肠道类器官模型的构建和应用研究进展.pdf
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1、动物营养学报,():肠道类器官模型的构建和应用研究进展邱广志 喻礼怀 张昌卫 董 丽(扬州大学动物科学与技术学院,扬州)摘 要:肠道类器官是体外研究肠道干细胞和肠上皮细胞较好的工具,应用前景广泛,建立并优化肠道类器官模型,对于肠道干细胞和肠上皮细胞的基础研究和临床疾病的调控具有重要意义。本文主要从肠道类器官的定义和发展历程出发,综述了肠道类器官在疾病建模等领域的应用,重点总结了人、鼠和猪肠道类器官模型的构建方法,可为肠道类器官模型的构建和应用提供参考。关键词:肠道类器官;模型构建;人;鼠;猪中图分类号:文献标识码:文章编号:()收稿日期:基金项目:年江苏省研究生科研与实践创新计划项目();苏北
2、科技专项 富民强村科技帮促项目()作者简介:邱广志(),男,河北承德人,硕士研究生,研究方向为猪的营养代谢与调控。:通信作者:董 丽,副教授,硕士生导师,:肠道类器官(,)模型的构建是一项技术突破,活体分离的隐窝干细胞在体外培养形成立体的隐窝绒毛结构,该过程区别于常见的肠上皮细胞体外培养,可更好地用于研究肠道干细胞的功能和肠上皮细胞稳态。最常见的是二维()和三维()肠道类器官模型,单层细胞培养一直是药物研发的主要手段,但对于某些应用而言,它们并非理想选择,在疾病建模中的作用较小。因此,研究人员多年来一直致力于开发 培养系统,以更好地体现体内细胞反应,包括预测药物反应。肠道类器官模型可以应用于疾
3、病建模、疾病治疗药物的开发、疾病发生机制的研究和营养物质对肠道健康的干预机制研究。总的来说,肠道类器官在基因水平和形态特点上能够很好地模拟患者体内相应的组织,也适用于高通量的药物筛选,同时为疾病的个性化治疗提供了研究模型。本文综述了肠道类器官在疾病建模等领域的应用,重点总结了人、鼠和猪肠道类器官模型的构建方法,以期为肠道类器官模型的构建和应用提供参考。肠道类器官概述 类器官是由多能干细胞(,)和成体干细胞(,)通过模仿组织发育和体内平衡的生化和物理线索而产生的。肠道类器官是由多种肠细胞组成的体外培养模型,具有中空腔花瓣状结构,包含绒毛和隐窝状结构,能够长期自我更新,可稳定低温保存和复苏。等首先
4、提出肠内培养的概念,将肠道类器官定义为体外生长的隐窝和绒毛结构。等将单个 肠上皮干细胞(,)产生的持续扩张的自组织称为类器官。年,等通过体外培养人类,促使其分化为极化的柱状上皮,形成 肠道“类器官”结构,构建了人肠道类器官。等描述了一种稳健的长期 胃肠道培养方法,该系统允许原代胃肠上皮作为具有增殖和多谱系分化的类器官剧烈扩增超过 。年,肠道干细胞联盟根据细胞组织的来源对类器官进行命名,比如,由肠道隐窝分离培养产生的类器官称为肠道类器官;由肝脏干细胞分离培养产生的类器官称为肝脏类器官。在本文中,所有的 动 物 营 养 学 报 卷器官结构都被称为“类器官”,并根据组织位置、种类和组织类型进行分类。
5、体外类器官模型是一个重大的技术突破,已经成为许多基础生物学和临床应用研究的重要工具,类器官同时也被定义为“完全来源于原代组织、胚胎干细胞(,)或诱导性多 能 干 细 胞(,)的体外 细胞簇,具有自我更新和自我组织的能力,并表现出与起源组织相似的器官功能”。事实上,肠道类器官是在 结构中自我组织的细胞簇,再现了其原生组织的主要特征。肠道类器官是一种隐窝绒毛结构,可从成人体内的肠干细胞(,)、或 中提取,具有作为个体化医学和研究平台的潜力。近年来,肠道类器官作为了解肠道环境的体外工具受到了广泛关注。肠道类器官模型的构建 肠道类器官模型的构建关键步骤之一是识别器官组织中的干细胞,这一直是研究中的热点
6、和难点。等在 建立了一个简单的 肠样单层培养系统,能够重现肠上皮和 类器官的许多特性。早期在立体显微镜辅助下的类器官腔内注射方法,操作流程复杂且耗时长,易破坏肠道类器官结构的完整性。而基于插入物中聚碳酸酯半透膜和基质胶涂层的 单层类器官培养体系,既保留了干细胞更新生长效率和肠道类器官结构极性,也使得调控培养基中的生长因子和测定上皮功能更加容易,减少了肠道类器官封闭内腔为试验操作带来的限制。目前最常见是人、鼠、猪肠道类器官模型的构建。在下文中将分别综述人、鼠、猪肠道类器官的构建方法。人、鼠、猪肠道隐窝的分离步骤基本相似,包括组织隐窝的分离、缓冲液的制备、培养基的制备等,但是隐窝分离缓冲液各不相同
7、,人肠道类器官培养用的是冷螯合溶液,鼠和猪肠道类器官培养用的是隐窝提取液。人、鼠、猪肠道类器官培养第 步,截取的肠道组织的长度也有一定差异,鼠肠段取 左右、猪肠段取 左右、人肠段取 左右。肠道类器官培养基与普通细胞培养基具有一定差异,肠道类器官培养基除了包含细胞生长必需的营养物质外,还需添加肠道干细胞增殖分化所必需的生长因子。由于存在种属差异,需要对培养基成分进行调整,在人肠道类器官培养基中需加入、生长因子,在鼠肠道类器官培养基中需要加入表 皮 生 长 因 子(,)、生长因子,在猪肠道类器官培养基中需加入、生长因子。上述生长因子的特定组合构建起人、鼠、猪肠道类器官的培养体系,生长因子的添加是成
8、功培养肠道类器官的关键。人肠道类器官的培养 人肠道类器官的培养步骤主要包括:人肠道组织隐窝的分离、缓冲液的制备、培养基的制备等。参照前人的试验方法,本文总结了人肠道类器官的培养方法,具体步骤如下:)取人肠道组织大约 ,放到有预冷的磷酸盐缓冲溶液()的培养皿中,使用刀片刮掉绒毛,用预冷的 反复冲洗;)将刮掉绒毛的人肠道组织转移到有预冷 的离心管中,用剪子剪成 的碎片,进行冲洗,静置;)弃掉上清液,然后将破碎的组织转移到冷螯合缓冲液含 乙二胺四 乙 酸()、蔗糖、山梨醇、二硫苏糖醇中,盖上盖并密封,将管子以低角度倾斜放置在轨道振动筛上,在 下 振荡 ;)定期检查溶液的浊度,溶液看起来浑浊,没有大团
9、块即可;)用移液管将振荡后的组织移到离心管上的 细胞过滤器上,使用吸管使细胞悬浮液通过过滤器,大的肠道碎片会留在过滤器上;)用 培养基冲洗过滤器,并将溶液转移到 新离心管中,在 下 离心 ;)弃掉上清液,将沉淀重悬于红细胞裂解缓冲液中,并在室温下孵育;)孵育后向细胞溶液中添加 培养基,在 下 离心 ,并抽吸上清液;)用 培养基洗涤沉淀 次,每次洗涤后在 下 离心 ,并抽吸上清液;)在未稀释的基质胶()中重新悬浮最终沉淀,的体积取决于沉淀多少,通常将来自约 组织的沉淀物接种在 中;)取 悬浮液置于预热的 孔板正中间,将 孔板置于细胞培养箱中,让液滴凝固;期邱广志等:肠道类器官模型的构建和应用研究
10、进展)小 心 地 向 每 个 孔 中 添 加 补 充 (含有、补充物等),并将平板放回培养箱,每隔 更换培养基,培养 进行传代。人肠道类器官第 天发育成小圆球状,第 天出现芽孢,第 天芽孢向外突出,形成似肠绒毛形状。鼠肠道类器官的培养 鼠肠道类器官的培养步骤主要包括:鼠肠道隐窝的分离、隐窝提取液的制备、培养基的制备等。参照前人的试验方法,本文总结了鼠肠道类器官的培养方法,具体步骤如下:)将小鼠处死后取 左右肠段,放入 中;)将小肠剪开并用冰冷的 冲洗多次来去除管腔内容物,用盖玻片刮掉绒毛,再用冰冷的 冲洗数遍;)将肠道组织切成 长,放进离心管中,并加入冰冷的 同时用移液管轻轻吹打,重复多次,直
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