大肠杆菌的培养和分离专家讲座.pptx

生物技术概述生物技术概述生物技术生物技术也叫生物工程也叫生物工程,是应用自然科学及工程学是应用自然科学及工程学原理原理,以微生物、动物、植物作为反应器以微生物、动物、植物作为反应器,将物料将物料进行加工进行加工,以提供产品为社会服务技术。以提供产品为社会服务技术。比如：以酵母为反应器制酒、以醋杆菌为反应器制醋、以比如：以酵母为反应器制酒、以醋杆菌为反应器制醋、以转基因大肠杆菌为反应器生产生长激素、以羊为反应器生转基因大肠杆菌为反应器生产生长激素、以羊为反应器生产人乳。产人乳。大肠杆菌的培养和分离第1页生物工程发展史生物工程发展史n1、传统生物技术、传统生物技术n如酿酒、制作酸奶、污水处理、垃圾处理如酿酒、制作酸奶、污水处理、垃圾处理大肠杆菌的培养和分离第2页2、当代生物技术、当代生物技术利用大肠杆菌生产胰岛素、生长激素、促红细利用大肠杆菌生产胰岛素、生长激素、促红细胞生成素等药品。胞生成素等药品。大肠杆菌的培养和分离第3页当代生物工程包含当代生物工程包含:细胞工程、细胞工程、发酵工程、发酵工程、酶工程、酶工程、蛋白质工程、蛋白质工程、基因工程基因工程大肠杆菌的培养和分离第4页n基因工程：剔除或改变有害基因，引入正确基基因工程：剔除或改变有害基因，引入正确基因或有利基因。因或有利基因。大肠杆菌的培养和分离第5页第一部分第一部分:微生物应微生物应用用大肠杆菌的培养和分离第6页特点：特点：结构都相当结构都相当简单简单,个体多数十分个体多数十分微小微小.通常要用通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有甚至没有细胞光学显微镜或电子显微镜才能看到，有甚至没有细胞结构结构.微生物微生物病毒病毒细菌细菌放线菌放线菌真菌真菌原生动物原生动物 原核生物原核生物 原生生物原生生物真菌真菌一、基础知识：一、基础知识：(一一)微生物微生物：是一切肉眼看不见或看不清：是一切肉眼看不见或看不清楚微小生物总称楚微小生物总称大肠杆菌的培养和分离第7页(二二)细菌常识细菌常识1、结构、结构2、分裂、分裂3、生殖、生殖4、在基因工程中应、在基因工程中应用用大肠杆菌的培养和分离第8页大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌的培养和分离第9页细菌外形与大小细菌外形与大小大肠杆菌属于杆状菌大肠杆菌属于杆状菌图图1-1常见三种细菌经典形态常见三种细菌经典形态A.球菌球菌B.杆菌杆菌C.螺旋菌螺旋菌大肠杆菌的培养和分离第10页n依据细菌所利用依据细菌所利用能源和碳源能源和碳源不一样将不一样将细菌分为两大营养类型。细菌分为两大营养类型。n自养菌自养菌:n异养菌异养菌:细菌营养类型细菌营养类型 光能自养型光能自养型:光合细菌光合细菌化能自养型化能自养型:硝化细菌硝化细菌,铁细菌铁细菌,硫细菌硫细菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌大肠杆菌的培养和分离第11页n单个或少数细菌在单个或少数细菌在固体培养基固体培养基上大量繁殖上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见，含有一定形时，就会形成一个肉眼可见，含有一定形态结构态结构子细胞群体子细胞群体，叫做菌落，叫做菌落。n菌落形态是菌落形态是判定菌种判定菌种主要依据。主要依据。菌落菌落大肠杆菌的培养和分离第12页细菌革兰氏染色细菌革兰氏染色 革兰氏染色法是一个用于细菌染色法。革兰氏染色法是一个用于细菌染色法。此法将细菌分为两类，即此法将细菌分为两类，即革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两色液颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌种菌差异在于细胞壁成份不一样差异在于细胞壁成份不一样。大肠杆菌属于革兰氏阴性菌大肠杆菌属于革兰氏阴性菌大肠杆菌的培养和分离第13页培养基培养基培养基（培养液）是培养基（培养液）是由人工方法配制由人工方法配制而成，专供微生物生长繁殖使用混合营而成，专供微生物生长繁殖使用混合营养养液。液。1.1.培养基类型培养基类型(三三)细菌培养细菌培养成份区分：有没有琼成份区分：有没有琼脂脂液体培养基：液体培养基：扩增细菌（培养）扩增细菌（培养），工业生产，工业生产固体培养基：固体培养基：纯化（分离），纯化（分离），判定、保藏菌种判定、保藏菌种大肠杆菌的培养和分离第14页2.2.不一样微生物往往需要采取不一样不一样微生物往往需要采取不一样培养基配方培养基配方 3.3.不论哪种培养基，基本成份都是相同。不论哪种培养基，基本成份都是相同。普通都含有普通都含有水水、碳源碳源、和、和氮源氮源、无机盐无机盐、生长因子生长因子等等营养物质，另外还需要满足营养物质，另外还需要满足微生物生长对微生物生长对pH pH、氧气氧气、渗透压渗透压要求要求细菌喜荤，霉菌喜素细菌喜荤，霉菌喜素大肠杆菌培养基大肠杆菌培养基LB培养基培养基配方：配方：酵母提取物酵母提取物0.25g蛋白胨蛋白胨0.5gNacl0.5g琼脂琼脂1g水水:50ml大肠杆菌的培养和分离第15页无菌技术无菌技术1.1.无菌技术概念无菌技术概念无菌操作泛指在培养微生物操作中，无菌操作泛指在培养微生物操作中，全部预防杂菌污染方法。全部预防杂菌污染方法。是成功地培养微生物关键。是成功地培养微生物关键。大肠杆菌的培养和分离第16页（）（）消毒定义：消毒定义：2.2.消毒与灭菌概念及二者区分消毒与灭菌概念及二者区分（2 2）灭菌定义：）灭菌定义：是指杀灭病原微生物方法。如乙醇消毒是指杀灭病原微生物方法。如乙醇消毒是指杀灭或去除环境中一切微生物（包含是指杀灭或去除环境中一切微生物（包含芽胞芽胞、孢子孢子）方法。方法。大肠杆菌的培养和分离第17页灭菌方法：灭菌方法：3.3.惯用消毒与灭菌方法惯用消毒与灭菌方法1 1、灼烧灭菌、灼烧灭菌大肠杆菌的培养和分离第18页2 2、干热灭菌：、干热灭菌：160-170 160-170 下加热下加热1-2h1-2h。3 3、高压蒸气灭菌：、高压蒸气灭菌：100kPa100kPa、121 121 下下维持维持15-30min.15-30min.高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅大肠杆菌的培养和分离第19页1.1.无菌技术除了用来预防试验室培养物被其它外无菌技术除了用来预防试验室培养物被其它外来微生物污染外，还有什么目标？来微生物污染外，还有什么目标？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。假如需要，请选择适当方法。假如需要，请选择适当方法。（1 1）培养细菌用培养基与培养皿培养细菌用培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）试验操作者双手试验操作者双手答：无菌技术还能有效防止操作者本身被微生物感染。答：无菌技术还能有效防止操作者本身被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。大肠杆菌的培养和分离第20页试验一试验一 大肠杆菌培养和分离大肠杆菌培养和分离1.进行进行大肠杆菌大肠杆菌扩增扩增，利用，利用液体培养基液体培养基进进行细菌培养操作行细菌培养操作2.进行进行大肠杆菌大肠杆菌分离分离，用，用固体平板培养基固体平板培养基进行细菌划线培养进行细菌划线培养3.说明大肠杆菌培养条件和操作要求原理说明大肠杆菌培养条件和操作要求原理试验目标试验目标设备及用具：见书本设备及用具：见书本21页页大肠杆菌的培养和分离第21页二、大肠杆菌培养和分离试验操作二、大肠杆菌培养和分离试验操作（一）培养基配置与灭菌（一）培养基配置与灭菌取取2个个250ml三角瓶中分别装入三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基液体培养基和和50mlLB固体培养基（刚配好，还未凝固），加上封固体培养基（刚配好，还未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。LB液体液体培养基培养基细菌扩大培养细菌扩大培养LB固体固体培养基培养基细菌分离和保藏细菌分离和保藏封口膜：既通气封口膜：既通气又不使菌进入又不使菌进入大肠杆菌的培养和分离第22页（二）倒平板（二）倒平板灭菌后培养基在灭菌后培养基在无菌操作台无菌操作台上倒入上倒入4个培养皿中，倒后马个培养皿中，倒后马上置于上置于水平水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。待凝，使之形成平面。大肠杆菌的培养和分离第23页注意事项：注意事项：1、培养基灭菌后，需要冷却到、培养基灭菌后，需要冷却到60左右时，才能用左右时，才能用来倒平板。来倒平板。2、灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭、灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒。菌；桌面及人手用酒精棉球消毒。3、操作时右手无名指和小指、操作时右手无名指和小指夹住封口膜夹住封口膜,另外三指持另外三指持三角瓶三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖一边左手拿培养皿并打开上盖一边,在在酒酒精灯火焰精灯火焰旁旁操作操作.4、需要使锥形瓶瓶口经过火焰，、需要使锥形瓶瓶口经过火焰，灼烧灭菌。灼烧灭菌。5、平板冷凝后，要将、平板冷凝后，要将平板倒置平板倒置，既能够使培养基表面，既能够使培养基表面水分更加好地挥发，又能够预防皿盖上水珠落入培养水分更加好地挥发，又能够预防皿盖上水珠落入培养基，造成污染。基，造成污染。大肠杆菌的培养和分离第24页（三）大肠杆菌扩大培养（三）大肠杆菌扩大培养将斜面上培养大肠杆菌菌种接种到将斜面上培养大肠杆菌菌种接种到灭菌后液体培养灭菌后液体培养基基中中,使其在使其在37摇床培养摇床培养12小时。小时。注意事项注意事项:1、火焰旁火焰旁从斜面上用接种环取菌从斜面上用接种环取菌;2、取菌前、取菌前接种环接种环要用酒精灯要用酒精灯灼烧灼烧灭菌，冷却后方能取菌灭菌，冷却后方能取菌;3、取菌后封口膜和棉塞复原、取菌后封口膜和棉塞复原.大肠杆菌的培养和分离第25页（四四）大肠杆菌划线分离）大肠杆菌划线分离分离方法分离方法:划线分离法和涂布分离法划线分离法和涂布分离法大肠杆菌的培养和分离第26页平板划线操作平板划线操作1、划线分离法：、划线分离法：无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基平板上连续划线平板上连续划线.大肠杆菌的培养和分离第27页不能使用脱不能使用脱脂棉，不然脂棉，不然轻易吸水，轻易吸水，造成污染。造成污染。大肠杆菌的培养和分离第28页一旦划破，会造成划线不均匀，难一旦划破，会造成划线不均匀，难以到达分离单菌落目标；以到达分离单菌落目标；二是存留在划破处单个细胞无法形二是存留在划破处单个细胞无法形成规矩菌落，菌落会沿着划破处生成规矩菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状菌落。长，会形成一个条状菌落。大肠杆菌的培养和分离第29页大肠杆菌的培养和分离第30页分离后分离后,一个菌体一个菌体便会形成一个菌落便会形成一个菌落,这是这是消除污染杂消除污染杂菌通用方法菌通用方法,也是也是用于用于筛选高表示量筛选高表示量菌株菌株最简便方法之最简便方法之一。一。大肠杆菌的培养和分离第31页大肠杆菌的培养和分离第32页（四四）大肠杆菌划线分离）大肠杆菌划线分离注意事项注意事项:1、接种环、接种环只蘸一次菌液只蘸一次菌液，但要在培养基不一样位置，但要在培养基不一样位置连续划线屡次连续划线屡次。2、划线、划线首尾不能相接。首尾不能相接。3、划线后，培养皿、划线后，培养皿倒置培养倒置培养1224h。1、划线分离法、划线分离法大肠杆菌的培养和分离第33页 1.1.为何在操作第一步以及每次划线之前都要为何在操作第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，依然需要灼灼烧接种环？在划线操作结束时，依然需要灼烧接种环吗？为何？烧接种环吗？为何？答：操作第一步灼烧接种环是为了答：操作第一步灼烧接种环是为了防止接种环上可防止接种环上可能存在微生物污染培养物；能存在微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为每次划线前灼烧接种环是为了了杀死上次划线结束后，接种环上残留菌种杀死上次划线结束后，接种环上残留菌种，使下一次，使下一次划线时，接种环上菌种直接起源于上次划线末端，从而划线时，接种环上菌种直接起源于上次划线末端，从而经过划线次数增加，使每次划线时菌种数目逐步降低，经过划线次数增加，使每次划线时菌种数目逐步降低，方便得到菌落。方便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接杀死接种环上残留菌种，防止细菌污染环境和感染操作者。种环上残留菌种，防止细菌污染环境和感染操作者。大肠杆菌的培养和分离第34页 2 2、在灼烧接种环之后，为何要等其冷却后、在灼烧接种环之后，为何要等其冷却后再进行划线？再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3 3、在作第二次以及其后划线操作时，为、在作第二次以及其后划线操作时，为何总是从上一次划线末端开始划线？何总是从上一次划线末端开始划线？答：答：划线后，线条末端细菌数目比线条起划线后，线条末端细菌数目比线条起始处要少，每次从上一次划线末端开始，始处要少，每次从上一次划线末端开始，能使能使细菌数目伴随划线次数增加而逐步降低，最终细菌数目伴随划线次数增加而逐步降低，最终能得到由单个细菌繁殖而来菌落。能得到由单个细菌繁殖而来菌落。大肠杆菌的培养和分离第35页2、涂布分离法、涂布分离法:是指将培养菌液稀释一定倍数是指将培养菌液稀释一定倍数,然后取一定量稀释然后取一定量稀释液加在固体培养基上液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.大肠杆菌的培养和分离第36页划线分离法和涂布分离法哪个更加好呢？划线分离法和涂布分离法哪个更加好呢？划线分离：划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。单菌落更易分开，但操作复杂。大肠杆菌的培养和分离第37页（五五）大肠杆菌分离后保留）大肠杆菌分离后保留1 1、暂时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成、暂时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于后置于44冰箱保留。冰箱保留。2 2、长久保留：甘油冷冻管藏法。、长久保留：甘油冷冻管藏法。大肠杆菌的培养和分离第38页1、怎样操作才能够尽可能防止被杂菌污染、怎样操作才能够尽可能防止被杂菌污染?(1)(1)胆大心细，操作快捷。胆大心细，操作快捷。（2 2）注意灭菌操作标准，灭菌彻底，降低环境）注意灭菌操作标准，灭菌彻底，降低环境污染概率。污染概率。（3 3）注意微生物生长条件，如）注意微生物生长条件，如PHPH、渗透压、温、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜37C37C；霉菌喜；霉菌喜酸，喜糖，喜酸，喜糖，喜25-30C25-30C。课后习题：课后习题：大肠杆菌的培养和分离第39页2、在培养后怎样判断是否有杂菌污染、在培养后怎样判断是否有杂菌污染?（1）菌落形态菌落形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区分细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。是区分细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）显微镜观察其形态、大小。显微镜观察其形态、大小。看是否有菌丝、孢子看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区分细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。、芽孢。是区分细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（3）上述方法较难区分同类不一样物种，需借助化学）上述方法较难区分同类不一样物种，需借助化学和深入形态观察，如用和深入形态观察，如用革兰氏染色法革兰氏染色法等。等。大肠杆菌的培养和分离第40页3、进行恒温培养时为何要将培养皿倒置、进行恒温培养时为何要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中水分会以水蒸气形恒温培养时，培养基中水分会以水蒸气形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；假如正放，则水分形成水水滴留在盖上；假如正放，则水分形成水滴会落入培养基表面并扩散开。假如培养滴会落入培养基表面并扩散开。假如培养皿中已形成菌落，则会造成菌随水扩散，皿中已形成菌落，则会造成菌随水扩散，极难再分成单菌落，达不到分离目标。极难再分成单菌落，达不到分离目标。大肠杆菌的培养和分离第41页4、试验完成后，接种过细菌器皿应怎样处理、试验完成后，接种过细菌器皿应怎样处理?全部接触过菌器皿都要先高压灭菌后再全部接触过菌器皿都要先高压灭菌后再洗涤（尤其是培养基）；使用后废弃物洗涤（尤其是培养基）；使用后废弃物也要高压灭菌后再抛弃。也要高压灭菌后再抛弃。5、假如分离是转基因大肠杆菌，怎样确保不被普通大肠、假如分离是转基因大肠杆菌，怎样确保不被普通大肠杆菌所污染杆菌所污染?转基因用质粒不是细菌中原有，而是经过改转基因用质粒不是细菌中原有，而是经过改造，通常加入了抗性基因造，通常加入了抗性基因DNADNA序列，所以可序列，所以可用含有对应抗生素培养基对菌体进行培养。用含有对应抗生素培养基对菌体进行培养。大肠杆菌的培养和分离第42页【课堂练习课堂练习】例例1 1关微生物营养物质叙述中，正确是（关微生物营养物质叙述中，正确是（）A.A.是碳源物质不可能同时是氮源是碳源物质不可能同时是氮源 B.B.凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量 C.C.除水以外无机物只提供无机盐除水以外无机物只提供无机盐 D.D.无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量D大肠杆菌的培养和分离第43页例例2 2下面对发酵工程中灭菌了解下面对发酵工程中灭菌了解不正确不正确不正确不正确是（是（）A.A.预防杂菌污染预防杂菌污染 B.B.接种前菌种要进行灭菌接种前菌种要进行灭菌C.C.培养基和发酵设备都必须灭菌培养基和发酵设备都必须灭菌 D.D.灭菌必须在接种前灭菌必须在接种前B大肠杆菌的培养和分离第44页编号编号n成份含量含量粉状硫粉状硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2HPOHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gHH2 2OO100ml100ml例例3 3右表是某微生物培右表是某微生物培养基成份，请据此回答：养基成份，请据此回答：（1 1）右表培养基可培养）右表培养基可培养微生物类型是微生物类型是 。自养型微生物自养型微生物（2）若除去成份）若除去成份，加入（加入（CH2O），该培），该培养基可用于培养养基可用于培养。（3）表中营养成份共）表中营养成份共有有类。类。固氮微生物固氮微生物3大肠杆菌的培养和分离第45页（4 4）不论何种培养基，在各种成份都）不论何种培养基，在各种成份都溶化后分装前，要进行是溶化后分装前，要进行是 。（5 5）右表中各成份重量确定标准是）右表中各成份重量确定标准是 。（6 6）若右表培养基用于菌种判定，应）若右表培养基用于菌种判定，应该增加成份该增加成份 。调整调整pHpH依微生物生长需要确定依微生物生长需要确定琼脂（或凝固剂）琼脂（或凝固剂）大肠杆菌的培养和分离第46页n超净工作台超净工作台大肠杆菌的培养和分离第47页大肠杆菌的培养和分离第48页