基于双树枝状放大效应的免疫传感器对苯并芘的快速检测.doc

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编码：

第十一届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛

作品申报书

作品名称：基于双树枝状放大效应的免疫传感器对苯并芘
的快速检测

学校全称： 华南农业大学

申报者姓名
（集体名称）： 周洁丹 黄溢彬 谢彦 孙子洪 梁柱荣

类别：
Ö自然科学类学术论文
□哲学社会科学类社会调查报告和学术论文
□科技发明制作A类
□科技发明制作B类

2

说 明

1．申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。
2．申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。
3．表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。
4．序号、编码由第十一届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛组委会填写。
5．学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上（文章版面尺寸14.5×22cm），附于申报书后，论文不超8000字，调查报告不超15000字。
6．作品申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一寄送。
7．其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询。

A2申报者情况（集体项目）
说明：1．必须由申报者本人按要求填写；2．申报者代表必须是作者中学历最高者，其余作者按学历高低排列；3．本表中的学籍管理部门签章视为申报者情况的确认。
申报者代表情况
姓名
周洁丹
性别
女
出生年月
1989.12
学校
理学院
系别、专业、年级
应用化学系应用化学专业2007级
学历
本科在读
学制
4
入学时间
2007.9
作品名称
基于双树枝状放大效应的免疫传感器对苯并芘的快速检测
毕业论文题目
丝网印刷电极的研制及应用
通讯地址
华南农业大学理学院应用化学系
邮政编码
510642
办公电话
020-85280325
常住地
通讯地址
华南农业大学五山学生公寓9-216
邮政编码
516042
住宅电话
13480266328
其他作者情况
姓 名
性别
年龄
学历
所在单位
黄溢彬
男
22
本科在读
理学院应用化学系
谢 彦
男
21
本科在读
理学院应用化学系
孙子洪
男
21
本科在读
理学院应用化学系
梁柱荣
男
20
本科在读
理学院应用化学系

资格认定
学校学籍管理部门意见
以上作者是否为2011年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的高等学校中国籍专科生、本科生、硕士研究生或博士研究生。
□是□否 （部门签章）
年 月 日
院、系负责人
或导师意见
本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果。
□是□否
负责人签名：
年 月 日

B1．申报作品情况（自然科学类学术论文）
说明：
1.必须由申报者本人填写；2.本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3.作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写；4.硕士研究生、博士研究生作品不在此列。

作品全称
基于双树枝状放大效应的免疫传感器对苯并芘的快速检测
作
品
分
类
（ E ）A．机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控
制、工程、交通、建筑等）
B．信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等）
C．数理（包括数学、物理、地球与空间科学等）
D．生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健
康、卫生、食品等）
E．能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化
工、生态、环保等）
作品撰写的目的和基本思路
1. 撰写目的：
持久性有机污染物（Persistent Organic Pollutants, POPs）所引起的环境污染是当今备受世界关注的环境问题之一，它正严重地影响着人类的健康与生存。我国POPs的环境污染现状十分严峻，有效地对环境污染物进行检测是治理的前提和基础。因此，建立POPs的快速筛查分析方法显得尤为重要。
电化学免疫传感技术以其高特异性、低成本、操作简便等特点，在病毒、生物毒素、农药、有机污染物等分析领域获得广泛研究。目前真正能用于实际样品中POPs分析的免疫传感方法体系尚未形成，而提高响应灵敏度更是POPs免疫分析研究中的关键步骤。本作品旨在建立苯并芘的快速、灵敏的免疫分析，为POPs的检测提供新手段。

2. 基本思路：
(1) 合成树枝状聚合物PAMAM，并进行核磁、红外等表征，确认结构，虽然这种物质在Sigma等公司可以购买，但是价格非常昂贵，比如3.0 G20%甲醇溶液达到8503/5g，因此选择按照文献采用Mihcael加成和酰胺化方法自行合成；
(2) 制备多环芳烃抗原，试剂公司没有抗原可以购买，因此将半抗原与蛋白进行偶联制得抗原；
(3) 采用反相微乳法合成亚甲基蓝/二氧化硅核壳纳米粒子，并进行紫外、电化学、电镜等各种表征；
(4) 制备多酶标记二抗，并进行表征；
(5) 以三联噻吩的衍生物作为导电聚合物的单体，构建免疫传感器，并对检测条件进行优化；
(6) 基于竞争反应对苯并芘进行检测。

作品的科学性、先进性及独特之处
1. 科学性
持久性有机污染物（Persistent Organic Pollutants, POPs）所引起的环境污染问题是影响世界环境安全的重要因素。根据目前发达国家推进新POPs的时间表和第二次缔约方大会上的动态，新提出的多溴联苯、多溴联苯醚、林丹等十类化学品有可能被列入公约受控名单。然而对于公约中新POPs问题，我国的准备十分不足，基础工作相当薄弱。POPs测量分析技术的研究是开展POPs基础性研究的前提和基础。目前，POPs的测定以色谱法、色质联用等仪器联用技术为主，但是由于大多数POPs极性比较大，需要进行衍生以降低极性，加之POPs的区域分布、迁移转化规律调查涉及到海量样品，色谱分析预处理较复杂，因此，建立POPs的快速筛查分析方法显得尤为重要。电化学免疫传感技术以其高特异性、低成本、操作简便等特点，在病毒、生物毒素、农药、有机污染物等分析领域获得广泛研究，POPs的电化学免疫分析技术也有报道，比如基于酶的苯并芘免疫传感器可以测定3.31-16.56 mM的苯并芘；一次性免疫电极检测多环芳烃，在实际水样中的检测限达0.18 ng/mL。由于POPs在环境中超低含量分布，目前真正能有效地用于实际样品中POPs分析的免疫传感方法体系尚未形成，提高响应灵敏度更是POPs免疫分析研究中的重点。

2. 先进性：
本项目利用了PAMAM特有的树枝状结构，结合分子表面氨基的放大效应，极大地提高了抗原的固定量；同时，以多酶标记二抗复合物代替单标记二抗，以高的HRP/二抗比例与纳米材料偶联，在一个抗体上标记多个HRP酶，再次进行信号放大。由三联噻吩电聚合、PAMAM放大、固定抗原三步制得免疫传感器探针，通过免疫竞争反应、二抗复合物标记、酶促反应实现生物信号到电信号的转化。基于这种抗原固定和二抗检测的“双树枝状放大效应”，开展快速、灵敏、专一检测POPs的免疫传感分析方法的研究。
同时，利用不同的仪器分别对PAMAM和纳米粒子进行表征，以研究其性能特点，选取具有最优性能的物质进行信号放大，优化传感器。结果表明，所构建的传感器能对痕量的POPs产生明显的响应信号，检测限大幅度降低。

作品的实际应用价值和现实意义
POPs在自然环境中很难通过生物代谢、光降解、化学分解等方法进行降解，可以在环境中长期存在，对人体、动物都具有致癌、致畸与致突变作用。近几年，随着农药品种的不断增多，POPs对环境和人类的直接危害正在凸显。因此，能否对苯并芘这类POPs进行有效地分析监测关系到人类的健康与生存。
传统的环境监测通常采用离线、实验室分析方法，分析速度慢、操作复杂、分析仪器大且昂贵，无法进行现场快速分析和连续在线监测，在环境监测上存在着明显不足。因此，对污染物进行连续、快速、在线监测已成为加快污染治理的迫切要求。利用免疫传感器对苯并芘这类POPs进行快速检测，无论从分析成本上看，还是从效率上看，都是非常具有潜力的。同时本项目在免疫传感器的基础上，采用了具有放大信号优势的PAMAM和二抗复合物对传感器作进一步修饰，大大的提高了响应灵敏度，克服了环境样品中苯并芘含量较低、难监测的缺点，为生物技术在环境监测上的应用构建了一个较好的检测体系，对人类与生态环境都具有重要的现实意义。

学

术

论

文

文

摘

持久性有机污染物（POPs）是一类具有环境持久性、生物累积性、长距离迁移能力和高生物毒性的特殊污染物，它已成为全球化学品污染控制的重点对象和全球性环境问题的关注焦点。目前我国POPs的污染问题非常严重，对POPs进行连续、快速监测已成为了加快其污染治理的迫切要求。因此，实现对苯并芘的快速检测显得尤为重要。
本论文采用Mihcael加成和酰胺化缩合反应合成G2.0酰胺-胺树枝状聚合物，通过红外、核磁、热重分析，研究其结构特点，结果表明，G2.0 PAMAM每一分子带有16个氨基，通过戊二醛使其偶联电极表面的聚三联噻吩导电膜，氨基的数目得到放大，这样就可以固定更多的抗原分子；在标记步骤中，采用多标记二抗复合物代替单标记的二抗与抗体结合，以高的HRP/二抗比例与纳米材料偶联，在一个抗体标记多个HRP酶，进行信号放大。由三联噻吩电聚合、PAMAM放大、固定抗原三步制得免疫传感器探针，通过免疫竞争反应、二抗复合物标记、酶促反应实现生物信号到电信号的转化，在放大信号的基础上实现了对低含量苯并芘的快速检测。
作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励
1. Yingju Liu*, Zehao Yang, Yuanwen Zhong. Construction of europium hexacyanoferrate film and its electrocatalytic activity to tyrosine determination. Applied Surface Science, 2010, 256: 3148-3154. (IF 1.616, SCI收录)
2. 钟苑雯, 林谋宏, 周洁丹, 刘英菊*. 铁氰化镨修饰的电化学传感器的研制及其对半胱氨酸的测定. 分析化学, 2010, 38(2): 229-232. (SCI收录)
3. Chunping Wang, Jiedan Zhou, Yibin Huang, Genquan Liang, Yingju Liu*, Hongtao Lei. Portable Benzo[a]pyrene Immunosensor Based on the Polyanline Nanofiber Modified Screen-printed Electrode. 2010 Advanced Polymer Processing (Qingdao) International Forum, 2010,11. (EI 收录)
4. Mouhong Lin, Yingju Liu*, Chuanhe Liu, Zhuohong Yang, Yibin Huang. Sensitive immunosensor for benzo[a]pyrene detection based on dual amplification strategy of PAMAM dendrimer and amino-modified methylene blue/SiO2 core-shell nanoparticles. Biosensor & Bioelectronics, 2011, in press. (IF 5.429, SCI 收录)
5. 黄英强, 黄溢彬, 张胜来, 费世东, 刘英菊. 普鲁士蓝类纳米粒子的合成及其在双氧水检测中的应用. 广东化工, 2010, 37(8): 157-158
鉴定结果

请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录
[1] Yu X, Munge B, Patel V, Jensen G, Bhirde A, Gong J D, Kim S N, Gillespie J, Gutkind J S, Papadimitrakopoulos F, Rusling J F. Carbon nanotube amplification strategies (放大策略) for highly sensitive immunodetection of cancer biomarkers. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128: 11199-11205.
[2] Mani V, Chikkaveeraiah B V, Patel V, Gutkind J S, Rusling J F. Ultrasensitive immunosensor for cance biomarker proteins using gold nanoparticle film electrodes and multienzyme-particle amplification(多酶标记). ACS nano, 2009, 3(3): 585-594.
[3] Du D, Zou Z, Shin Y, Wang J, Wu H, Engelhard M H, Liu J, Aksay I A, Lin Y. Sensitive immunosensor for cancer biomarker based on dual signal amplification strategy (双放大效应) of graphene sheets and multienzyme functionalized (多酶标记) carbon nanospheres. Anal. Chem., 2010, 82, 2989-2995.
申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）
(1) 申报论文1篇；
(2) 发表相关论文5篇的首页；
(3) 此工作是一个延续性的工作，均由本科生完成；
(4) 申请者于2009.12被评为“理学院科技之星”（全院共10名）；
(5) 此工作的后续工作由“红满堂计划”黄溢彬、谢彦同学继续，为广东省大学生实验创新项目的一部分。
科研管理
部门签章

年 月 日

C.当前国内外同类课题研究水平概述
说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写；
2.填写此栏有助于评审。
持久性有机污染物（Persistent Organic Pollutants, POPs）所引起的环境污染问题是影响世界环境安全的重要因素[1]。研究表明，POPs污染的严重性和复杂性远远超过常规环境污染物，主要表现在：(1) POPs具有很强的亲脂憎水性，可以沿食物链逐级放大，存在于大气、水、土壤中的低浓度POPs通过食物链对处于最高营养级人类的健康造成严重损害；(2) POPs具有半挥发性，能在大气环境中长距离迁移，并通过所谓的“全球蒸馏效应”和“蚱蜢跳效应”沉积到地球的偏远极地地区，导致全球范围的污染传播[2]。一旦发生重大污染事件或出现恶性病变，会产生灾难性后果，严重影响经济和社会的稳定[3]。
我国POPs的环境污染现状十分严峻，包括土壤污染、水污染、大气污染等。POPs包括滴滴涕、六六六、七氯、狄氏剂、艾氏剂、异狄氏剂、灭蚁灵和毒杀芬等。农业在中国经济中占据着相当重要的地位，中国曾大量生产和使用过滴滴涕、毒杀芬、六氯苯、氯丹和七氯等5种POP s农药[4]。中国长江流域、珠江流域、湘江流域等地区水网丰富，处于江河入海口，属于白蚁和疟疾等疾病的多发地区，还曾经是血吸虫病的发病地区。残留在土壤中的POPs农药还可通过地表径流和干湿沉降进入河网，对河流和海洋的水体、沉积物以及水生生物产生一定的影响[5]。
为加强对POPs的控制，我国政府已于2001 年5月签署了就控制12 种POPs的国际公约—《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》。2007年，国务院批准了由国家环保总局会同外交部、发改委、科技部、财政部等13个相关部门组织编制的《中国履行〈关于持久性有机污染物(POPs)的斯德哥尔摩公约〉国家实施计划》。该实施计划明确指出POPs 在环境中迁移和转化规律的研究对人类健康、环境、社会、经济和文化的重要意义，因此开发可以替代、减少和/或消除POPs 排放的产品/技术和测量分析技术也成了亟需的任务，以此来加强POPs 在人体的蓄积和放大、及在生物体和人体暴露的研究，进一步研发POPs降解和去除机制。
POPs测量分析技术的研究是开展POPs基础性研究的前提和基础。目前，POPs的测定以色谱法、色质联用等仪器联用技术为主[6, 7]，但是由于大多数POPs极性比较大，需要进行衍生以降低极性，加之POPs的区域分布、迁移转化规律调查涉及到海量样品，色谱分析预处理较复杂，因此，建立POPs快速筛查分析方法显得尤为重要。
电化学免疫传感技术以其高特异性、低成本、操作简便等特点，在病毒、生物毒素、农药、有机污染物等分析领域获得广泛研究 [8, 9]。在电化学免疫传感器的研制中，免疫传感器的灵敏度取决于抗原在基底电极的固定量和固定过程的稳定性。因此，提高灵敏度，需要提高生物大分子的固定量。其次，在免疫传感器的研制中，免疫传感器的灵敏度还取决于响应信号的检测机制。在电化学免疫传感器中，响应信号通常是基于酶标抗体或二抗固定后基于酶对底物的响应进行检测，因此，提高灵敏度，需要提高酶的固定量。通过碳纳米管、量子点、纳米铂等纳米材料将酶标抗体或二抗与相应的酶按一定比例进行结合(即多酶标记)，再利用固定的酶进行检测，可对电流信号进行放大[10,11]。多酶标记的信号放大效果非常明显，但是酶的活性却因为与纳米材料的结合而显著下降。因此，选择生物相容性的纳米材料形成多酶标记物是免疫传感器研究的发展趋势。
本论文采用Mihcael加成和酰胺化缩合反应合成G2.0酰胺-胺树枝状聚合物，通过红外、核磁、热重分析，研究其结构特点，结果表明，G2.0 PAMAM每一分子带有16个氨基，通过戊二醛使其偶联电极表面的聚三联噻吩导电膜，氨基的数目得到放大，这样就可以固定更多的生物分子；在标记步骤中，采用具有生物相容性的二氧化硅多标记二抗复合物代替单标记的二抗，在一个抗体标记多个HRP酶，进行信号放大。由三联噻吩电聚合、PAMAM放大、固定抗原三步制得免疫传感器探针，通过免疫竞争反应、二抗复合物标记、酶促反应实现生物信号到电信号的转化，在放大信号的基础上实现了对低含量苯并芘的快速检测。

参考文献：
[1] 中国履行斯德哥尔摩公约系列研究丛书. 中国环境科学出版社, 2008.
[2] Wang Y W, Li X M, Li A, Wang T, Zhang Q H, Wang P., Fu J J, Jiang G B. Effect of municipal sewage treatment plant effluent on bioaccumulation of polychlorinated biphenyls and polybrominated diphenyl ethers in the recipient water. Environ. Sci. Technol. 2007, 41: 6026-6032.
[3] Imaeda D, Kunisue T, Ochi Y, Iwata H, Tsydenova O, Takahashi S, Amano M, Petrov E A., Batoev V B. and Tanabe S. Accumulation features and temporal trends of PCDDs, PCDFs and PCBs in Baikal seals (Pusa sibirica). Environ. Pollut. 2009, 157: 737-747.
[4] 彭丹, 曾光明, 陈耀宁, 喻曼, 胡霜. 白腐真菌生物技术降解氯酚污染物. 生态学杂志, 2007, 26(10): 1657-1664.
[5] Guan Y F, Wang J Z, Ni H G, Zeng E Y. Organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls in riverine runoff of the Pearl River Delta, China: Assessment of mass loading, input source and environmental fate. Environ. Pollut., 2009, 157: 618-624.
[6] Panu R, Hannu K, Lars R, Anna R, Terttu V. A simple and fast liquid–liquid extraction method for the determination of 2,2′,4,4′,5,5′-hexachlorobiphenyl (CB-153) and 1,1-dichloro-2,2-bis (p-chlorophenyl)-ethylene (p,p′-DDE) from human serum for epidemiological studies on type 2 diabetes. J. Chromatogra. A, 2009, 1216: 897-901.
[7] Wang X, Luo L, Ouyang G, Lin L, Tam N F Y, Lan C, Luan T. One-step extraction and derivatization liquid-phase microextraction for the determination of chlorophenols by gas chromatography–mass spectrometry. J. Chromatogra. A, 2009, 1216(35): 6267-6273
[8] Zhang J, Lei J, Xu C, Ding L, Ju H X. Carbon nanohorn sensitized electrochemical immunosensor for rapid detection of microcystin-LR. Anal. Chem., 2010, 82 (3): 1117–1122.
[9] Jiang X, Li D, Xu X, Ying Y, Li Y, Ye Z, Wang J. Immunosensors for detection of pesticide residues Biosens. Bioeletron., 2008, 23(11): 1577-1587.
[10] Du D, Zou Z, Shin Y, Wang J, Wu H, Engelhard M H, Liu J, Aksay I A, Lin Y. Sensitive immunosensor for cancer biomarker based on dual signal amplification strategy of graphene sheets and multienzyme functionalized carbon nanospheres. Anal. Chem., 2010, 82, 2989-2995.
[11]Xu W H, Yu S H. Conducting performance of individual Ag@C coaxial nanocable: ideal building blocks for interconnects in nanoscale devices. Small, 2009, 5(4): 460-465.

D.推荐者情况及对作品的说明
说明：1．由推荐者本人填写；2．推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组 集体推荐亦可）；3．推荐者填写此部分，即视为同意推荐；4．推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。
推荐者情况
姓 名
孙远明
性别
男
年龄
55
职称
教授
工作单位
华南农业大学食品学院
通讯地址
华南农业大学食品学院
邮政编码
510642
单位电话
020-85280266
住宅电话
020-85283448
推荐者所在
单位签章
孙远明老师是华南农业大学食品学院院长、教授、博士生导师，从事免疫分析研究。
（签章） 年 月 日
请对申报者申报情况
的真实性作出阐述
该作品基于双树枝状放大效应的免疫传感器对苯并芘进行快速检测，设计科学，图片、数据准确，结论真实可靠。
请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价
苯并芘属于小分子，在环境样品中的含量极少，现有的检测技术的检测限都比较高且检测费用比较昂贵，而本作品构建基于树枝状放大效应的免疫传感器，利用了PAMAM和二抗复合物的双重放大效应，对苯并芘进行了快速检测，有效地降低了检测限。项目方案设计合理，数据真实可靠，已发表多篇相关SCI、EI收录论文，其中一篇IF=5.4，具有较高的应用价值和应用前景。
其它说明

推荐者情况
姓 名
倪春林
性别
男
年龄
45
职称
教授
工作单位
华南农业大学理学院应用化学系
通讯地址
华南农业大学理学院应用化学系
邮政编码
510642
单位电话
020-85282568
住宅电话
020-38842096
推荐者所在
单位签章
倪春林老师是华南农业大学理学院副院长、教授、研究生导师，从事无机配合物研究。
（签章） 年 月 日
请对申报者申报情况
的真实性作出阐述
该作品设计合理，图片、数据来源可靠，研究方案切实可行，结论真实合理。
请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价
苯并芘作为POPs中具有代表性的一种污染物，由于其持久性，生物富集性和长距离传输的特性，引起人们的广泛重视。因此，对其进行检测分析这项基础工作显得尤为重要。本作品具有较好的理论基础，构思巧妙，创新性强，技术方案设计合理，部分研究成果已经在相关期刊上发表SCI、EI收录论文。因此本作品在创新性、实用性及应用前景等方面均达到较高的水平。
其它说明

学校组织协调机构确认并盖章

（团委代章） 年 月 日
校主管领导或校主管部门确认盖章

年 月 日
E．大赛组织委员会秘书处资格和形式审查意见

组委会秘书处资格审查意见

审查人（签名）
年 月 日
组委会秘书处形式审查意见

审查人（签名）
年 月 日
组委会秘书处审查结果

□合格 □不合格
负责人（签名）
年 月 日

F．参赛作品打印处
基于双树枝状放大效应的免疫传感器对
苯并芘的快速检测
周洁丹 黄溢彬 谢彦 孙子洪 梁柱荣
指导老师：刘英菊 副教授
（华南农业大学理学院，广州，510642）
摘 要：制备了各代聚酰胺-胺(PAMAM)化合物。以反相微乳法制备粒径约为50 nm的亚甲基蓝/二氧化硅核壳纳米粒子，并使用硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)对核壳纳米粒子进行改性，使粒子表面氨基化，并对其进行电子透射电镜(TEM)和Zeta电位测试的表征。同时，制备的核壳纳米粒子与高比例的辣根过氧化物酶(HRP)/HRP-标记二抗偶联，从而实现二抗的多标记。接着，在金电极表面电聚合一层三联噻吩导电聚合膜，再通过戊二醛以PAMAM对电极表面的抗原固定位点进行放大。通过PAMAM修饰的电极可以极大地提高抗原分子的固定量。对抗原抗体稀释比、免疫反应孵育时间、检测体系pH值进行优化后，对苯并芘（BaP）进行了抑制竞争检测。

关键词：PAMAM 纳米粒子 免疫传感器 苯并芘

1 引言
持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants, POPs)是一类具有长期残留性、生物累积性、半挥发性和高毒性，并通过各种环境介质(大气、水、生物等)能够长距离迁移对人类健康和环境具有严重危害的天然的或人工合成的有机污染物[1]。杀虫剂类POPs作为《斯德哥尔摩公约》首批的12 种POPs物质中的绝大多数, 也是目前土壤污染的主要污染物之一，做好他们的污染场地的污染控制对于减少 POPs 污染场地的进一步危害具有实质意义和指导作用[2,3]。目前环境生态系统承载着环境中超痕量的持久性有机污染物这一重要压力，其长期，低剂量暴露下对生物的毒害作用[4]，以及通过食物链放大的生物富集效应是环境化学领域研究的热点，其中，POPs分析检测技术的研究是开展POPs基础性研究的前提和基础。但当今国际上大部分的检测技术的检测限都偏高，且检测费用较高，未能适应我国的国情，无法满足实际环境监测的需求。另一方面，POPs多是小分子，而且在环境样品中的含量极低，这也限制着POPs的分析检测。
免疫传感器的原理是基于抗原抗体的特异性结合，具有选择性好、检测限低、灵敏度高的优点[5]。由于免疫传感器是由高度特异性的抗原抗体作为识别元件，选择性好，灵敏度高，不需要进行样品的预处理，样品中被测组分的分离和检测同时完成。检测一对抗原抗体的相互作用通常用时不到l h。在检测过程中，电极系统将电化学反应直接转换成电信号，可以观察到生物分子间相互作用的结果，可以实现连续、实时、自动化检测分析。所而且近年来与快速发展的微机电技术相结合的微型生物传感器以成本低、易携带、多功能等特点在环境监测领域内异常活跃[6]，具有重要的科学意义和社会经济效益。
多环芳烃苯并芘是极具生物毒性和环境危害的一种POPs[7-8]。本项目以苯并芘作为研究对象构建免疫传感器的研究，利用亚甲基蓝/二氧化硅核壳纳米粒子[9]特殊的优异性能以及PAMAM[10]独具的树枝状结构，分别从传感界面和信号标记两个方面同时进行信号放大，构建了痕量苯并芘检测的免疫传感器，有效地降低了检测限，对POPs的检测起到了积极作用。
2 实验部分
2.1 试剂和仪器
所有的化学试剂除特别规定的外都为分析纯。多环芳烃抗体(鼠抗)和HRP标记二抗(羊抗鼠)购自Santa Cruz，辣根过氧化物酶购自上海博奥，戊二醛，3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，亚甲基蓝(MB)购自百灵威化学试剂有限公司，正硅酸乙酯(TEOS)购自天津市大茂化学试剂厂。2-氨基-5,2':5'2''-三联噻吩由本学院杨卓鸿老师提供。
仪器：磁力搅拌器、高速冷冻离心机、KQ-50B型超声波清洗器、FEI-Tecnai 12分析型透射电子显微镜、ZS Nano S马尔文Zata电位分析仪、差热热重仪(DTG-60)、AVATAR360 FT-IR型红外光谱仪、Mercury-Plus 300核磁共振波谱仪。电化学实验均在上海辰华CHI660C电化学工作站上进行，采用三电极系统，工作电极为直径2 mm的金电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为金属铂电极。

2.2 实验步骤
2.2.1 PAMAM的制备
氮气保护下，将12 g乙二胺和40 g甲醇加入到带有磁力搅拌子、回流冷凝管的三口烧瓶中，冰盐浴搅拌条件下，采用滴液漏斗以每秒一滴的速度滴加137.6 g丙稀酸甲酯，滴加完成后继续搅拌半小时，撤去冰盐浴，在室温下反应24 h。反应完成后在50 °C下旋转蒸发，至质量恒重，以除去溶剂甲醇和过量的丙烯酸甲酯。
氮气保护下，将40.4 g 上述旋蒸产物和64 g甲醇加入到有磁力搅拌子、回流冷凝管的三口烧瓶中，室温搅拌条件下，采用滴液漏斗以每秒一滴的速度滴加240 g乙二胺，滴加完成后继续搅拌半小时，撤去冰盐浴，反应24 h。反应完成后在72 °C下旋转蒸发，至质量恒重，以除去溶剂甲醇和过量的乙二胺，最后得到0代PAMAM亮黄色粘稠液体。其反应方程式如下：

通过不断重复上述反应式中的Mihcael加成和酰胺化缩合反应步骤，即可得到不同代数(即不同末端基团和相对分子质量)的PAMAM型大分子化合物 [11-15] 。

2.2.2 亚甲基蓝/二氧化硅核壳纳米粒子的制备
室温下，在50 mL塑料烧杯中加入7.5 mL环己烷、1.77 g Triton X-100 和1.6 mL正己醇。在磁力搅拌下缓慢滴加200 μL二次蒸馏水。5 min后加入60 μL 10-2 M亚甲基蓝溶液，搅拌30 min后，加入80 μL TEOS，最后加入80 μL氨水，搅拌反应24小时。离心分离，分别用乙醇和二次水多次洗涤，直到离心后上清液无色。产品分散在无水乙醇中，保存。

2.2.3 核壳纳米粒子的氨基化
将适量上一步产物分散在15 mL无水乙醇中，加入20 μL APTES，搅拌反应10小时。离心分离，分别用乙醇和二次水多次洗涤，直到离心后上清液无色。

2.2.4 二抗复合物(二抗-纳米SiO2-HRP)的制备
将一定量(约1.5 mg)的纳米粒子加入2 mL PBS(pH7.0)缓冲液，超声分散30 min。然后与1 mL 0.25%戊二醛溶液混合，在室温下搅拌1 h。15000 rpm离心分离15 min，用PBS缓冲液反复冲洗数次。产品分散在1 mL PBS(pH 7.4)缓冲液中，并加入1 mL二抗和HRP的混合液(二抗浓度为0.005 mg/mL，HRP浓度为1 mg/mL)，4 °C下搅拌过夜。产品在4 °C、15000 rpm下离心15 min，反复用1 m