离子交换层析技术.pdf

1离子交换层析技术离子交换层析技术离子交换层析技术离子交换层析技术主要内容：主要内容：1离子交换层析原理2离子交换剂3离子交换层析实验方法4离子交换层析注意事项*5离子交换层析常见问题分析离子交换层析原理离子交换层析原理离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography IEC）原理是带电的生物大分子和离子交换色谱填料上的离子基团进行交换而被分离纯化。以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离。能够分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等。离子交换剂离子交换剂选择离子交换剂的一般原则选择离子交换剂的一般原则1.1.1.1.选择阴离子抑或阳离子交换剂，决定于被分离物质所带的电荷性质。如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如带负电荷，应选择阴离子交换剂；如被分离物为两性离子，则一般应根据其在稳定 pH 范围内所带电荷的性质来选择交换剂的种类。2.2.2.2.强型离子交换剂使用的 pH 范围很广，所以常用它来制备去离子水和分离一些在极端 pH溶液中解离且较稳定的物质。3.3.3.3.离子交换剂处于电中性时常带有一定的反离子，使用时选择何种离子交换剂，取决于交换剂对各种反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强酸型和强碱型离子交换剂应分别选择 H型和 OH 型；弱酸型和弱碱型交换剂应分别选择Na 型和 Cl 型。4.4.4.4.交换剂的基质是疏水性还是亲水性，对被分离物质有不同的作用性质，因此对被分离物质的稳定性和分离效果均有影响。一般认为，在分离生命大分子物质时，选用亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏。常用离子交换剂的种类与特性常用离子交换剂的种类与特性1.1.1.1.离子交换纤维素离子交换纤维素离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表 1-1 所示。2表 1-1 离子交换剂的类型与特点在交换纤维素中，最常用的是 DEAE-纤维素和 CM 纤维素。由于剂型不同，其理化性质和作用也有所差异。一般而言，微粒型要优于纤维素型，因为微粒型是在纤维素型的基础上进一步提炼而成。它的交换容量大，粒细、比重大，能装成紧密的层析柱，要求分辨力高的实验可用此型纤维素（见表 1-2）。表 1-2 商品 DEAE-纤维素和 C M 纤维素的类型和特性+离子交换纤维素的优点为：离子交换纤维素为开放性长链，具有较大的表面积，吸附容量最大；离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗脱；具有良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广。2.2.2.2.离子交换交联葡聚糖离子交换交联葡聚糖离子交换交联葡聚糖也是广泛使用的离子交换剂，它与离子交换纤维素不同点是载体不同，常用交联葡聚糖的类型与特性见表 1-3。交换剂名称（纤维素）作用基团特点阴离子交换剂二乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H最常用在 pH8.6 以下三乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H氨乙基AE+-O-C2 H4-N H2胍乙基强碱性、极高 pH 仍有效阳离子交换剂羧甲基CM-O-CH2-COO最常用在 pH4 以上磷酸P-O-P O2用于低 pH磺甲基SM-O-CH2-SO3磺乙基SE-O-C2H4-SO3强酸性用于极低 pH纤维素形状长度交换当量（毫克当量/克）蛋白质吸附容量（mg/g 牛血清白蛋白）床体积（ml/g）pH 6.0pH 7.6DE-22改良纤维12-4001.00.14507.77.7DE-23改良纤维（除细粒）18-4004508.39.1DE-32微粒型（干）24-636606.06.7DE-52微粒型（湿）24-636606.06.3DE-11旧型号50-250130CM-22与以上相应型号同0.60.066007.77.7CM-236009.19.1CM-3212606.86.7CM-521.00.112606.86.73表 1-3 常用交联葡聚糖的类型与特性离子交换交联葡聚糖有如下优点：不会引起被分离物质的变性或失活；非特异性吸附少；交换容量大。离子交换葡聚糖的选用，一般根据蛋白质的分子量而定。中等分子量（30 000-200 000）一般选A50 和 C50，而低分子量（30 000 和高分子量200 000）均宜选用 A25 和 C25。离子交换剂的处理和保存离子交换剂的处理和保存离子交换剂使用前一般要进行处理。干粉状的离子交换剂首先要进行膨化，将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的电荷基团充分暴露出来。而后用水悬浮去除杂质和细小颗粒。再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至中性，这是为了进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子。市售的离子交换剂中通常阳离子交换剂为 Na 型（即平衡离子是 Na 离子），阴离子交换剂为 Cl 型，因为通常这样比较稳定。处理时一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理。常用的酸是 HCl，碱是 NaOH 或再加一定的 NaCl，这样处理后阳离子交换剂为 Na 型，阴离子交换剂为 Cl 型。使用的酸碱浓度一般小于0.5mol/L，浸泡时间一般 30min。处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处理时间不宜过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏。另外要注意的是离子交换剂使用前要排除气泡，否则会影响分离效果。离子交换剂的再生是指对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。酸碱交替浸泡的处理方法就可以使离子交换剂再生。离子交换剂的转型是指离子交换剂由一种平衡离子转为另一种平衡离子的过程。如对阴离子交换剂用 HCl 处理可将其转为 Cl 型，用 NaOH 处理可转为 OH 型，用甲酸钠处理可转为甲酸型等等。对离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，都是为了使离子交换剂带上所需的平衡离子。离子交换层析就是通过离子交换剂上的平衡离子与样品中的组分离子进行可逆的交换而实现分离的目的，因此在离子交换层析前要注意使离子交换剂带上合适的平衡离子，使平衡离子能与样品中的组分离子进行有效的交换。如果平衡离子与离子交换剂结合力过强，会造成组分离子难以与交换剂结合而使交换容量降低。另外还要保证平衡离子不对样品组分有明显影响。因为在分离过程中，平衡离子被置换到流动相中，它不能对样品组分有污染或破坏。如在制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是 H 或 OH 离子，因为其它离子都会对纯类 型性能离子基因反离子总交换容量（毫克当量/g）DEAE-sephadexA-25弱碱性、阴离子交换剂DEAE+Cl-3.50.5DEAE-sephadexA-50QAE-sephadex-25弱碱性、阴离子交换剂QAE+Cl-3.00.4QAE-sephadex A-50CM-A-sephadex 25弱碱性、阳离子交换剂CM-Na+4.50.5CM-sephadex A-50SP-sephadex A-25强碱性、阳离子交换剂SP-Na+2.30.34水有污染。但是在分离蛋白质时，一般不能使用 H 或 OH 型离子交换剂，因为分离过程中 H或 OH 离子被置换出来都会改变层析柱内 pH 值，影响分离效果，甚至引起蛋白质的变性。离子交换剂保存时应首先处理洗净蛋白等杂质，并加入适当的防腐剂，一般加入 0.02%的叠氮钠，4下保存。离子交换层析实验方法离子交换层析实验方法阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。1.1.1.1.剂型的选择剂型的选择根据蛋白质在所用缓冲液 pH 值下带电荷的种类选择，如 pH 高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM 纤维素用于分离碱性蛋白质。下面以 DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法。2.2.膨胀活化膨胀活化此步的目的在于除去杂质，暴露 DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是 1.0g DEAE-纤维素相当于 6ml8ml 柱床体积。表 1-4 分离的血清与所需 DEAE-纤维素量及其他条件的大致关系称取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE纤维素干粉约需 15 倍 NaOH液），浸泡 1h 左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于 0.5Mol/L HCl 中 1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于 0.5Mol/L NaOH 液中，同样处理，洗至中性。3.3.3.3.平衡平衡将 DEAE纤维素放入 0.0lMol/L pH 7.4 PB 液中（即起始缓冲液），静止 1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的 pH值与加入的 PB 液的 pH 值相近时为止。4.4.4.4.装柱装柱层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为 101201，柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理 24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的 DEAE纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至 1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表血清样品量（ml）DEAE 需用量（g）选层析柱规格（cm）选脱液量（ml）1-22125100-15055212200-3001010220300-4002020237400-8005面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡，使流出液的 pH 值与流入液的 pH 值完全一致为止。5.5.5.5.上样上样要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4）平衡过夜，中间可换液数次。将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml2ml 缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。样品的加量与DEAE-纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯度。经过粗提的球蛋白 50mg100mg，用干重约 4g DEAE纤维素装柱分离，可获得理想结果。6.6.6.6.洗脱洗脱对于阴离子交换剂而言，洗脱的办法是使 pH 逐渐降低，而离子浓度逐渐升高。一般的办法，是稳定一个因素而改变另一个因素洗脱。洗脱可采用分段洗脱和连续洗脱法，前者较实用，后者较准确。表 1-5 血清蛋白各成分的吸附与解吸的关系表 1-6 血清的分段洗脱成分表 1-7 各种 Ig 解脱吸附条件1e#_.|.E 1 p 3S 5 4 C7.7.7.7.洗脱液的收集洗脱液的收集成分等电点DEAE 吸附能力解吸顺序白蛋白4.95.65.17.3强弱后先NaCl 浓度（mol/L）0.01mol/L PB（pH）洗脱部分0.0258.0IgG0.0307.0IgG0.0407.0运铁蛋白、纤维蛋白原0.0606.5白蛋白、IgA0.1506.5IgM 白蛋白不加 NaCl PB 离子强度（Mol/L）pHIg其他0.018.0IgG0.0258.0IgE0.0357.0IgA0.0405.9球蛋白0.105.8白蛋白0.405.24.5IgM球蛋白6利用自动分步收集器收集，并以 20%磺基水杨酸测试，当蛋白液下来时，开始分管收集，至无蛋白液为止。8.8.8.8.交换柱的再生交换柱的再生将使用过的 DEAE-纤维素移入烧杯中，用 2Mol/L NaCl 液浸泡，抽滤并洗涤数次。如不立即使用，可加 1/10 000 的叠氮钠防腐，保存于 4冰箱中。使用时，再以碱酸碱处理。离子交换层析注意事项离子交换层析注意事项1.1.1.1.层析柱层析柱离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为 1:10 到 1:50 之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。2.2.2.2.平衡缓冲液平衡缓冲液离子交换层析的基本反应过程就是离子交换剂平衡离子与待分离物质、缓冲液中离子间的交换，所以在离子交换层析中平衡缓冲液和洗脱缓冲液的离子强度和 pH 的选择对于分离效果有很大的影响。平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和 pH 的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。在一些情况下（如污水处理）可以使杂质与离子交换剂有牢固的结合，而样品与离子交换剂结合不稳定，也可以达到分离的目的。另外注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。选择合适的平衡缓冲液，直接就可以去除大量的杂质。并使得后面的洗脱有很好的效果。如果平衡缓冲液选择不合适，可能会对后面的洗脱带来困难，无法得到好的分离效果。3.3.3.3.上样上样离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和 pH 值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的 15为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。4.4.4.4.洗脱缓冲液洗脱缓冲液在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变 pH 两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变 pH 的洗脱，对于阳离子交换剂一般是 pH 从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是 pH 从高到低。由于 pH 可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。梯度洗脱的装置前面已经介绍了，可以有线性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分级梯度等洗脱方式。一般线性梯度洗脱分离效果较好，故通常采用线性梯度进行洗脱。洗脱液的选择首先也是要保证在整个洗脱液梯度范围内，所有待分离组分都是稳定的。其次是要使结合在离子交换剂上的所有待分离组分在洗脱液梯度范围内都能够被洗脱下来。另外可以使梯度范围尽量小一些，以提高分辨率。5.5.5.5.洗脱速度洗脱速度洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。76.6.6.6.样品的浓缩、脱盐样品的浓缩、脱盐离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高，而且体积较大，样品浓度较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。离子交换层析常见问题分析离子交换层析常见问题分析1.1.1.1.层析速度太慢层析速度太慢可能原因和解决方法：关小层析柱出口，再打开；若是气泡阻挡了洗柱缓冲液的流动，可通过增加柱压并用指甲轻敲柱壁的方法以除去气泡，确保在引入任何溶液是不要产生气泡；树脂顶部出现沉淀物，此时应刮掉顶部 12cm 的树脂，换之以新的树脂。更加仔细的过滤蛋白质溶液或在层析时使用去垢剂；树脂的支撑物发生粘连，在样品蛋白质损失量允许的情况下，支撑物应取出并清洗；树脂被压紧，葡萄糖等随溶液离子强度的变化而膨胀的树脂可能会发生这一现象；层析柱太细，对于性能好的树脂，柱高只需直径的两倍即可得到理想的层析效果；细小颗粒堵塞了层析柱；泵的连接管漏气，更换新的连接管；层析柱出口处管道堵塞，更换或清洗管道；树脂滋生微生物。2.2.2.2.蛋白质不与树脂结合蛋白质不与树脂结合可能原因及解决方法：初上样缓冲液离子强度过大，降低初始上样缓冲液离子强度；树脂 PH 值因解析作用而发生变化，注意蛋白质等电点的计算值往往与实验值差别很大；树脂未进行适当平衡；再生的树脂未洗净。3.3.3.3.纯化的蛋白质产率低纯化的蛋白质产率低可能原因及解决方法：树脂上的蛋白质未洗净，可采用增强溶液离子强度，更换活性高的反荷离子或使用去垢剂等办法解决；PH 值不合适，若缓冲体系的 PH 值与目的蛋白的PI 相差太远，目的蛋白与树脂的结合会过于牢固；蛋白质发生沉淀，可能是因为缓冲体系 PH 值过于接近蛋白质 PI 值，溶液离子强度过低或溶液过渡稀释；蛋白质在初步过滤的时候有损失；蛋白质或者辅助因子在层析时有损失；蛋白质水解酶破坏了目的蛋白；树脂中有微生物。4.4.4.4.蛋白质分辨效果差蛋白质分辨效果差可能原因及解决办法：层析时流速太快；层析柱过短；上柱蛋白过多；梯度洗脱时洗脱液浓度变化太快；蛋白质可在脱离层析柱后再次混合，尽量减少树脂支持物与部分收集期间的管道体积；不均匀的装柱以至产生碎屑，上样合洗脱时的错误操作；树脂未进行适当平衡；树脂中有微生物。5.5.5.5.蛋白质洗脱的重现性差蛋白质洗脱的重现性差可能原因及解决办法：层析柱的平衡不彻底；洗脱液的例子条件或 PH 值不一致；蛋白质发生沉淀，彻底清洗层析柱，取出任何可能导致蛋白质沉淀的杂质，过滤蛋白质溶液；8蛋白质储存时变性，重新测定蛋白质活性，必要时改变蛋白质的储存条件；6.6.6.6.纯化时蛋白质失活纯化时蛋白质失活可能原因及解决办法：某个辅助因子或一部分蛋白质有损失，混合部分收集液，测定活性；蛋白质在现有层析液中不稳定；树脂中有微生物。7.7.7.7.蛋白质活性高于纯化前蛋白质活性高于纯化前可能原因及解决办法：测定条件发生改变；某种抑制剂在纯化时去掉了，可混合部分收集液，测定活性以确定。