5-ALA光动力-热敏醇质体的制备工艺研究.pdf

化学工程师Sum335No.8ChemicalEngineerDO1:10.16247/ki.23-1171/tq.20230805科研与开发5-ALA光动力-热敏醇质体的制备工艺研究2023年第8 期罗国平1,任婉婷1,闫梦茹1,孟会宁2（1.西安医学院药学院，陕西西安7 10 0 2 1;2.山东步长医药销售有限公司，山东菏泽2 7 4418）摘要：优化5-氨基乙酰丙酸盐酸盐（5-ALA)醇质体的制备工艺。选用大豆卵磷脂及胆固醇作为囊材，采用乙醇注人法制备5-ALA醇质体。以热敏性、包封率、变形性、粒度分布等为评价指标，分别采用单因素实验和正交实验优化工艺条件。最优制备条件为：m(大豆卵碱脂):m(胆固醇)=9:1,m(囊材):m(药物)=2 3.3:1,无水乙醇加人体积为10 mL，PBS溶液的pH值为7.4，搅拌时间为30 min，超声时间为4min。本实验优化得到的5-ALA光动力一热敏醇质体包封率较高，变形性较好，粒度分布均匀。关键词：5-氨基乙酰丙酸盐酸盐；光动力作用；热敏醇质体；工艺优化；药剂学性质评价中图分类号：TQ469Study on the preparation process of 5-ALA photodynamic-thermosensitive ethosomes*(1.Pharmaceutical Institute,Xian Medical University,Xian 710021,Chinai2.Shandong Buchang Medicine Co.,Ltd.,Heze 274418,China)Abstract:To optimize the preparation conditions of 5-aminolevulinic acid hydrochloride(5-ALA)ethosomes.Soybean lecithin and cholesterol were used as capsule materials to prepare 5-ALA ethosomes by ethanol injectionmethod.Taking thermal sensitivity,encapsulation ratio,deformability and particle size distribution as evaluationindexes,the process conditions were optimized by single factor test and orthogonal test.The optimum preparationconditions were as follows:m(sobean eathn)im(choea)=9:1,m(apiemeia)im(main ug)=23.3:1,the volume of anhydrous ethanoladded was 10mL,the pH of PBS solution was 7.4,the stirring time was 30min,and the ultrasonic time was 4min.The optimized 5-ALA photodynamic-thermosensitive ethosomes obtained in this experiment had high encapsulationefficiency,good deformability and uniform particle size distribution.Key words:5-ALA;photodynamic effect;photodyamic action;thermosensitive ethosomesi process optimization;evaluation of pharmaceutical properties.光动力疗法(PDT)是运用特定波长的光来激发光敏药物，使其发生一定的光化学反应，导致机体细胞或分子发生形态及机能的改变，从而达到的诊断或治疗作用11。5-氨基乙酰丙酸,又名 5-氨基酮戊酸，目前市面上销售的该产品大多以盐酸盐（5-ALA)的形式存在,属于第二代光敏剂，可用于治疗痤疮、尖锐湿疣、银屑病、鲜红斑痣等皮肤疾病12 1,其作用的机理为：5-ALA经皮给药后，能被病变细胞收稿日期：2 0 2 3-0 2-2 8基金项目：2 0 2 1年陕西省教育厅青年创新团队项目（2 1JP113)；陕西高校青年创新团队建设项目（陕教2 0 19 90 号;西安医学院2020年国家级、省级和校级大学生创新创业训练计划项目(202011840016,S202011840016,121520016)作者简介：罗国平（197 9-），男，教授，2 0 0 5年毕业于西安交通大学药剂学专业，硕士研究生，从事药物新制剂、新剂型和新技术的教学和科研工作。文献标识码：ALUO Guo-ping,REN Wan-ting,YAN Meng-ru,MENG Hui-ning?选择性的吸收并大量积蓄于该类细胞中，然后进一步转变为具有很强光敏活性的原叶啉IX（Pp IX)，在一定波长光的激发下，产生大量的单线态氧，单线态氧可使病变细胞坏死,从而达到治疗疾病的目的。研究发现,5-ALA在应用时也存在一些问题，如稳定性差(3),尤其在碱性条件下；极性较大导致皮肤渗透性不好，难以到达皮肤深层，在外用制剂方面存在一定的限制。为此,本实验将5-ALA采用热敏醇质体进行包载，热敏醇质体是一种新型醇质体14.51，其作用有：（1)可将5-ALA封闭在类脂质双分子层内的水相中，提高药物稳定性13.6 1；（2）醇质体17 具有较好的变形性，能提高5-ALA的透皮性能；（3)光动力-热敏醇质体由相变温度（Tm）稍高于体温的脂膜磷脂构成18 1,用波长为6 35nm的红光照射患处，红光的热效应会使患处局部温度升高，当超过热敏醇质06体的相变温度时，醇质体会释放出5-ALA，产生相应的治疗作用。本文主要研究5-ALA光动力-热敏醇质体的制备工艺并进行药剂学性质评价19。1实验部分1.1试剂与仪器5-氨基乙酰丙酸盐酸盐原料药（99%上海麦克林生化科技有限公司）；胆固醇（东巨荣生物工程有限公司）；大豆卵磷脂（药用）;无水乙醇、1,2-丙二醇，分析纯，天津永晟精细化工有限公司;KH,PO、NaH2PO4、H.PO 4,均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；乙睛（色谱纯天津市科密欧化学试剂有限公司);石油醚（色谱纯天津市天力化学试剂有限公司);NaOH（A R天津市化学试剂公司）。DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；AgilentTech.1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）;TG-1650-WS型台式高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）;SB-5200DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）;BT125D型电子天平（赛多斯科学仪器（北京）有限公司）;ZEN-3600Malvern型马尔文激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）。1.2实验方法1.2.15-ALA光动力-热敏醇质体的制备采用乙醇注入-超声法10 1。精密称取大豆卵磷脂和胆固醇，置10 0 mL烧杯中，加一定体积无水乙醇超声溶解；另在避光条件下,将5-ALA溶解于一定体积的PBS溶液中，在10 0 rmin转速搅拌条件下用注射器缓慢匀速注人到上述乙醇溶液中，继续搅拌一定时间，超声处理（2 50 W，40 k H z）一定时间，即得。1.2.2热敏性评价采用DSC法进行热敏性评价。分别取上述制备的5-ALA光动力-热敏醇质体,离心，将沉淀真空干燥后置于铝制埚内，在体积分数为99.99%的N氛围下，升温速度为1min=,于2550范围内检测样品的热量变化。1.2.3包封率的测定取5-ALA光动力-热敏醇质体混悬液4mL，150 0 0 r min-1转速高速离心15min，取上清液，用0.45m微孔滤膜（水系）过滤，取续滤液,采用高效液相色谱法测定5-ALA的浓度，得到游离 5-ALA的浓度（C游）,代人式（1)计算包封率(EE%)。EE%=mm-Cm Va x100%m总罗国平等：5-ALA光动力热敏醇质体的制备工艺研究*1.2.5变形性测定1131取4mL5-ALA光动力-热敏醇质体混悬液和4mL水，分别测定在0.8 kg重物的压力下通过0.45m微孔滤膜的性能，按式(2)计算变形性(D)。D=(V醇质体/V永)10 0%式中V醇质体：光动力-热敏醇质体的通过速度，mLmin,;V水:水的通过速度,mLmin。1.2.6平均粒径和粒度分布的测定取制备好的5-ALA光动力-热敏醇质体,采用Malvern激光粒度仪进行检测。1.2.7单因素实验(1311.2.7.1不同 m(大豆卵磷脂)：m(胆固醇)对相变温度(Tm)和包封率的影响按照“1.2.1 项下的制备方法加入10mg5-ALA，乙醇10 mL,pH值为7.4的PBS溶液12mL,搅拌2 0 min,超声2 min。考察m(大豆卵磷脂)：m胆固醇)分别为6:1、9:1、12:1时，制备的5-ALA光动力-热敏醇质体的Tm和包封率的变化情况。1.2.7.2不同m(囊材)：m(药物)对包封率的影响按照“1.2.1”项下的制备方法加入大豆卵磷脂2 40 mg,胆固醇40 mg，乙醇10 mL，p H 值为7.4的PBS溶液12mL,搅拌2 0 min，超声2 min。考察囊材与药物质量比分别为35:1、2 8:1、2 1:1时，制备的5-ALA光动力-热敏醇质体的包封率的变化情况。1.2.7.3溶液pH值对包封率的影响按照“1.2.1”项下的制备方法加入大豆卵磷脂2 40 mg，胆固醇40mg,5-ALA10mg,乙醇10 mL,PBSs溶液12 mL,搅拌2 0 min，超声2 min。采用pH梯度法，即在形成醇质体前，PBS溶液的pH值为3.0，注人法制备醇质体后，调节溶液的pH值，考察pH值分别为3.0、7.4、10.0 时，制备的5-ALA光动力-热敏醇质体的包封率的变化情况。1.2.7.4搅拌时间对包封率的影响按照“1.2.1”项下的制备方法加人大豆卵磷脂2 40 mg，胆固醇40mg,5-ALA10mg,乙醇10 mL，PBs 溶液12 mL,超声2 min。考察搅拌时间分别为10、2 0、30 min时，制(1)备的5-ALA光动力-热敏醇质体的包封率的变化情况。2023年第8 期式中m总：加入药物的总质量，mg;V总：未包封的5-ALA质量,mg。1.2.4HPLC法测定5-ALA的含量(111色谱条件：Agilent 5TC-C1s型色谱柱(2 50 mmx4.6mm,5m;流动相：乙睛：1.36%KH2PO溶液（用HPO4调pH值至2.0)=3:97；柱温：2 5；波长：2 6 5nm；流速：1mLmin=;进样体积:2 0 L。（2）2023年第8 期乙醇体积对变形性的影响按照“1.2.1”1.2.7.5项下的制备方法加入大豆卵磷脂2 40 mg，胆固醇40mg,5-ALA10mg,pH值为7.4的PBs溶液12 mL,搅拌2 0 min，超声2 min。考察乙醇体积分别为6、10、14mL时，制备的5-ALA光动力-热敏醇质体的变形性变化情况。1.2.7.6超声时间对粒径分布系数（PDI）的影响按照“1.2.1 项下的制备方法加人大豆卵磷脂2 40 mg，胆固醇40 mg,5-ALA10mg,无水乙醇10 mL,pH为7.4的PBS溶液12 mL，搅拌2 0 min，考察超声时间分别为1、2、4、10 min时，制备的5-ALA光动力-热敏醇质体平均粒径和粒度分布的变化情况。1.2.8正交实验筛选最优制备条件114在单因素实验基础上，采用正交实验法，以包封率为评价指标,选择m(大豆卵磷脂):m(胆固醇)（A）、囊材):m(药物)(B)和搅拌时间(c)3个因素,每个因素设置3个水平进行正交实验，因素水平见表1。表1因素水平表Tab.1 Factors and their levelsm(大短卵磷脂):m(胆固醇)m(囊材)im(药物)水平因素(A)16:129:1312:11.2.9药剂学性质评价按照优选出的条件制备5-ALA光动力-热敏醇质体，分别采用 1.2.3”项下方法测定包封率，采用“1.2.5 项下方法测定变形性，采用“1.2.6 项下方法测定平均粒径和粒度分布。2结果与讨论2.1单因素实验2.1.1不同 m(大豆卵磷脂)m(胆固醇)对相变温度(T.)和包封率的影响(图1、图2）由图1可见,m(大豆卵磷脂):m（胆固醇)=12:1时，Tm值约为40;m(大豆卵磷脂):m(胆固醇)=9:1 时,Tm值约为41;m(大豆卵磷脂):m(胆固醇)=6:1时,Tm值约为42.5。可见，Tm值随着囊材中胆固醇的比例增加略有升高。另外,从图的形状可看出,大豆卵磷脂与胆固醇质量比为6:1时，相变特性最为明显。由图2 可见，随着大豆卵磷脂与胆固醇质量比增大,包封率呈现先增大后减小的趋势，但差异不大。罗国平等：5-ALA光动力热敏醇质体的制备工艺研究*301.m(大豆卵磷脂):m(胆固醇)=6:1 2.m(大豆卵磷脂):m(胆固醇)=9:13.m(大豆卵磷脂):m(胆固醇)=12:1图 1 不同 m(大豆卵磷脂)m(胆固醇)制备的醇质体 DSC 图Fig.1DSC diagram of glycosome prepared withdifferent mass ratios of soybean lecithin and cholestero70160150%/率样马403020搅拌时间(B)(c)35.0:11028.0:12023.3:130073.02.5-52.01.51.0-0.525100图 2 不同 m(大豆卵碘脂):m(胆固醇)对包封率的影响Fig.2Effect of different proportionsof soybean lecithin and cholesterol on encapsulation efficiency2.1.2不同m(囊材):m(药物)对包封率的影响(图 3)701601504030201023.3:1图3囊材与药物质量比对包封率的影响Fig.3Effect of differentquality ratiosof capsule materials and drugs on encapsulation efficiency由图3可见，包封率随着m(囊材):m(药物)的增大呈先增后降的趋势，但差异较小。2.1.3溶液pH值对包封率的影响（图4）33540温度/6:19:1m(大豆卵磷脂):m(胆固醇)28.0:1m(囊材):m(药物)4512:135.0:15008%/*拜马403020100234567891011pH值图4pH值对包封率的影响Fig.4Effect of pH value on encapsulation efficiency由图4可见，包封率随溶液pH值的增大而增大，但pH值为7.4和10 时的包封率相差不大。分析原因是，采用pH梯度法制备醇质体时，醇质体形成之前用HC1调节水溶液的pH值偏酸性至5-ALA盐酸盐等电点以下，采用注人法形成醇质体后,再调节溶液pH值至5-ALA盐酸盐等电点以上,结果醇质体内水相中药物主要以解离型存在，而外水相则主要以非解离型存在，由于醇质体膜属于脂质双分子层结构，外水相的非解离型药物可通过被动扩散从膜外进人膜内，进人膜内的药物受pH值的影响转变为解离型；而膜内的解离型药物无法通过膜向外扩散，因此，醇质体中药物的包封率就会增大。可见，pH梯度法可显著提高药物的包封率。考虑到皮肤用药的刺激性问题,选取溶液pH值为7.4。2.1.4搅拌时间对包封率的影响（图5）7016050%/率样码40302010010图5搅拌时间对包封率的影响Fig.5 Effect of mixing time on encapsulation efficiency由图5可见，随着溶液搅拌时间的增加，包封率持续增大，但趋势逐渐减弱。2.1.5乙醇体积对变形性的影响(图6)由图6 可见，随着乙醇体积的增大,药物的变形性逐渐增大，但趋势逐渐减弱，因此，选择乙醇体积为10 mL。2.1.6走超声时间对粒径分布系数(PDI)的影响(图7)罗国平等：5-ALA光动力热敏醇质体的制备工艺研究70160502023年第8 期20715%10506图6 乙醇体积对变形性的影响Fig.6Effect of ethanol volume on deformability0.510.40.30.20.10.00图7 走超声时间对粒径分布系数(PDI)的影响Fig.7Effect of ultrasound time onPDI由图7 可见，随着超声时间的延长，PDI持续减小，即醇质体的粒径随超声时间延长变得更为均匀，但4min后减小的趋势显著变缓,故选择超声时间为4min。2.2正交实验筛选最优制备条件10 1正交实验结果和直观分析见表2，方差分析见表3。表2 正交实验结果Tab.2Design and results of the orthogonal testm(大豆卵磷脂):m(胆固醇)m(囊材):m(药物)序号(A)1520搅拌时间/min8乙醇体积/mL24超声时间/min(B)253010616:126:136:149:159:169:1712:1812:1912:1K156.107K258.390K345.577R12.813128搅拌时间包封率/min/%(c)35.0:11028.0:12023.3:13035.0:12028.0:13023.3:11035.0:13028.0:11023.3:1204.9.34756.45053.73045.81056.99757.8137.65012.003141060.4244.8163.094.5.7268.4561.0041.9047.9346.902023年第8 期Tab.3Results of theanalysis of variance偏差因素自由度F比F临界值显著性平方和A280.276B88.407C259.148误差136.78由表2 可见,因素影响由大到小依次为:ACB，即 m(大豆卵磷脂):m(胆固醇)搅拌时间m(囊材):m(药物);筛选出的最佳搭配为A,B:C,即m(大豆卵磷脂):m(胆固醇)=9:1,m(囊材):m(药物)=2 3.3:1,搅拌时间为30 min。2.3最优工艺条件制备的5-ALA光动力-热敏醇质体的药剂学性质评价2.3.1包包封率的测定测得包封率为6 9.7 3%，包封率较高。2.3.2变形性的测定性较好。2.3.3粒度分布的测定（图8）252010151050卡0图8 5-ALA光动力-热敏醇质体的粒径分布Fig.8Particle size distribution of 5-ALAphotodynamic-thermosensitive electrosol bodies由图8 可见,PDI测得为0.2 8 0，平均粒径为325.4nm，表明醇质体的粒径在纳米级别且粒度分布均匀。罗国平等：5-ALA光动力一热敏醇质体的制备工艺研究*表3方差分析结果22.04920.64621.8952测得变形性为19.15%，变形200400粒径/nm093结论本文以大豆卵磷脂和胆固醇为囊材，无水乙醇19.00为柔软剂,采用乙醇注入-pH梯度法制备的5-ALA19.00光动力-热敏醇质体药物的包封率高,具有较好的热19.00敏性和变形性,粒径分布均匀。参考文献1刘巧,吴伟伟.光动力疗法中光敏剂研究进展J.实用皮肤病学杂志，2 0 0 8,1(4）:2 50-2 52.2 吴莉芳.新型经皮光动力药物5-氨基酮戊酸已酯醇质体的制备及其药效学的实验研究D.南方医科大学，2 0 18.3范理,5-氨基乙酰丙酸的检测方法及稳定性研究D.浙江大学,2 0 0 6.4走赵峰，卿三华，王永华.天然大豆磷脂制备热敏脂质体的方法及质量评价J.中国天然药物，2 0 0 5,3（4):2 31-2 34.5孙飞，尹莉芳，周建平.热敏脂质体的研究进展J.药学进展，2010,34(9):399-405.【6 孙庆雪，邵伟，黄桂华.脂质体制备方法的选择J.中成药，2010,32(8):1397-1401.7 林琪，张嘉颖，吴振，等.花酸柔性纳米脂质体的制备工艺优化与体外透皮实验J.华侨大学学报（自然科学版），2 0 2 0,41(5):638-646.8 丁昂昂，熊屏，陈亚珠.热敏脂质体（TSL)的研究进展J.复且学报（医学版）,2 0 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