QuEChERS结合高效液相色谱-串联质谱法测定牛肉中甲拌磷及其代谢物残留.pdf

Pesticide Science and Administration 2023,44(7)农药研究Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Qu u u u u u u u u u u u u uE E E E E E E E E E E E E EC C C C C C C C C C C C C Ch h h h h h h h h h h h h hE E E E E E E E E E E E E ER R R R R R R R R R R R R RS S S S S S S S S S S S S S 结结结结结结结结结结结结结结合合合合合合合合合合合合合合高高高高高高高高高高高高高高效效效效效效效效效效效效效效液液液液液液液液液液液液液液相相相相相相相相相相相相相相色色色色色色色色色色色色色色谱谱谱谱谱谱谱谱谱谱谱谱谱谱-串串串串串串串串串串串串串串联联联联联联联联联联联联联联质质质质质质质质质质质质质质谱谱谱谱谱谱谱谱谱谱谱谱谱谱法法法法法法法法法法法法法法测测测测测测测测测测测测测测定定定定定定定定定定定定定定牛牛牛牛牛牛牛牛牛牛牛牛牛牛肉肉肉肉肉肉肉肉肉肉肉肉肉肉中中中中中中中中中中中中中中甲甲甲甲甲甲甲甲甲甲甲甲甲甲拌拌拌拌拌拌拌拌拌拌拌拌拌拌磷磷磷磷磷磷磷磷磷磷磷磷磷磷及及及及及及及及及及及及及及其其其其其其其其其其其其其其代代代代代代代代代代代代代代谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢谢物物物物物物物物物物物物物物残残残残残残残残残残残残残残留留留留留留留留留留留留留留梁景文,朱国柱,罗泽君,姜学涯,苑婷婷(深圳凯吉星农产品检测认证有限公司,广东 深圳 518000)收稿日期：2023-7-11作简介：梁景文，男，工程师，主要从事食品质量安全检测分析研究。联系电话：[phone]；E-mail：liangjw229 。Determination of Phorate and its Metabolites Residues in Beef Using QuEChERS Combined With HPLC-MS/MSLiang Jingwen,Zhu Guozhu,Luo Zejun,Jiang Xueya,Yuan Tingting(Shenzhen Care-green Agri-culture Products Testing&Certification Co.,Ltd.,Shenzhen Guangdong 518000,China)Abstract:This study aims to establish a method for the determination of phorate,phorate sulfone and phorate sulfoxide in beef using QuEChERS combined with high performance liquid chromatogra-phy-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The beef sample was mixed with acetonitrile containing 1%acetic acid,frozen at-18 for 30 min,and then subject to QuEChERS extraction.After centrifugation,the supernatant underwent further purification with a QuEChERS clean-up kit and vortex centrifugation before being injected into HPLC-MS/MS for analysis.Under optimized conditions,phorate and its metabolites exhibited good linear relationships within the range of 10200 ng/mL.The method demonstrated satisfactory recoveries ranging from 77.2%93.5%,with relative standard deviations of 1.8%6.2%.This method offers simplicity,speed,reliability,low limit of detection,and high sensitivity,providing a valuable reference for the determination of phor-ate and its metabolites residues in beef.Key words:QuEChERS;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;beef;phorate and its metabolites;residues摘 要:建立了一种测定牛肉中甲拌磷、甲拌磷砜和甲拌磷亚砜残留量的 QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)方法。样品中加入含 1%乙酸的乙腈溶液提取分离,-18冷冻放置,再加入 QuEChERS 盐包,离心后取上层清液于 QuEChERS 净化管中,涡旋离心后,上清液供 HPLC-MS/MS 测试分析。在最优的条件下,甲拌磷及其代谢物在 10200 ng/mL 范围内线性关系良好,方法平均回收率为 77.2%93.5%,精密度为 1.8%6.2%。该方法简单、快速、可靠,线性关系良好,检出限低,灵敏度高,可用于牛肉中甲53农药研究 Pesticide Science and Administration 2023,44(7)拌磷及其代谢物残留测定。关键词:QuEChERS;高效液相色谱-串联质谱法;牛肉;甲拌磷;残留 中图分类号:S482.3;S481+.8文献标识码:A文章编号:1002-5480(2023)7-35-6引 言甲拌磷是上世纪 50 年代由美国氰胺公司开发研制的一种高效有机磷杀虫剂,因其高性价比特性而被广泛用于害虫防治方面1。在自然条件下,甲拌磷经过氧化反应会代谢为甲拌磷砜和甲拌磷亚砜2。由于甲拌磷及其代谢物的高毒性,对人体伤害大,已被国家禁用,农业农村部公告第 536 号3自 2022 年 9 月 1 日起,撤销甲拌磷原药及制剂产品的农药登记,禁止生产。目前我国农药最大残留限量标准 GB 27634规定肉类中甲拌磷的限量为 0.02 mg/kg,其检测方法参照 GB/T 232105规定的方法测定,而GB/T 23210 适用于牛奶和奶粉中农药的测定,并不适用于肉类中农药的测定。因此针对营养丰富备受人们喜爱的牛肉这一食用农产品,建立一种甲拌磷及其代谢物残留量的检测分析方法具有重要的实际应用价值。目前检测甲拌磷及其代谢物的主要方法有:荧光光度法6、气相色谱法7、气相色谱-串联质谱法8、液相色谱法9、液相色谱-串联质谱法10等。其中荧光光度法、气相色谱法和液相色谱法存在基质干扰较大,灵敏度低等缺点,气相色谱-质谱法和气相色谱-串联质谱法存在前处理繁琐,检测时间较长等缺点。目前我国尚未发布有关牛肉中甲拌磷及其代谢物检测方法的相关标准,因而急需建立一种实用且快速检测牛肉中甲拌磷及其代谢物的分析方法,满足食品安全国家标准的限量规定以及行业的诉求。本研究采用 QuEChERS 技术同时结合高效液相色谱-串联质谱方法,开发一种适用于牛肉中甲拌磷及其代谢物的检测方法。1 材料与方法1.1 仪器、试剂与材料 AB SCIEX QUAD 5500液相色谱-串联质谱联用仪;离心机;Millipore Q 纯水机;MS 3 basic 旋涡振荡器;移液枪;QuEChERS 盐包、QuEChERS 净化管、0.22 m有机滤膜;牛肉样品。甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜(纯度98%);甲醇、乙腈(色 谱 纯);甲 酸、乙 酸(分析纯);乙酸铵(分析纯)。1.2 实验方法1.2.1 标准溶液配制 标准储备溶液:分别准确称取甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜各 10.0 mg,用甲醇溶解并稀释至 100 mL,摇匀,制成质量浓度为 100 g/mL 标准储备溶液,-18避光保存,有效期 3 个月。混合标准中间溶液:分别准确吸取甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜标准储备溶液各 1 mL,用甲醇稀释至 10 mL,摇匀,制成 10 g/mL 的混合标准中间溶液,再次准确吸取 10 g/mL 的混合标准中间溶液 1 mL,用甲醇稀释至 10 mL,摇匀,制成 1 g/mL 的混合标准中间溶液,0 4避光保存,有效期 1 个月。混合标准工作溶液:分别准确吸取 10、20、50、100、200 L 上述 1 g/mL 的混合标准中间溶液,用甲醇稀释至 1 mL,得到质量浓度分别为 10、20、50、100、200 ng/mL 的标准工作曲线,临用现配。1.2.2 样品前处理 称取 10 g(精确至 0.01 g)制备好的试样置于 50 mL 离心管中,加入 20 mL 含 1%乙酸的乙腈溶液提取分离,-18 冷冻放置 20 min;加入 QuEChERS 盐包迅速振摇至不发热,5 000 r/min 离心 2 min。取上层液 6 mL63 Pesticide Science and Administration 2023,44(7)农药研究至 15 mL 的 QuEChERS 净化管中,涡旋 3 min;5 000 r/min 离心 2 min,上清液供分析。1.2.3 液相色谱条件色谱柱:Inertsil ODS-3(2.1 mm150 mm,3 m),柱温:40;流动相 A:10 mmol/L 乙酸铵(加 0.1%甲酸)溶液;流动相 B:甲醇;流速:0.3 mL/min;进样体积:5.0 L;梯度洗脱程序(表 1)。表 1 梯度洗脱程序时间(min)A(%)B(%)09010590105.01595105951290101590101.2.4质谱条件 离子源:电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI);扫描模式:正离子模式;电离电压:5 500 V;雾化温度:550;喷雾气:50 psi;辅助加热气:50 psi;检测模式:多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM);甲拌磷及其代谢物定性定量离子对及去簇电压、碰撞能量(表 2)。表 2 甲拌磷及其代谢物定性定量离子对及去簇电压、碰撞能量分析物母离子(m/z)子离子(m/z)去簇电压(V)碰撞能量(eV)甲拌磷26175,475121,53甲拌磷砜29397,1156550,35甲拌磷亚砜277199,1532513,19 注:为定量离子对。2 结果与分析2.1 仪器工作条件的选择2.1.1 色谱条件液相色谱串联质谱法测定食品中多农残时常用含无机酸的无机盐溶液和甲醇溶液作为流动相11,经过多次试验,选择的流动相见1.2.3 节,在此条件下,甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜均能得到有效分离,且色谱峰峰形良好。2.1.2质谱条件甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜属 于 磷 酸 酯 类 小 分 子 农 药,分 子 量 为260.38、276.37、292.38,因此本试验采用传统的小分子质谱离子对优化方法电离其碎片离子对。通过优化去簇电压和碰撞能量,得到甲拌磷及其代谢物响应最佳的一对离子对用于定性定量分析(表 2),其中甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜的母离子均带单电荷。2.2 前处理条件的选择2.2.1 萃取溶剂的优化由于牛肉中含有丰富的蛋白质,在进行上机检测前需要去除蛋白,而甲拌磷及其代谢物的极性较强,易溶于甲醇、乙腈等有机溶剂,同时有机溶剂具有使牛肉中的蛋白质变性发生沉淀的效果12,因此本试验考察甲醇和乙腈作提取试剂进行分析。结果表明:当选择乙腈作为提取试剂,待测牛肉中蛋白质去除的效果较好,但是甲拌磷及其代谢物的提取效率不高,而当选择含有 1%乙酸的乙腈溶液作为提取试剂时,不仅牛肉蛋白质去除效果较好,且提取效率75%,这是因为甲拌磷及其代谢物在酸性条件下稳定不易分解。因此本试验选择含有 1%乙酸的乙腈溶液作为提取试剂。2.2.2 净化方法的优化QuEChERS 样品前处理方法,具有操作简便、处理速度快且溶剂消耗量少等优点,已被广泛应用于食品、环境和土壤污染物检测中13,14。因此本试验采用高效的 QuEChERS 萃取盐包及净化管,通过简单的离心操作,将甲拌磷及其代谢物与牛肉样品中的干扰组分(如脂肪酸、色素、脂类等)分离。QuEChERS 萃取盐包中 MgSO4用于除去样品中的水分,其他缓冲盐可调节样品溶液 pH 值,确保对碱性敏感的农药也有较好的回收率。由于加入萃取盐包后会放出大量热,导致甲拌磷及其代谢物分解,因此需在-18冷冻放置 20 min后再加入盐包迅速振摇至不发热,这样可以确73农药研究 Pesticide Science and Administration 2023,44(7)保提高甲拌磷及其代谢物的回收率。2.3 方法学考察2.3.1基质效应分别用空白样品溶液和含1%乙酸的乙腈溶液配制的 10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL 混合标准溶液制作标准曲线,以各标准曲线斜率比值与 1 的差值作为基质效应值15,以考察基质效应,结果(表 3)。表 3 甲拌磷及其代谢物的基质效应农药基质效应值甲拌磷-0.874甲拌磷砜-0.926甲拌磷亚砜-0.905由表 3 可知:牛肉基质对甲拌磷及其代谢物存在较强的基质抑制效应,为了降低基质的影响,试验采用基质匹配的混合标准溶液制作标准曲线。2.3.2 线性范围、检出限和定量限准确移取1 g/mL 适量甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜的混合标准溶液,添加到 10.00 g 空白样品中,浓度为 10、20、50、100、200 ng/mL 的各系列空白添加试料,在上述液相色谱和质谱条件下测定,以峰面积为纵坐标 Y,化合物浓度为横坐标 X,绘制标准曲线。研究结果表明,甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜在质量浓度 10200 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数 r 为 0.998 80.999 5,检出限为 3 ng/mL,定量限为 10 ng/mL,标准色谱图(图 1)。图 1 甲拌磷及其代谢物标准色谱图83 Pesticide Science and Administration 2023,44(7)农药研究表 4 甲拌磷及其代谢物的线性方程、相关系数、检出限及定量限化合物线性方程相关系数/r检出限(ng/mL)定量限(ng/mL)甲拌磷Y=3.58104X+1.411050.998 9310甲拌磷砜Y=3.57104X+2.441050.998 8310甲拌磷亚砜Y=9.98104X+8.881050.999 53102.3.3 回收率和精密度选取空白样品,分别添加 3 个浓度水平的标准溶液,每个浓度水平制备 6 个平行样品进行添加回收率,在添加浓度范围内,甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜的回收率为 77.2%93.5%,相对标准偏差为 1.8%6.2%,能够满足检测方法的要求,结果(表 5)。表 5 精密度和回收试验结果(n=6)基质化合物添加量(g/kg)测定平均值(g/kg)平均回收率(%)RSD(%)牛肉甲拌磷甲拌磷砜甲拌磷亚砜107.7877.84.22018.793.52.810093.293.24.3107.7277.23.72018.190.52.810088.988.93.5109.1691.66.22017.688.01.810086.986.92.82.4 实际样品测定采用本研究建立的方法检测深圳农贸市场购买的 20 个牛肉样品,其中甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜均未检出。3 结论本研究建立了 QuEChERS 技术同时结合高效液相色谱串联质谱法测定牛肉中甲拌磷及其代谢物残留的分析方法,甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜在质量浓度 10200 ng/mL 范围内线性关系良好,检出限为 3 ng/mL,定量限为 10 ng/mL。本方法快速、准确、灵敏度高,能够满足国家标准规定的牛肉中甲拌磷及其代谢物残留限量的检测要求。参考文献1 陈永平,付志茹,韩现芹等.超高效液相色谱-串联质谱法测定水中甲拌磷及其代谢物残留量 J.食品安全质量检测学报,2021,12(01):168-174.2 孙明娜,余璐,王雯雯等.QuEChERS-液质联用法同时测定农产品中 3 种农药及其代谢物残留 J.安徽农业科学,2019,47(18):211-214.3 农业农村部.中华人民共和国农业农村部公告第 536 号.2022-3-16.4 GB 2763-2021 食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量 S.5 GB/T 23210-2008 牛奶和奶粉中 511 种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法 S.6 张明丽,董学芝,张国胜等.钙黄绿素-钯()荧光光度法测定土壤中甲拌磷残留 J.分析科学学报,2008(05):583-585.7 余苹中,戴荣彩,贺敏等.气相色谱测定土壤中甲拌磷及其代谢物甲拌磷砜 J.湖南农业大学学93农药研究 Pesticide Science and Administration 2023,44(7)报(自然科学版),2008,34(06):732-734.8 潘春燕,和佳鸳,尹国浩等.QuEChERS-气相色谱-串联质谱法同时测定茶叶中 11 种不同类别农药残 留 J.江 苏 预 防 医 学,2019,30(06):601-604.9 谢洪学,何丽君,伍艳等.基于离子液体的液相微萃取-高效液相色谱法测定水中有机磷农药 J.分析化学,2007,35(02):187-190.10 张璇,王娜娜,马瑞莹等.高效液相色谱-质谱联用仪测定食用菌中甲胺磷、乙酰甲胺磷、甲拌磷及其衍生物等 5 种有机磷农药残留量 J.农药科学与管理,2022,43(04):53-60.11 韩梅,焦颖,邱世婷等.超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨串联质谱法测定菜田土壤中甲拌磷及其代谢物残留量 J.理化检验(化学分册),2021,57(11):1005-1010.12 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