基因治疗分类基因治疗分类体细胞体细胞(somatic cell)(somatic cell)基因治疗基因治疗生殖细胞生殖细胞(germline)(germline)基基因治疗因治疗v只限于某一体细胞基只限于某一体细胞基因改变因改变v只限于某个体当代只限于某个体当代v对缺点生殖细胞进行对缺点生殖细胞进行矫正矫正v当代及子代当代及子代分子生物学基因治疗第3页1990年年9月月14日：第一例正式同意基因治疗试日：第一例正式同意基因治疗试验开始进行验开始进行（美国美国，世界上开展基因治疗最早国家），世界上开展基因治疗最早国家）大规模进行基因治疗临床试验必须经历以下阶大规模进行基因治疗临床试验必须经历以下阶段：段：体外试验和动物试验体外试验和动物试验I期临床试验期临床试验6-10名志愿者名志愿者II期临床试验期临床试验20-30名志愿者名志愿者III期临床试验期临床试验充分分析疗效、安全性充分分析疗效、安全性中国：中国：1991年年7月开始进行基因治疗试验月开始进行基因治疗试验2.基因治疗发展简史基因治疗发展简史分子生物学基因治疗第4页 世世界界上上第第一一个个正正式式被被同同意意用用于于基基因因治治疗疗病病例例是是先先天天性性腺腺苷苷脱脱氨氨酶酶（ADAADA）缺缺乏症乏症。19901990年年9 9月月美美国国BlaeseBlaese博博士士成成功功地地将将正正常常人人ADAADA基基因因植植入入ADAADA缺缺乏乏症症病病人人淋淋巴巴结内，完成世界上首例基因治疗试验。结内，完成世界上首例基因治疗试验。分子生物学基因治疗第5页腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶(ADA)(ADA)缺乏缺乏严重联合免疫缺点严重联合免疫缺点(SCID)(SCID)病因:淋巴细胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆积破坏免疫功效患儿极少活到成年n第一个基因临床治疗方案(1990.9.14,NIH)n治疗策略：n淋巴细胞ADA酶 恢复至正常水平 5%-10%维持免疫系统功效 改进病人症状分子生物学基因治疗第6页治疗基本步骤治疗基本步骤:ADA基因基因+逆转录病毒载体逆转录病毒载体导入患者导入患者淋巴细胞淋巴细胞体外扩增体外扩增回输回输病人体内病人体内淋巴细胞淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平酶恢复至正常水平5%-10%维持免疫系统功效维持免疫系统功效,改进病人症状改进病人症状分子生物学基因治疗第7页 一、基因治疗策略一、基因治疗策略The Strategy of Gene Therapy分子生物学基因治疗第8页 （一）基因置换（一）基因置换（gene replacementgene replacement）定义：定义：指将特定目标基因导入特定细胞，经过指将特定目标基因导入特定细胞，经过定位重组，以导入正常基因定位重组，以导入正常基因置换基因组内原有缺点置换基因组内原有缺点基因基因。目标目标：将缺点基因异常序列进行矫正将缺点基因异常序列进行矫正。对缺点基因缺点部位进行准确原位修复，不对缺点基因缺点部位进行准确原位修复，不包括基因组任何改变。包括基因组任何改变。分子生物学基因治疗第9页又称为又称为基因打靶基因打靶(genetargeting）定定点点整整合合条条件件:转转导导基基因因载载体体与与染染色色体体上上DNA含含有有相相同同序序列列。带带有有目目标标基基因因载载体体就就能能找找到到同同源源重重组组位位点点，进进行行部部分分基基因因序序列列交交换换，使使基基因因置置换换这这一一治治疗疗策策略略得得以以实实现。现。基因同源重组技术基因同源重组技术分子生物学基因治疗第10页要要实实现现基基因因置置换换，需需要要采采取取同同源源重重组组技技术术使使对对应应正正常常基基因因定定向向导导入入受受体体细细胞胞基基因缺点部位。因缺点部位。n定定向向导导入入发发生生率率约约1/1001/100万万，采采取取胚胚胎胎干干细细胞胞培培养养方方法法，这这种种同同源源重重组组检检出出率率最高可达最高可达1/101/10。分子生物学基因治疗第11页基因置换必要条件：基因置换必要条件：1、对导入基因及其产物有详尽了解、对导入基因及其产物有详尽了解2、外来基因能有效地导入靶细胞、外来基因能有效地导入靶细胞3、导入基因能在靶细胞中长久稳定存在、导入基因能在靶细胞中长久稳定存在4、导入基因能有适度水平表示、导入基因能有适度水平表示5、基因导入方法及所用载体对宿主细胞安全无、基因导入方法及所用载体对宿主细胞安全无害害分子生物学基因治疗第12页（二）（二）基因添加基因添加 基因添加基因添加或称或称基因增补基因增补（gene augmentationgene augmentation）:经过导入外源基因经过导入外源基因使靶细胞表示其本身不表示基使靶细胞表示其本身不表示基因。因。类型类型:n在在有有缺缺点点基基因因细细胞胞中中导导入入对对应应正正常常基基因因，而而细细胞胞内内缺缺点点基基因因并并未未除除去去，经经过过导导入入正正常常基基因因表表示产物，赔偿缺点基因功效；示产物，赔偿缺点基因功效；n向向靶靶细细胞胞中中导导入入靶靶细细胞胞原原来来不不表表示示基基因因，利利用用其表示产物到达治疗疾病目标。其表示产物到达治疗疾病目标。分子生物学基因治疗第13页基因干预基因干预(gene interferencegene interference)指采取特定方式抑制某个基因表示，或者指采取特定方式抑制某个基因表示，或者经过破坏某个基因而使之不表示，以到达治疗经过破坏某个基因而使之不表示，以到达治疗疾病目标。疾病目标。1.反义核酸反义核酸：封闭基因表示封闭基因表示2.核酶：核酶：裂解特异靶裂解特异靶mRNA3.RNA干涉技术：干涉技术：（三）基因干预（三）基因干预分子生物学基因治疗第14页（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗自自杀杀基基因因治治疗疗:恶恶性性肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗主主要要方法之一。方法之一。原原理理:将将“自自杀杀”基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中，这这种种基基因因编编码码酶酶能能使使无无毒毒性性药药品品前前体体转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自自杀杀”效效应应，从从而而到到达达去去除除肿肿瘤瘤细细胞胞目标。目标。分子生物学基因治疗第15页自杀基因作用机制 分子生物学基因治疗第16页1.1.自杀基因系统自杀基因系统TK/GCVTK/GCV 单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（herps simplex virus,herps simplex virus,HSVHSV）型胸苷激酶型胸苷激酶（thymidine kinase,thymidine kinase,tktk）基）基因编码胸苷激酶，因编码胸苷激酶，胸苷激酶胸苷激酶特异性地将无毒核苷类似物特异性地将无毒核苷类似物丙氧鸟苷丙氧鸟苷（ganciclovir,ganciclovir,GCVGCV）转变成）转变成毒性毒性GCVGCV三磷酸核苷三磷酸核苷，后者能抑制后者能抑制DNADNA聚合酶活性，造成细胞死亡。聚合酶活性，造成细胞死亡。分子生物学基因治疗第17页CD/5-FC CD/5-FC 大肠杆菌大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶胞嘧啶脱氨酶（cytosine cytosine deaminase,deaminase,CDCD）基因，）基因，胞嘧啶脱氨酶胞嘧啶脱氨酶在细胞内将无毒性在细胞内将无毒性5-5-氟胞嘧啶氟胞嘧啶（5-FC5-FC）转变成毒性产物）转变成毒性产物5-5-氟尿嘧啶（氟尿嘧啶（5-FU5-FU）。）。5-5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶经过竞争性抑制经过竞争性抑制胸苷酸合酶胸苷酸合酶活性，活性，从而从而抑制脱氧胸苷三磷酸抑制脱氧胸苷三磷酸合成。合成。分子生物学基因治疗第18页 旁旁观观者者效效应应:“自自杀杀基基因因”治治疗疗不不但但使使转转导导了了“自自杀杀基基因因”肿肿瘤瘤细细胞胞在在用用药药后后被被杀杀死死，而而且且与与其其相相邻邻未未转转导导“自自杀杀基基因因”肿肿瘤瘤细细胞胞也也被被杀死。杀死。2.2.旁观者效应旁观者效应分子生物学基因治疗第19页（五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗 经过将抗癌免疫增强细胞因子或经过将抗癌免疫增强细胞因子或MHCMHC基因基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中抗癌免导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中抗癌免疫反应。疫反应。分子生物学基因治疗第20页二、基因治疗必要条件二、基因治疗必要条件1.发病机制在发病机制在DNA水平上已经清楚；水平上已经清楚；2.要转移基因已经克隆分离，其表示产物要转移基因已经克隆分离，其表示产物有详尽了解；有详尽了解；3.该基因正常表示组织可在体外进行遗传该基因正常表示组织可在体外进行遗传操作；操作；分子生物学基因治疗第21页1.外源基因可有效导入靶细胞外源基因可有效导入靶细胞2.外源基因能在靶细胞中长久稳定存留外源基因能在靶细胞中长久稳定存留3.导入基因能适量表示导入基因能适量表示4.导入基因方法及载体对宿主细胞安全无导入基因方法及载体对宿主细胞安全无害害理想基因治疗还必须：理想基因治疗还必须：分子生物学基因治疗第22页二、基因转移技术二、基因转移技术The Technique of Gene Transfer分子生物学基因治疗第23页基因治疗路径基因治疗路径1、间接体内治疗路径（、间接体内治疗路径（exvivo)是先从患者体内取出某一器官组织细胞，体外是先从患者体内取出某一器官组织细胞，体外扩增后，将目标基因转入靶细胞形成表示外源扩增后，将目标基因转入靶细胞形成表示外源基因遗传修饰细胞，选择高表示细胞扩增培养，基因遗传修饰细胞，选择高表示细胞扩增培养，以一定数量移植患者体内。（安全、易控制但以一定数量移植患者体内。（安全、易控制但操作复杂）操作复杂）2 2、直接体内治疗路径（、直接体内治疗路径（in vivoin vivo）将目标基因体内直接转移到靶细胞，所用载体将目标基因体内直接转移到靶细胞，所用载体必须含有特异导向性和转移效率。（操作简单必须含有特异导向性和转移效率。（操作简单但疗效短、免疫排斥等）但疗效短、免疫排斥等）分子生物学基因治疗第24页基因治疗两种路径基因治疗两种路径载体载体目标基因目标基因in vivoex vivo靶细胞分子生物学基因治疗第25页 基因转移基因转移(gene transfer)(gene transfer)技术：技术：1.1.病毒介导基因转移系统。病毒介导基因转移系统。2.2.非病毒介导基因转移系统非病毒介导基因转移系统。分子生物学基因治疗第26页 1.1.病毒介导基因转移系统病毒介导基因转移系统 病毒载体病毒载体介导基因转移效率较高，介导基因转移效率较高，所以它也是使用最多基因治疗载体。据所以它也是使用最多基因治疗载体。据统计，有统计，有72%72%临床试验计划和临床试验计划和71%71%病例使病例使用了病毒载体，其中用得最多是用了病毒载体，其中用得最多是逆转录逆转录病毒载体病毒载体。分子生物学基因治疗第27页含有包膜，圆球状，直径为含有包膜，圆球状，直径为8080 120nm120nm基因组是基因组是单正链单正链RNARNA，3.53.5 9.0kb9.0kb病毒颗粒中有病毒颗粒中有逆转录酶逆转录酶能整合于宿主细胞染色体能整合于宿主细胞染色体 （1 1）逆转录病毒）逆转录病毒（Retroviruses）分子生物学基因治疗第28页逆转录病毒颗粒结构逆转录病毒颗粒结构分子生物学基因治疗第29页RNA逆转录酶逆转录酶衣壳蛋白衣壳蛋白基质蛋白基质蛋白包膜包膜gp120gp41分子生物学基因治疗第30页ReversetranscriptionIntegrationTranscriptionPackagingLifecycleofretrovirus分子生物学基因治疗第31页分子生物学基因治疗第32页逆转录病毒逆转录病毒整合入宿主整合入宿主DNADNA中分子机制，其本质是中分子机制，其本质是转座转座分子生物学基因治疗第33页LTR(long-terminalrepeat):长末端重复序列长末端重复序列Provirus(原病毒原病毒):被被整合整合到细胞基因组中逆转到细胞基因组中逆转录病毒序列录病毒序列分子生物学基因治疗第34页3 forms分子生物学基因治疗第35页Two fates of RNA:Translation:作为作为mRNAmRNA翻译成病毒蛋白质翻译成病毒蛋白质Packaging：作为病毒作为病毒RNARNA基因组被装配成新病基因组被装配成新病毒颗粒毒颗粒分子生物学基因治疗第36页Everything is ready!分子生物学基因治疗第37页Packaging2 RNAs in 1 virus分子生物学基因治疗第38页HIV从受感染细胞质膜出芽情形从受感染细胞质膜出芽情形逆转录病毒产生包含将逆转录病毒产生包含将RNA包装到衣壳中，然包装到衣壳中，然后从细胞细胞膜上得到部分膜，出芽释放。后从细胞细胞膜上得到部分膜，出芽释放。分子生物学基因治疗第39页 调整和调整和开启转录开启转录 LTR gag pol env LTR 长末端长末端长末端长末端重复序列重复序列重复序列重复序列正常病毒基因正常病毒基因正常病毒基因正常病毒基因关键蛋白质关键蛋白质(Nucleoproteincore)编码逆转录编码逆转录酶和整合酶酶和整合酶(integrase)编码病毒外壳编码病毒外壳蛋白质蛋白质(Envelope)GenomeStructureofRetrovirus分子生物学基因治疗第40页（1 1）两端各有一）两端各有一长末端重复序列长末端重复序列LTRLTR。（2 2）LTRLTR由由U3U3、R R和和U5U5三部分组成。三部分组成。(1)(1)在在U3U3内有内有增强子增强子和和开启子开启子；(2)U3(2)U3和和U5U5两两端端分分别别有有病病毒毒整整合合序序列列(IS)(IS)；(3)(3)在在R R内还有内还有poly(A)poly(A)加尾信号加尾信号。逆转录病毒前病毒结构特点逆转录病毒前病毒结构特点 分子生物学基因治疗第41页（3 3）病毒有三个结构基因）病毒有三个结构基因(1)(1)gaggag基因基因，编码关键蛋白；，编码关键蛋白；(2)(2)polpol基因基因，编码逆转录酶和整合酶；，编码逆转录酶和整合酶；(3)(3)envenv基基因因，编编码码病病毒毒外外壳壳或或包包膜膜糖糖蛋蛋白白(包包含含外膜糖蛋白和穿膜蛋白外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。（4 4）55端端LTRLTR下下游游有有一一段段病病毒毒包包装装所所必必需需包包装装信信号号序序列列（）及）及剪接供体位点剪接供体位点(SD)(SD)和和剪接收体位点剪接收体位点(SA)(SA)。逆转录病毒前病毒结构特点逆转录病毒前病毒结构特点 分子生物学基因治疗第42页组成逆转录病毒介导基因转移系统组成逆转录病毒介导基因转移系统逆转录病毒载体逆转录病毒载体由两部分组成：由两部分组成：(1)(1)保保留留病病毒毒颗颗粒粒包包装装信信号号而而缺缺失失病病毒毒蛋蛋白白基因基因分子生物学基因治疗第43页 (2)(2)辅辅助助细细胞胞株株(如如PA317)PA317)：它它由由缺缺点点型型逆转录病毒感染构建而成逆转录病毒感染构建而成分子生物学基因治疗第44页Retroviralpackagingsystem分子生物学基因治疗第45页LTRLTRgaggagpolpolenvenvLTRLTRGagGag蛋白蛋白蛋白蛋白PoLPoL蛋白蛋白蛋白蛋白EnvEnv蛋白蛋白蛋白蛋白包装细胞系包装细胞系包装细胞系包装细胞系LTRLTRLTRLTR靶细胞靶细胞靶细胞靶细胞目标基因标识基因LTRLTRLTRLTR目标基因 标识基因12345假病毒颗粒产生并感染靶细胞假病毒颗粒产生并感染靶细胞逆转录病毒载体逆转录病毒载体重组逆转录病毒重组逆转录病毒(核酸部分只能是核酸部分只能是逆转逆转录病毒载体录病毒载体)辅病毒辅病毒分子生物学基因治疗第46页 逆转录病毒载体特点逆转录病毒载体特点 逆转录病毒包膜上由逆转录病毒包膜上由envenv编码糖蛋白编码糖蛋白，能够被许多能够被许多哺乳动物细胞膜上哺乳动物细胞膜上特异性受体识别特异性受体识别，从而使逆转，从而使逆转录病毒携带遗传物质高效地进入靶细胞。录病毒携带遗传物质高效地进入靶细胞。逆转录病毒结构基因逆转录病毒结构基因gaggag、envenv和和polpol缺失不影响其缺失不影响其它部分活性。它部分活性。前病毒能够高效整合至靶细胞基因组中，前病毒能够高效整合至靶细胞基因组中，有利于有利于外源基因在靶细胞中永久表示。外源基因在靶细胞中永久表示。包装好包装好假病毒颗粒假病毒颗粒（携带目标基因重组逆转录病毒载体）（携带目标基因重组逆转录病毒载体）以芽生方式分泌至辅助细胞培养上清液中，易于以芽生方式分泌至辅助细胞培养上清液中，易于分离制备。分离制备。分子生物学基因治疗第47页 逆转录病毒载体主要缺点逆转录病毒载体主要缺点 随机整合，有插入突变、激活癌基随机整合，有插入突变、激活癌基因潜在危险；因潜在危险；逆转录病毒载体容量较小，只能容逆转录病毒载体容量较小，只能容纳纳7 kb7 kb以下外源基因。以下外源基因。分子生物学基因治疗第48页（2 2）腺病毒）腺病毒(adenovirus(adenovirus，AVAV)载体载体腺病毒腺病毒是一个大分子是一个大分子(36 kb)(36 kb)双链无包膜双链无包膜DNADNA病毒病毒。它经过受体介导它经过受体介导内吞作用内吞作用进入细胞内，进入细胞内，腺腺病病毒毒基基因因组组转转移移至至细细胞胞核核内内，保保持持在在染染色色体体外外，不整合进入宿主细胞基因组中不整合进入宿主细胞基因组中。腺腺病病毒毒是是人人类类呼呼吸吸道道感感染染病病原原体体，但但当当前前还还未未发发觉觉与与肿肿瘤瘤发发生生相相关关联联。宿宿主主细细胞胞范范围围广广，可可感感染染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。分子生物学基因治疗第49页纤毛纤毛分子生物学基因治疗第50页腺病毒优点腺病毒优点1.1.基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；2.2.宿主范围广；宿主范围广；3.3.基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；4.4.重组腺病毒可经过口服经肠道吸收、或喷雾吸重组腺病毒可经过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；入或气管内滴注；5.5.腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb7.5 kb外源基因；外源基因；分子生物学基因治疗第51页 腺病毒载体缺点腺病毒载体缺点2.2.宿主免疫反应造成宿主免疫反应造成腺病毒载体表示短暂腺病毒载体表示短暂。3.3.有两个步骤有两个步骤可能产生复制型腺病毒可能产生复制型腺病毒。4.4.靶向性差。靶向性差。1.1.不能整合到靶细胞基因组不能整合到靶细胞基因组DNADNA中中。分裂增殖快细。分裂增殖快细胞，导入重组病毒载体，随分裂而丢失机会增多，胞，导入重组病毒载体，随分裂而丢失机会增多，表示时间相对较短。表示时间相对较短。(1)(1)腺病毒产生过程中与腺病毒产生过程中与293293辅助细胞辅助细胞内内E1E1区序列发生同区序列发生同源重组；源重组；(2)(2)腺病毒载体与被治疗患者体内已感染野生型腺病毒，腺病毒载体与被治疗患者体内已感染野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。分子生物学基因治疗第52页AAV Virus Particles（3 3）腺病毒相关病毒载体）腺病毒相关病毒载体腺病毒相关病毒腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus(adenovirus associated virus，AAVAAV)是一类是一类单链线状单链线状DNADNA缺点型病毒缺点型病毒。其基因组其基因组DNADNA小于小于5 kb5 kb，无包膜，外形为裸露，无包膜，外形为裸露2020面体面体颗粒。颗粒。AAVAAV不能独立复制不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，不然只能建立溶源性溶细胞性感染，不然只能建立溶源性潜伏感染潜伏感染。分子生物学基因治疗第53页Structure of AAV Virus Genomic DNAREP:病毒复制基因病毒复制基因,CAP:编码衣壳蛋白基因编码衣壳蛋白基因分子生物学基因治疗第54页AAVAAV特点特点 以潜伏感染为主；以潜伏感染为主；病毒基因组与细胞共存；病毒基因组与细胞共存；只要宿主细胞正常，只要宿主细胞正常，AAVAAV基因表示就处于抑基因表示就处于抑制而维持潜伏状态；制而维持潜伏状态；若细胞受刺激，表示应激基因，若细胞受刺激，表示应激基因，AAVAAV基因表基因表示从而使示从而使AAVAAV病毒复制；病毒复制；产生子代病毒并释放，又感染新细胞，建产生子代病毒并释放，又感染新细胞，建立新潜伏状态。立新潜伏状态。分子生物学基因治疗第55页AAVAAV载体是当前正在研究一类新型安全载体，载体是当前正在研究一类新型安全载体，它对人类无致病性。它对人类无致病性。AAVAAV能够高效能够高效定点整合定点整合至人至人1919号染色体特定区号染色体特定区域域19q13.419q13.4中，并能较稳定地存在。中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合能够这种靶向定点整合能够防止随机整合可能带来防止随机整合可能带来抑癌基因失活和原癌基因激活潜在危险性抑癌基因失活和原癌基因激活潜在危险性，而且外源基因能够连续稳定表示而且外源基因能够连续稳定表示，并可受到周，并可受到周围基因调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载围基因调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体二者优点。体二者优点。分子生物学基因治疗第56页 AAVAAV载体缺点：载体缺点：AAV载体容量小，当前最多只能容纳5kb外源DNA片段；感染效率比逆转录病毒载体低。在40%-80%成人中存在过感染，可能会引发免疫排斥。分子生物学基因治疗第57页分子生物学基因治疗第58页2.2.非病毒载体介导基因转移系统非病毒载体介导基因转移系统（1 1）脂质体介导基因转移技术脂质体介导基因转移技术脂质体介导基因转移技术使用方便、成脂质体介导基因转移技术使用方便、成本低廉。本低廉。基本原理基本原理:利用利用阳离子脂质体单体阳离子脂质体单体与与DNADNA混合后，能够自动混合后，能够自动形成包埋外源形成包埋外源DNADNA脂质脂质体体，然后与细胞一起孵育，即可经过细，然后与细胞一起孵育，即可经过细胞胞内吞作用内吞作用将外源将外源DNADNA（即目标基因）转（即目标基因）转移至细胞内，并进行表示。移至细胞内，并进行表示。分子生物学基因治疗第59页 脂质体介导基因转移示意图脂质体介导基因转移示意图分子生物学基因治疗第60页脂质体介导法缺点脂质体介导法缺点：脂质体介导进入靶细胞内，脂质体介导进入靶细胞内，易被单核易被单核-吞噬细胞系统选择性吞噬、降解吞噬细胞系统选择性吞噬、降解。分子生物学基因治疗第61页缺点：受体介导缺点：受体介导DNA通常进入细胞溶酶体内被降解。通常进入细胞溶酶体内被降解。（2 2）受体介导转移技术）受体介导转移技术将将DNADNA与与细胞细胞或组织亲和性或组织亲和性配体配体偶联，可使偶联，可使DNADNA含有靶向性。含有靶向性。这种偶联通常经过这种偶联通常经过多聚阳离子多聚阳离子（如多聚赖氨酸）（如多聚赖氨酸）来实现。来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又多聚阳离子与配体共价连接后，又经过电荷相经过电荷相互作用与带负电荷互作用与带负电荷DNADNA结合，将结合，将DNADNA包围包围，只留，只留下配体暴露于表面。下配体暴露于表面。这么形成复合物这么形成复合物可被带有特异性受体靶细胞吞可被带有特异性受体靶细胞吞饮，饮，从而将外源从而将外源DNADNA导入靶细胞。导入靶细胞。分子生物学基因治疗第62页受体介导转移技术示意图受体介导转移技术示意图分子生物学基因治疗第63页（3 3）基因直接注射技术）基因直接注射技术不需要进行基因工程繁琐操作，不需要进行基因工程繁琐操作，直接将裸露基因直接将裸露基因DNADNA注注入动物肌肉或一些器官组织内。入动物肌肉或一些器官组织内。动物试验表明：接收注射外源动物试验表明：接收注射外源DNADNA小鼠能够按其基因编小鼠能够按其基因编码合成对应蛋白质，并能维持数月之久。码合成对应蛋白质，并能维持数月之久。1.1.将促进心脏血管生长基因直接注入试验鼠心脏，可将促进心脏血管生长基因直接注入试验鼠心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加使其心脏壁内毛细血管增加30%30%40%40%；2.2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺乏胰岛素；病所缺乏胰岛素；3.3.肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需凝血基因，可产生血友病所需凝血因子等等。因子等等。分子生物学基因治疗第64页基因直接注射法优点基因直接注射法优点1.1.制备含有调控部件质粒制备含有调控部件质粒DNADNA重组体技术较轻易；重组体技术较轻易；2.2.排除病毒载体可能潜在致癌性或其它副作用；排除病毒载体可能潜在致癌性或其它副作用；3.3.导入基因不需整合即可表示导入基因不需整合即可表示，防止了逆转录病，防止了逆转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转缺点；或逆转缺点；4.4.基因直接注射法可重复使用基因直接注射法可重复使用，而病毒载体则可，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使重复治疗效果下降。能诱导体内免疫应答，致使重复治疗效果下降。分子生物学基因治疗第65页三、基因转移靶细胞三、基因转移靶细胞靶细胞选择须考虑：靶细胞选择须考虑：1.轻易取出和移植。血液系统细胞、成纤维轻易取出和移植。血液系统细胞、成纤维细胞、成肌细胞；细胞、成肌细胞；2.细胞含有较长寿命细胞含有较长寿命3.离体细胞较易受外源基因转化离体细胞较易受外源基因转化4.离体细胞经转染和一定时间培养后再植回离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活体内，仍较易成活体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞分子生物学基因治疗第66页当前惯用靶细胞有：当前惯用靶细胞有：1.造血细胞造血细胞2.皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞3.肝细胞肝细胞4.血管内皮细胞血管内皮细胞5.淋巴细胞淋巴细胞6.肌肉细胞肌肉细胞7.肿瘤细胞肿瘤细胞分子生物学基因治疗第67页三、基因干预三、基因干预Gene Interference主要干扰特定细胞主要干扰特定细胞mRNA转录和翻译转录和翻译分子生物学基因治疗第68页基因干预种类：基因干预种类：1.1.反义反义RNA(antisense RNA)RNA(antisense RNA)2.2.干扰干扰RNA(RNA interference)RNA(RNA interference)3.3.核酶核酶 (ribozyme)分子生物学基因治疗第69页（一）反义（一）反义RNARNADefinition:反义反义RNA（AntisenseRNA)：指与靶指与靶RNA(或或DNA)含有互补序列含有互补序列RNA分子分子。分子生物学基因治疗第70页反义反义RNA技术技术经过经过体外合成反义体外合成反义RNA或或构建能转构建能转录反义录反义RNA重组重组DNA质粒质粒转入细胞中，转入细胞中，利用利用碱基互补原理碱基互补原理结合细胞中特异结合细胞中特异mRNA以调控其表示。以调控其表示。分子生物学基因治疗第71页类反义类反义RNA直接直接作用于靶作用于靶mRNASD序列序列和和(或或)部分编码区，部分编码区，直接抑制翻译，或直接抑制翻译，或与靶与靶mRNA结合形成双链结合形成双链RNA，从而易被从而易被RNA酶酶降解；降解；类反义类反义RNA与与mRNA非编码区结合，非编码区结合，引发引发mRNA构象改变，抑制翻译；构象改变，抑制翻译；类反义类反义RNA则则直接抑制靶直接抑制靶mRNA转录转录1.依据反义依据反义RNA作用机制分为作用机制分为分子生物学基因治疗第72页反义寡聚核反义寡聚核苷酸（苷酸（类）类）与与mRNA特特异性结合，异性结合，阻断翻译过阻断翻译过程程分子生物学基因治疗第73页利用反义利用反义RNARNA对体外培养细胞进行基因表示调对体外培养细胞进行基因表示调控，通常采取方法有两种：控，通常采取方法有两种：（1 1）体外合成反义体外合成反义RNARNA，直接作用于培养细胞，直接作用于培养细胞，细胞吸收细胞吸收RNARNA后，发挥作用。后，发挥作用。缺点：缺点：RNARNA易降解易降解（2 2）构建能转录反义构建能转录反义RNARNA重组质粒重组质粒，将质粒转，将质粒转入细胞，转录出反义入细胞，转录出反义RNARNA而发挥作用而发挥作用缺点：细胞内转录反义缺点：细胞内转录反义RNARNA量不易控制量不易控制2.反义反义RNA与基因表示调控与基因表示调控分子生物学基因治疗第74页 反义反义RNARNA关键技术问题：关键技术问题：反义反义RNARNA进入靶细胞前降解问题进入靶细胞前降解问题专专一一性性转转移移问问题题：怎怎样样处处理理某某一一组组织织、器器官官或系统中部分细胞病变进行专一性转移治疗。或系统中部分细胞病变进行专一性转移治疗。分子生物学基因治疗第75页3.受体介导反义受体介导反义RNA转移技术转移技术 受受受受体体介介导导DNADNA转转移移方方法法启启发发把把DNADNA换换成成反反义义RNARNA，就就能能够够实实现现受受体体介介导导反反义义RNARNA转移。转移。分子生物学基因治疗第76页将将脱唾液酸血清类粘蛋白脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGPASGP）与）与多聚赖氨多聚赖氨酸酸（PLPL）共价连接，得到）共价连接，得到ASGP-PLASGP-PL复合物复合物，成，成为运载核酸工具。为运载核酸工具。结合反义结合反义RNARNA，成为成为ASGPPLASGPPL反义反义RNARNA复合物复合物ASGP-PLASGP-PL反义反义RNARNA复合物能够复合物能够专一性地被肝细专一性地被肝细胞表面胞表面ASGPASGP受体所识别受体所识别，并吞噬到肝细胞中，并吞噬到肝细胞中，反义反义RNARNA进入肝细胞后，可被逐步释放出来发进入肝细胞后，可被逐步释放出来发挥作用。挥作用。例：例：分子生物学基因治疗第77页受体介导受体介导RNARNA转移十分转移十分专一专一，而且效率，而且效率高；高；被转移被转移RNARNA是被保护，与周围环境之间是被保护，与周围环境之间存在存在多聚赖氨酸保护层多聚赖氨酸保护层,能够能够抵抗环境抵抗环境中核酸酶降解作用中核酸酶降解作用。分子生物学基因治疗第78页4.反义反义RNA应用（一）应用（一）利用反义利用反义RNA原癌基因失活疗法：原癌基因失活疗法：阻止或抑制原癌基因过分表示及抑制癌基阻止或抑制原癌基因过分表示及抑制癌基因突变体因突变体mRNA成熟成熟分子生物学基因治疗第79页原癌基因原癌基因调控细胞生长，增殖与分化调控细胞生长，增殖与分化正常情况下，表示受严格控制正常情况下，表示受严格控制一旦调整失控，基因产物（生长因一旦调整失控，基因产物（生长因子，生长因子受体，胞内外传递信子，生长因子受体，胞内外传递信号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性增生，致癌增生，致癌分子生物学基因治疗第80页依据已知癌基因核苷酸序列合成反义依据已知癌基因核苷酸序列合成反义RNA对应反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化对应反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表示表示mRNA起始翻译位点结合成起始翻译位点结合成RNA/RNA双链体双链体双链体阻止核糖体结合，或核糖体沿双链体阻止核糖体结合，或核糖体沿mRNA上移，抑制翻译上移，抑制翻译治疗方法治疗方法分子生物学基因治疗第81页抗抗HIV-l作用作用：从翻译水平封闭基因从翻译水平封闭基因表示，并干扰表示，并干扰mRNA剪切、加工而剪切、加工而实现抗病毒作用实现抗病毒作用反义反义RNA应用（二）应用（二）分子生物学基因治疗第82页tat为为HIV-l主要调整基因主要调整基因，编码，编码反式激活反式激活因子因子Tat蛋白蛋白,它能增强它能增强HIV-1基因转录起始和延伸效基因转录起始和延伸效率率.TAR序列序列是是TAT激活激活HIV基因表示所必需效应基因表示所必需效应元件。处于元件。处于LTRR区内。区内。Tat结合到结合到TAR茎环结构上。茎环结构上。分子生物学基因治疗第83页Tat可与可与RNA结合因子一起以复合体形式结合在转结合因子一起以复合体形式结合在转录物录物TAR序列上，并与装配在开启子处转录起始序列上，并与装配在开启子处转录起始复合体作用，复合体作用，这种作用造成这种作用造成TFH激酶活性被激活，结果激酶活性被激活，结果RNA聚合酶聚合酶羧基端结构域羧基端结构域(CTD)实现磷酸化，使得实现磷酸化，使得RNA聚合酶前进，完成聚合酶前进，完成HIV转录单位阅读，实现转录单位阅读，实现HIV蛋白大量合成。蛋白大量合成。分子生物学基因治疗第84页抗抗HIV-l策略策略在逆转录病毒开启子在逆转录病毒开启子LTR之后之后连接反义连接反义tat与多聚与多聚TAR构建物构建物(LTR-25TAR-AS-TAT)，含有反义含有反义tat及及TAR诱饵双重作用诱饵双重作用分子生物学基因治疗第85页gag是是HIV-1结构基因，编码结构基因，编码p24等病毒等病毒结构蛋白结构蛋白Veres等构建了逆转录病毒载体，在细胞等构建了逆转录病毒载体，在细胞内表示互补于内表示互补于gag区不一样长度反义区不一样长度反义RNA(225-1225nt)在在CEM-SS T细胞及外周血细胞及外周血CD4细胞都细胞都有抑制有抑制HIV-l复制作用复制作用长片段反义长片段反义RNA抗抗HIV-l作用更加好，作用更加好，可能因为它能与不一样种可能因为它能与不一样种HIV-l RNA结结合而限制了病毒逃逸合而限制了病毒逃逸 分子生物学基因治疗第86页 3.3.反义反义RNARNA应用前景应用前景 受受体体介介导导反反义义RNARNA基基因因治治疗疗有有其其本本身身优优点点，而而在在一定程度上补充了转基因治疗不足。一定程度上补充了转基因治疗不足。（l l）安全性高）安全性高 （2 2）反义）反义RNARNA设计设计 和制备方便和制备方便 （3 3）含有剂量调整效应）含有剂量调整效应 （4 4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNARNA病毒病毒 反反义义RNARNA只只作作用用于于特特异异mRNAmRNA分分子子，不不改改变变所所调调整整基基因因结结构构。反反义义RNARNA分分子子不不论论怎怎样样修修饰饰，最最终终将将在在细细胞胞内内部部被被降降解，不留解，不留“残渣残渣”。在在治治疗疗RNARNA病病毒毒感感染染性性疾疾病病时时，受受体体介介导导反反义义RNARNA基基因因治治疗疗比比普普通通DNADNA基基因因治治疗疗有有更更大大优优势势。利利用用反反义义RNARNA能能够够直直接作用于病毒接作用于病毒RNARNA，阻断，阻断RNARNA病毒繁殖。病毒繁殖。分子生物学基因治疗第87页1.RNA1.RNA干扰现象干扰现象 （二）干扰（二）干扰RNARNA对对RNARNA干扰认识起源于用干扰认识起源于用线虫线虫（C.elegansC.elegans）和和果蝇果蝇所进行试验。所进行试验。试验结果显示，有义链试验结果显示，有义链RNARNA（sense RNA