基因工程制药专家讲座.pptx

第三章 基因工程制药 一、一、基因工程药品基因工程药品 二、二、基因工程制药基本技术基因工程制药基本技术 三、三、基因工程制药实例基因工程制药实例基因工程制药第1页作业作业作业作业 查阅资料，准备查阅资料，准备查阅资料，准备查阅资料，准备pptppt、课程论文介绍某种、课程论文介绍某种、课程论文介绍某种、课程论文介绍某种基因工程药品生产工艺。基因工程药品生产工艺。基因工程药品生产工艺。基因工程药品生产工艺。基因工程制药第2页一、基因工程药品 1982年第一个基因重组产品人胰岛素在美国Eli Lilly企业问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品，迄今累计已经有近30种基因工程药品投入市场，产生了巨大社会效益和经济效益。基因工程制药第3页基因工程技术可生产药品和制剂包含：（1）免疫性蛋白：如各种抗原和单克隆抗体；（2）细胞因子：如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子；（3）激素：如胰岛素、生长激素、心素纳；（4）酶类：如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。基因工程制药第4页 主要基因工程产品研制、开发、上市时间主要基因工程产品研制、开发、上市时间主要基因工程产品研制、开发、上市时间主要基因工程产品研制、开发、上市时间产品产品时间时间国家国家用途用途上市上市时间时间国家国家人生长激素释放抑制素人生长激素释放抑制素(SRM)1977日本日本巨人症巨人症人胰岛素（人胰岛素（Insulin）1978美国美国糖尿病糖尿病1982欧洲欧洲人生长激素（人生长激素（HGH）1979美国美国侏儒症侏儒症1985美国美国人人-干干扰扰素（素（IFN）1980美国美国病毒病毒1985欧洲欧洲乙肝疫苗（乙肝疫苗（HBsAgV）1983美国美国乙肝乙肝1986欧洲欧洲人白细胞介素（人白细胞介素（HIL）1984美国美国肿瘤肿瘤1989欧洲欧洲人促红细胞生成素（人促红细胞生成素（EPO）日本日本贫血贫血1988欧洲欧洲人粒细胞集落刺激因子人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)白血病白血病1991美国美国人组织纤溶酶原激活剂（人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）血栓症血栓症1987 美国美国基因工程制药第5页美国已同意了56种生物制剂部分摘录（1）产品 企业 主要适应症-人胰岛素Eil Lilly 糖尿病人生长激素 Eil Lilly 儿童生长激素缺乏症&2a干扰素 Hoffmann-La Rocke 白血病a-2b干扰素 Schering-Plough 白血病、爱滋病、肝炎小鼠抗CO3单抗Ortho Biotech 肾、心移植排斥反应乙肝疫苗MSDMerck 乙型肝炎t-pA（altepl-ase）Genentech 急性心肌梗死、肺栓塞B型嗜血性流感疫苗 Praxis Biologics B型嗜血性流感基因工程制药第6页美国已同意了56种生物制剂部分摘录（2）产品 企业 主要适应症-EPO Ortho Biotech慢性肾衰竭贫血a-n3干扰素Interferon Sciences 性疣r-1b干扰素Genentech 类风湿rG-CSFAmgen 化疗所致白细胞降低GM-CSFImmunex 自体骨髓移植白细胞介素-2Chiron 转移性肾癌凝血因子VII Genetics Institute 血友病基因工程制药第7页美国已同意了56种生物制剂部分摘录（3）产品 企业 主要适应症-1b干扰素 Berlex Lab Chiron 多发性硬皮病-葡萄糖苷脂酸Genzyme Gaucher遗传病单抗治疗剂 Centocor 抗血液凝固因子VIIINovo 血友病HumalogLilly 糖尿病Nateplase三井-持田 溶血栓alfacon-1干扰素Amgen 慢性丙肝干扰素8-nlOtsuka（日本）治疗蕈样真菌病基因工程制药第8页基因工程技术生产药品优点：（1）利用基因工程技术可大量生产过去难以取得生理活性蛋白质和多肽，为临床使用提供有效保障；（2）能够提供足够数量生理活性物质，方便对其生理、生化和结构进行深入研究，从而扩大这些物质引用范围；（3）利用基因工程技术能够发觉，挖掘更多内源性生理活性物质；（4）内源生理活性物质在作为药品使用存放不足之处，能够经过基因工程和蛋白质工程进行改造和去;（5）利用基因工程技术可取得新型化合物，扩大药品筛选起源。基因工程制药第9页我国基因工程药品研究和开发：起步较晚，基础较差。1b 型基因工程干扰素是由我国自行研制开发含有国际先进水平生物高科技结果，于1997年 经过 期临床，并取得国家一类新药证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化基因工程药品。当前我国已同意12种基因工程药品和疫苗上市，在研究开发中也有10余种。基因工程制药第10页年4月前我国同意上市35种生物技术药品同意年份药品药品同意年份药品药品1989干扰素干扰素IFN-1b1999125Ala IL-2人胰岛素人胰岛素Anti-CD3鼠源单抗鼠源单抗1992IFN-2a人碱性成纤维细胞生长因子（人碱性成纤维细胞生长因子（bFGFbFGF）表皮生长因子（表皮生长因子（EGFEGF）EGFEGF衍生物衍生物霍乱疫苗（霍乱疫苗（rBS-WCrBS-WC）1994白介素白介素2（IL-2）抗抗IL-8鼠源单抗凝乳剂鼠源单抗凝乳剂1995乙肝疫苗（酵母）乙肝疫苗（酵母）IL-11肿瘤细胞细胞核嵌合抗体注射液肿瘤细胞细胞核嵌合抗体注射液131I重组葡激酶（重组葡激酶（r-SAK）1996IFN-2b，乙肝疫苗（乙肝疫苗（CHO）粒细胞集落刺激因子（粒细胞集落刺激因子（G-CSF）重组人重组人p53腺病毒注射液腺病毒注射液抗抗EGFR人源单抗人源单抗1997粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（G-CSF）重组链激酶（重组链激酶（-SK）促红细胞生成素（促红细胞生成素（EPO）重组人脑利钠肽重组人脑利钠肽重组人血管内皮抑素重组人血管内皮抑素重组人重组人5型腺病毒注射液（型腺病毒注射液（H101）重组人肿瘤坏死因子重组人肿瘤坏死因子（rhTNF）重组人血小板生成素（重组人血小板生成素（rhEPO）1998IFN-125Ser IL-2125Ser IL-2生长激素（生长激素（GHGH）痢疾疫苗痢疾疫苗牛碱性成纤维细胞生长因子（牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGFbFGF）重组重组TNFR-Fc融合蛋白融合蛋白基因工程制药第11页胰岛素 1000 磅牛胰 10 克胰岛素 200 升发酵液 10 克胰岛素干扰素 1200 升人血 1 升发酵液 23 万美元/病人 200300 美元/病人基因工程制药第12页基因工程（genetic engineering）：也称基因操作、遗传工程，重组体DNA技术，基因克隆或分子克隆，指将不一样生物遗传物质基因，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后经过载体（质粒、噬菌体或病毒等）转入微生物、植物或动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要基因在细胞中表示，产生出人类所需要产物或组建成新生物类型。基因工程制药第13页供体细胞载体分子外源DNA外源基因分离酶切酶切连接转化扩增DNA重组分子受体细胞判定与表示重组转化子工程菌或细胞蛋白产物工程菌或细胞培养重组产物分离纯化基因工程制药第14页 目标基因目标基因基因载体基因载体重组体重组体分切接转筛表总总体体技技术术路路线线基因工程制药第15页基因工程操作流程基因工程操作流程1、分、分：分离目标基因分离目标基因2、切、切：对目标基因和载体适当切割：对目标基因和载体适当切割3、接、接：目标基因与载体连接：目标基因与载体连接4、转、转：重组：重组DNA转入受体细胞转入受体细胞5、筛、筛：筛选出含有重组体受体细胞：筛选出含有重组体受体细胞6、表、表：目标基因在受体细胞中表示，：目标基因在受体细胞中表示，受体细胞成长为基因改造生物受体细胞成长为基因改造生物基因工程制药第16页基因工程制药基本过程取得目标基因构建重组质粒组建基因工程菌或者基因工程细胞工程菌培养产物分离纯化基因工程药品质量控制基因工程制药第17页基因工程制药第18页目标基因取得目标基因取得一、一、酶切法酶切法直接分离目标基因直接分离目标基因二、二、PCR直接扩增目标基因直接扩增目标基因三、三、文库法文库法分离目标基因分离目标基因四、四、化学合成化学合成目标基因目标基因基因工程制药第19页酶切法直接分离目标基因基因工程制药第20页plasmid DNAGenomic DNA基因工程制药第21页gagctcaagctt基因工程制药第22页限制性内切酶在DNA克隆中应用基因工程制药第23页PCRnPolymerase chain reactionn聚合酶链式反应基因工程制药第24页PCRPCR基本原理基本原理1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目标DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链基因工程制药第25页模板DNA95基因工程制药第26页PCR基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR特点55引物1引物2DNA引物基因工程制药第27页PCR基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶基因工程制药第28页PCR基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR特点第1轮结束95第2轮开始基因工程制药第29页PCR基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR特点55TaqTaqTaqTaq基因工程制药第30页PCR基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR特点72第2轮结束基因工程制药第31页PCR基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增基因工程制药第32页 PCR 动画动画1 1stst cycle cycle2 2ndnd cycle cycle3 3rdrd cycle cycle过过 程程变变变变 性性性性引引引引 物物物物 退退退退 火火火火DNA DNA 复制复制复制复制基因工程制药第33页PCRPCR琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳最终产物最终产物最终产物最终产物紫外光观察紫外光观察紫外光观察紫外光观察3-4 3-4 3-4 3-4 小时小时小时小时基因工程制药第34页片段化、分级分离片段化、分级分离片段化、分级分离片段化、分级分离基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装基因工程制药第35页基因工程制药第36页化学合成目标基因基因工程制药第37页什么是载体？载体（载体（Vector）:将外源目标将外源目标DNA导入受体导入受体细胞，并能自我复制和增殖工具。细胞，并能自我复制和增殖工具。载体概述载体概述基因工程制药第38页多克隆位点多克隆位点ori复制起始点复制起始点遗传标识遗传标识AmpAmppolylinker基因载体基因载体载体概述载体概述基因工程制药第39页三个显著特点：三个显著特点：（1）分子量更小，仅为）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源，容纳外源DNA量增大；含有更高拷贝数（每量增大；含有更高拷贝数（每个细胞含个细胞含500-700个拷贝）。个拷贝）。（2）含易于检测是否有外源）含易于检测是否有外源DNA插入标识基因插入标识基因Lac Z，可利用，可利用-互补原理互补原理进行进行蓝白斑筛选蓝白斑筛选。（3）多克隆位点区（）多克隆位点区（MCS）由人工合成多个单一酶切位点组成。）由人工合成多个单一酶切位点组成。质粒载体基因工程制药第40页连接连接基因工程制药第41页转化受体细胞基因工程制药第42页1 1、抗药抗药性检性检测筛测筛选法选法基因工程制药第43页2 2、显色检测、显色检测IPTG：异丙基硫代半乳糖苷：异丙基硫代半乳糖苷 诱导物诱导物X-gal:5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-半乳糖苷半乳糖苷基因工程制药第44页3 3、限制酶、限制酶切图谱检测切图谱检测基因工程制药第45页4 4、PCRPCR扩增检测扩增检测用用PCR方法检测是否插入外源基因片段。方法检测是否插入外源基因片段。优点：不需要适当酶切位点。优点：不需要适当酶切位点。缺点：假阳性高。缺点：假阳性高。基因工程制药第46页5 5、原位杂交检测、原位杂交检测依据插入依据插入DNA片片段序列设计并合段序列设计并合成探针，以此搜成探针，以此搜寻筛选含有目标寻筛选含有目标基因目标重组子。基因目标重组子。DNA同源序列之同源序列之间特异性互补杂间特异性互补杂交是该技术基本交是该技术基本理论依据理论依据 基因工程制药第47页6、序列测定、序列测定双脱氧测序双脱氧测序基因工程制药第48页基因工程制药第49页双脱氧末端终止测序法基本反应：双脱氧末端终止测序法基本反应：双脱氧末端终止测序法基本反应：双脱氧末端终止测序法基本反应：GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACAGGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA基因工程制药第50页双脱氧末端终止测序法双脱氧末端终止测序法双脱氧末端终止测序法双脱氧末端终止测序法 Sanger双脱氧终止法测序过程双脱氧终止法测序过程基因工程制药第51页基因工程制药第52页模板序列模板序列基因工程制药第53页测序测序读片读片基因工程制药第54页 近年来，建立了一个使用荧光染料无放射性标识DNA测序法。它使用4种不一样颜色荧光染料分别标识4种不一样碱基，并在一个凝胶电泳泳道中进行电泳，然后经过激光作用诱发荧光，到达检测碱基目标。激光检测器把搜集到信息传到电脑，计算机会自动显示或打印出碱基次序。这么一个泳道一次电泳可读出450左右个碱基，一块凝胶36个泳道可测36450约16200个碱基，大大加紧了测序速度。以后又创造了一个用毛细管电泳代替凝胶电泳方法，可大大加紧电泳速度分辨率，并可实现自动灌胶和自动进样。基因工程制药第55页测序结果测序结果基因工程制药第56页7 7、外源蛋、外源蛋白质检测白质检测利用插入利用插入DNA所表示蛋白质所表示蛋白质功效或者结构功效或者结构性质，检测外性质，检测外源蛋白质存在。源蛋白质存在。适合用于表示适合用于表示载体检测。载体检测。基因工程制药第57页受体细胞选择 外源基因在大肠杆菌、枯草芽外源基因在大肠杆菌、枯草芽外源基因在大肠杆菌、枯草芽外源基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌细胞中表示孢杆菌细胞中表示孢杆菌细胞中表示孢杆菌细胞中表示 外源基因在病毒中表示外源基因在病毒中表示外源基因在病毒中表示外源基因在病毒中表示 外源基因在酵母细胞中表示外源基因在酵母细胞中表示外源基因在酵母细胞中表示外源基因在酵母细胞中表示 外源基因在昆虫细胞中表示外源基因在昆虫细胞中表示外源基因在昆虫细胞中表示外源基因在昆虫细胞中表示 外源基因在植物细胞中表示外源基因在植物细胞中表示外源基因在植物细胞中表示外源基因在植物细胞中表示 外源基因在哺乳动物细胞中表外源基因在哺乳动物细胞中表外源基因在哺乳动物细胞中表外源基因在哺乳动物细胞中表示示示示基因工程制药第58页1、大肠杆菌表示系统、大肠杆菌表示系统大肠杆菌属大肠杆菌属革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌，它是当前为止研究得最为，它是当前为止研究得最为详尽、应用最为广泛原核生物种类之一，也是基因工详尽、应用最为广泛原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟载体受体系统。程研究和应用中发展最为完善和成熟载体受体系统。优点：优点：繁殖快速、培养简便，代谢易于控制。繁殖快速、培养简便，代谢易于控制。缺点：缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量内毒素，可造成大肠杆菌细胞间隙中含有大量内毒素，可造成人体热原反应。人体热原反应。基因工程制药第59页基因工程制药第60页2、枯草杆菌表示系统、枯草杆菌表示系统枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌。优点：优点：1.枯草杆菌含有胞外酶分泌调整基因，能将含有表示产物高效枯草杆菌含有胞外酶分泌调整基因，能将含有表示产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表示产物提取和加工处理等，分泌到培养基中，大大简化了蛋白表示产物提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物异源重组蛋白经枯草杆菌分泌而且在大多数情况下，真核生物异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便含有天然构象和生物活性。后便含有天然构象和生物活性。2.枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一个安全基因工程菌。枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一个安全基因工程菌。3.枯草杆菌含有芽孢形成能力，易于保留和培养。枯草杆菌含有芽孢形成能力，易于保留和培养。4.枯草杆菌也含有大肠杆菌生长快速、代谢易于调控、分子遗传枯草杆菌也含有大肠杆菌生长快速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。学背景清楚等优点。应用：应用：已成功用于表示人已成功用于表示人干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒关干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒关键抗原和动物口蹄疫病毒键抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。抗原等。基因工程制药第61页n n在一些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊生物大分子，它们在一些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊生物大分子，它们在一些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊生物大分子，它们在一些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹或无膜裸露结构，这种水不致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹或无膜裸露结构，这种水不致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹或无膜裸露结构，这种水不致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹或无膜裸露结构，这种水不溶性结构称为溶性结构称为溶性结构称为溶性结构称为包涵体（包涵体（包涵体（包涵体（Inclusion BodiesInclusion Bodies，IBIB）。n n假如未进行特殊设计（如分泌型表示或融合型表示），外源基因假如未进行特殊设计（如分泌型表示或融合型表示），外源基因假如未进行特殊设计（如分泌型表示或融合型表示），外源基因假如未进行特殊设计（如分泌型表示或融合型表示），外源基因在大肠杆菌中表示蛋白量占细胞总蛋白量在大肠杆菌中表示蛋白量占细胞总蛋白量在大肠杆菌中表示蛋白量占细胞总蛋白量在大肠杆菌中表示蛋白量占细胞总蛋白量20%20%以上时，表示产物以上时，表示产物以上时，表示产物以上时，表示产物普通倾向于形成包涵体。所以，以包涵体形式表示目标基因操作普通倾向于形成包涵体。所以，以包涵体形式表示目标基因操作普通倾向于形成包涵体。所以，以包涵体形式表示目标基因操作普通倾向于形成包涵体。所以，以包涵体形式表示目标基因操作关键就是选择高表示载体。实际上，这种高表示率也是包涵体法关键就是选择高表示载体。实际上，这种高表示率也是包涵体法关键就是选择高表示载体。实际上，这种高表示率也是包涵体法关键就是选择高表示载体。实际上，这种高表示率也是包涵体法优点所在。优点所在。优点所在。优点所在。n n 在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰蛋白质不能进入复性过程，在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰蛋白质不能进入复性过程，在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰蛋白质不能进入复性过程，在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰蛋白质不能进入复性过程，所以永远成为无活性蛋白质。包涵体中蛋白质就属于这两种状态，所以永远成为无活性蛋白质。包涵体中蛋白质就属于这两种状态，所以永远成为无活性蛋白质。包涵体中蛋白质就属于这两种状态，所以永远成为无活性蛋白质。包涵体中蛋白质就属于这两种状态，所以需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复所以需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复所以需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复所以需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作。性操作。性操作。性操作。包涵体表示包涵体表示基因工程制药第62页 融合型表示融合型表示n n将外源基因与受体菌本身蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅将外源基因与受体菌本身蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅将外源基因与受体菌本身蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅将外源基因与受体菌本身蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表示读框架进行表示读框架进行表示读框架进行表示,由这种杂合基因表示出蛋白质称为由这种杂合基因表示出蛋白质称为由这种杂合基因表示出蛋白质称为由这种杂合基因表示出蛋白质称为融合蛋白融合蛋白融合蛋白融合蛋白。n n在这种融合蛋白结构中，在这种融合蛋白结构中，在这种融合蛋白结构中，在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌蛋白部分位于通常受体细菌蛋白部分位于通常受体细菌蛋白部分位于通常受体细菌蛋白部分位于N N N N端，异源蛋白位于端，异源蛋白位于端，异源蛋白位于端，异源蛋白位于C C C C端。端。端。端。经过在经过在经过在经过在DNADNADNADNA水平上人工设计引入蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，水平上人工设计引入蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，水平上人工设计引入蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，水平上人工设计引入蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，能够在体外从纯化融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。能够在体外从纯化融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。能够在体外从纯化融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。能够在体外从纯化融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。N末端：由原核基因编码一段多肽，末端：由原核基因编码一段多肽，C末端：是完整真核外源基因末端：是完整真核外源基因。质粒基因产物质粒基因产物 目标基因产物目标基因产物NC切割切割基因工程制药第63页基因工程制药第64页惯用受体蛋白（原核细菌表示蛋白质）惯用受体蛋白（原核细菌表示蛋白质）基因工程制药第65页（D3）受体蛋白受体蛋白切除方法切除方法v化学断裂法：溴化氰化学断裂法：溴化氰（CNBr）-Met-（切点）（切点）-AAv酶促断裂法：凝血因酶促断裂法：凝血因子子Xa，有蛋白酶活性，有蛋白酶活性，识别序列识别序列:IleGluGlyArg-（切点）（切点）-AA基因工程制药第66页基因工程制药第67页分泌表示蛋白分泌表示蛋白 细胞质细胞质外膜外膜内膜内膜周间质周间质质粒质粒染色体染色体“外排外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。“分泌分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。基因工程制药第68页分泌蛋白表示原理图示分泌蛋白表示原理图示基因工程制药第69页惯用大肠杆菌信号肽惯用大肠杆菌信号肽n碱性磷酸酶信号肽（phoA）n膜外周质蛋白质信号肽（OmpA）n霍乱弧菌毒素B亚单位（CTXB）。基因工程制药第70页酵母表示系统酵母表示系统基因工程制药第71页能提升重组异源蛋白产率诱变酵母菌能提升重组异源蛋白产率诱变酵母菌基因工程制药第72页基因工程细胞扩增和发酵生产基因工程细胞扩增和发酵生产（一）（一）基因工程菌稳定性基因工程菌稳定性（二）（二）基因工程菌培养程序基因工程菌培养程序（三）（三）基因工程菌培养方式基因工程菌培养方式（四）（四）影响基因工程菌培养各种原因分析影响基因工程菌培养各种原因分析（五）（五）基因工程菌培养设备基因工程菌培养设备-生物反应器生物反应器基因工程制药第73页1、基因工程菌质粒不稳定性、基因工程菌质粒不稳定性基因工程菌质粒不稳定与2个原因相关：（1）分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定百分比不含质粒子代菌现象。（2）结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失而造成工程菌性能改变。因为丢失质粒细菌要比含有质粒工程菌更含有生长优质，所以在竞争中最终会取代工程菌，而演变成为优势菌。最终造成蛋白质表示量降低。基因工程制药第74页2、质粒稳定性分析方法、质粒稳定性分析方法（1）将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂于不含抗生素标识平板培养基上，培养10-12小时，统计所长出菌落数A；（2）然后随机挑选100个菌落，接种到含有抗生素标识平板培养基上，培养10-12小时，统计所长出菌落数B；（3）计算出B/A比值。该比值能够反应出质粒稳定性。因为丢失质粒细菌在含抗生素培养基环境中是不能正常生长。基因工程制药第75页3、质粒不稳定原因、质粒不稳定原因1、分裂不稳定、分裂不稳定-是指基因工程菌在分裂子代菌体中，出现一定百分比不含质粒现象。它主要与2个原因相关：（1）工程菌产生丢失质粒概率，拷贝量低工程细菌，它所产生不含质粒细菌变异株和概率较大。（2）丢失质粒细菌、含有质粒工程菌之间竞争力大小。2、结构不稳定、结构不稳定-是指外源基因从质粒上丢失、或者发生碱基后果排、缺失现象，最终造成工程菌性能改变现象。基因工程制药第76页4、提升质粒稳定性方法、提升质粒稳定性方法（1）、分阶段培养法）、分阶段培养法（2）、在培养基中加入抗生素，形成选择性压力）、在培养基中加入抗生素，形成选择性压力（3）、经过温度、）、经过温度、PH值、培养基组分、溶解氧综合调整办值、培养基组分、溶解氧综合调整办法法基因工程制药第77页（1）、分阶段培养法）、分阶段培养法工程菌培养普通分为2个阶段：（1）第一阶段-先使菌体生长至一定密度。（2）第二阶段-开始诱导外源基因表示。因为第一阶段外源基因没有表示，降低了丢失质粒细菌产生概率，也就增加了工程菌稳定性。基因工程制药第78页（2）、培养基中加入抗生素，形成选择性压力）、培养基中加入抗生素，形成选择性压力因为丢失质粒细菌在含抗生素培养基环境中是不能正常生长。所以能够经过加入抗生素来抑制质粒丢失细菌生长。基因工程制药第79页（3）、经过温度、）、经过温度、PH值、培养基组分、值、培养基组分、溶解氧综合调整办法溶解氧综合调整办法经过以下方法能够提升质粒稳定性。（1）间歇送氧（2）改变稀释速率基因工程制药第80页（二）基因工程菌培养程序（二）基因工程菌培养程序1、摇瓶操作、摇瓶操作-经过摇瓶操作，来子解工程菌生长基础条件，如温度值、培养基组分、氮碳比、表示产物积累对于工程细胞影响。2、培养罐操作、培养罐操作-经过培养罐操作，来确定培养参数、确定培养方案、以及确定培养次序。基因工程制药第81页（三）基因工程菌培养方式（三）基因工程菌培养方式1、补料分批培养补料分批培养2、连续培养连续培养3、透析培养透析培养4、固定化培养固定化培养5、高密度培养高密度培养基因工程制药第82页1、补料分批培养、补料分批培养是指将种子接入发酵反应器进行培养，经过一段时间之后，间歇式地、或者连续地补加新鲜培养基，使菌体深入生长方法。其目标是为了创造一个良好微生物环境，延长菌体对数生长久，来取得高密度菌体总量。基因工程制药第83页2、连续培养、连续培养将种子接入发酵反应器中，搅拌式培养到达一定菌体浓度之后，同时进行进料、出料操作，经过控制一定营养物稀释比率，来进行不间断式培养方式，称为连续培养。连续培养有利于保持生产环境恒定，有利于控制菌体生长速率。不过因为基因工程菌不稳定性，造成连续培养比较困难。基因工程制药第84页3、透析培养、透析培养透析培养是利用膜半透性原理，使得代谢产物和培养基分开，经过去除培养液中借调产物方法来消除代谢产物对工程菌不良影响。透析装置是用半透膜将发酵器隔成二半，形成发酵液区、和透析液区，经过透析来及时移去合成产物。半透膜种类、孔径、面积、发酵液和透析液百分比、透析液组成、循环流速、培养连续时间等等原因会影响产物得率。用透析法培养大肠杆菌E.coliHB101（pPKAS2）生产青霉素酰化霉，其产率能够提升11倍。基因工程制药第85页4、固定化培养、固定化培养为了维持质粒稳定性，人们将固定化技术和基因工程菌结合起来，进行固定化式连续培养，有利于提升生产效率。基因工程制药第86页高密度培养技术又称高密度发酵技术，指提升基因工程菌菌体发酵密度，最终提升产物比生产率，即单位体积单位时间内产物产量。优点：不但能够降低培养体积、强化下游分离提纯，而且能够缩短生产周期，降低设备投资，从而降低生产成本。基因工程制药第87页大肠杆菌高密度培养技术大肠杆菌高密度发酵理论最大值为400g DCW/L（DCW：dry cell weight），相对于发酵液中25%是大肠杆菌细胞。迄今为止，最高密度发酵两个例子是非重组菌E.coli W3110（密度为174 g DCW/L）；生产聚-3-羟基丁酸重组菌（密度为175.4 g DCW/L）基因工程制药第88页影响大肠杆菌高密度发酵原因发酵培养基：碳氮比；碳源氮源浓度表示基因调控宿主菌质粒拷贝数和稳定性诱导时间和诱导强度大肠杆菌高密度发酵补料调控：恒速流加补料、变速流加补料和指数流加补料乙酸对生长和表示影响：降低乙酸基因工程制药第89页酵母菌高密度培养技术大肠杆菌高密度发酵理论最大值为280g DCW/L（DCW：dry cell weight），当前发酵过程中，普通认为酵母密度为100200 g DCW/L即为高密度发酵。惯用高密度发酵宿主菌是巴氏毕赤酵母基因工程制药第90页毕赤酵母高密度培养技术首先用含甘油合成培养基培养，外源基因表示被完全抑制。当甘油消耗完，开始流加甘油至培养物种，使细胞限速生长。最终流加甲醇或甲醇与甘油混合物，诱导外源基因表示，同时检测培养液中外源蛋白浓度，到适当水平停顿发酵和收获目标蛋白。基因工程制药第91页实例：表示重组人血清白蛋白（rHSA）毕赤酵母工程菌高密度培养在15L多参数全自动发酵罐中，OD600达500700，密度达115160g DCW/L，rHSA蛋白表示量达3.6g/L。工艺：22h分批发酵结束后，开始流加补料发酵培养基，经过控制流加速率，以控制溶氧浓度（DO）在20%以上。在46h到达OD值700，到达高密度，停顿流加。当DO陡然上升到70%，开始流加诱导表示培养基，经过控制流加速率，以控制溶氧浓度（DO）在20%以上。在120h，rHSA表示量最大到达3.6g/L。基因工程制药第92页（四）影响基因工程菌培养各种原因分析（四）影响基因工程菌培养各种原因分析 基因工程菌传统微生物生物材料含外源重组基因 不含外源重组基因发酵工艺使外源基因高效表示 使本身基因表示目标产生外源蛋白质 产生本身代谢产物1、培养基影响、培养基影响2、接种量影响、接种量影响3、温度影响、温度影响4、溶解氧影响、溶解氧影响5、诱导时机影响、诱导时机影响6、PH值影响值影响基因工程制药第93页1、培养基影响、培养基影响（1）惯用碳源有：葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。（2）惯用氮源有：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、制订水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵。（3）其它组成成份：无机盐、微量元素、维生素、生物素。（4）无机磷在许多初级代谢酶促反应中是一个效应因子。基因工程制药第94页2、接种量影响、接种量影响接种量是指所移入种子液体量与培养液体量百分比，它大小会影响发酵物产量和发酵周期。（1）接种量小，菌体生长延迟，不利于外源基因表示。（2）接种量适中，生产菌能够快速占领整个培养环境，降低菌体污染机会。（3）接种量过大，菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体生长。普通来说，10-15%接种量，菌体延迟期短、菌群快速繁衍、很快进入对数生长久，适合用于个源基因表示。基因工程制药第95页3、温度影响、温度影响温度对基因表示调控作用发生在复制、转录、翻译、小分子蛋白质合成水平等方面。（1）在复制水平，温度可影响基因拷贝数量。（2）在转录水平，温度可影响RNA聚合酶作用，而来调控基因表示。（3）在翻译水平上，还能够经过小分子蛋白质合成水平来影响基因表示。（4）温度还影响蛋白质活性和包含体形成。举如说明以下基因工程制药第96页温度影响例子温度影响例子（1）大肠杆菌合成青霉素酰化酶，从37起伴随温度下降，青霉素酰化酶合成产量逐步增加，20-22时到达高峰，16以下，青霉素酰化酶产量反而下降。这是因为在18-16时，工程菌生长减慢。试验证实，造成这种减慢原因是因为温度影响了细胞内青霉素酰化酶mRNA浓度。（2）分泌型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子工程菌E.coliW3100/pGM-CSF，在 30时，蛋白质表示量最高，37时，因为细菌热休克系统被激活，其蛋白质表示量反而下降。（3）重组人生长激素工程菌，在30时产物是可溶，而在37所表示出蛋白质则是不溶。基因工程制药第97页4、溶解氧影响、溶解氧影响溶解氧对于工程菌发酵过程中菌体代谢是含有十分主要作用。细菌在大量扩增过程中，要进行消耗氧气生化反应过程。所以，维持较高水平溶解氧水平（DO240%），才能维持工程菌快速生长和繁衍。分泌型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子工程菌E.coliW3100/pGM-CSF发酵过程中，假如溶解氧20%，则产生大量杂蛋白。影响以后纯化。必须维持溶解氧25%水平。采取调整搅拌转速方法，能够改进培养过程中氧供给，提升活菌产量。基因工程制药第98页5、诱导时机影响、诱导时机影响对于PLclts875突变株工程菌来说，在28-30培养时，这时突变体能产生阻遏蛋白、来阻止开启子转译。而当温度上升到42时，这种阻遏作用就消失。在这里，温度对于工程菌表示起着诱导作用。普通来说，对于处于生长久后期工程菌进行诱导，如菌体细胞密度在109个/ml时，经过升温诱导，能够到达蛋白质表示增产效果。这在工业化生产中含有较大潜力。基因工程制药第99页6、PH值影响值影响PH对于细胞正常生长、外源蛋白高效表示都有影响。（1）细胞生长久最正确PH范围是6.8-7.4。（2）外源蛋白表示最正确PH范围是6.0-6.5。在发酵过程中，细菌本身对PH值含有一定调整能力。当PH值超出其调整能力范围时，就会影响细菌生长。发酵前期，PH值可控制在7.0，伴随蛋白质表示，PH值不停下降，当PH6.0时，则应及时开动碱泵，加入碱液。基因工程制药第100页（五）基因工程菌培养设备（五）基因工程菌培养设备-生物反应器生物反应器基因工程制药第101页基因工程药品分离纯化技术基因工程药品分离纯化技术（一）（一）工程细菌所表示出蛋白质特点工程细菌所表示出蛋白质特点（二）（二）分离纯化技术主要性分离纯化技术主要性（三）（三）分离纯化基本步骤和方法分离纯化基本步骤和方法基因工程制药第102页（一）工程细菌所表示出蛋白质特点（一）工程细菌所表示出蛋白质特点1、目标产物在初始物料中含量很低。2、初始产物组成十分复杂。除了目标蛋白质之外，还含有残余细胞、代谢产物、残余培养基、各种无机盐。3、目标蛋白质稳定性很差，轻易失活、变性，对于温度、PH、金属离子、有机溶剂十分敏感和脆弱。4、目标蛋白质种类繁多，存在着大小不一样片段。5、纯度不高、经常含有杂菌、热原等等物质。基因工程制药第103页（二）分离纯化技术主要性（二）分离纯化技术主要性为了取得高纯度、可供药用有生物活性蛋白质，必须对基因工程药品进行一定分离和纯化。1、分离、分离-以大肠杆菌为宿主基因工程药品多为胞内产物，分离提取这类产物时，需要经过细胞搜集、细胞破碎、细胞碎片分离过程。2、纯化、纯化-经过破碎和分离之后，目标产物依然存在着大量杂质，杂蛋白质、类似蛋白质异构体，为了取得合格目标产物，必须进行纯化操作。3、精制、精制-非蛋白质类纯质在经过纯化操作之后，依然无法除去，需要进行灭菌和精制操作。基因工程制药第104页 发酵液 细胞分离 胞内产物 胞外产物浓缩初步纯化高度纯化产品细胞破碎固液分离 包含体 细胞碎片浓缩初步纯化高度纯化制剂产品变性除膜复性浓缩初步纯化高度纯化制剂产品（三）分离纯化基本步骤（三）分离纯化基本步骤基因工程制药第105页分离纯化基本方法分离纯化基本方法1、细胞搜集-离心法。2、细胞破碎：（1）机械破碎法-高压匀浆法、超声波破碎法、高速珠磨法、高压挤压法、（2）非机械破碎法-酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法。3、固液分离-离心法、膜过滤法、双水相分配萃取法。4、纯化色谱技术-离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色彩谱、凝胶过滤色谱、高压液相色谱。5、除非蛋白质杂质技术-除DNA、除热原、除病毒。下面针对不一样技术作讲解-总