4-甲基伞形酮类显色底物的合成及在微生物检测中的应用研究.pdf

井冈山大学学报（自然科学版）24文章编号：1674-8085（2023）04-0024-064-甲基伞形酮类显色底物的合成及在微生物检测中的应用研究3*尹 伟1,2,3，胡 琪2，李新章2，周清浩3(1.合肥职业技术学院生物工程学院，安徽，合肥238000；2.南通睿沣新材料技术有限公司化学成分分析中心，江苏，南通226000；3.中国科学技术大学高分子科学与工程系中科院软物质化学重点实验室，安徽，合肥230026）摘 要：以简单原料葡醛内酯，经过3步反应，对伞形酮类显色底物4-甲基-7-氧香豆素-D-葡萄糖苷酸进行了合成，目标产物中涉及的各步中间体，均通过核磁（1H-NMR、13C-NMR）等方法进行了分析表征，确定了合成工艺的可靠性。同时，通过病原微生物的荧光显色实验显示，4-甲基-7-氧香豆素-D-葡萄糖苷酸与大肠杆菌代谢酶结合反应后，显色效果较好，能够快速精准的检测出大肠杆菌。关键词：4-甲基伞形酮；显色底物；微生物；合成工艺中图分类号：Q623.52文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1674-8085.2023.04.005SYNTHESIS OF OF 4-METHYLUMBELLIFERONE CHROMOGENICSUBSTRATEAND ITSAPPLICATION IN MICROBIALDETECTION*YIN Wei1,2,3,HU Qi2,LI Xin-zhang2,ZHOU Qin-hao3（1.School of Bioengineering,Hefei Vocational and Technical College,Hefei,Anhui 238000,China;2.ChemicalCompositionExtraction,SeparationandIdentificationCenterofNantongRuifengNewMaterialTechnologyCo.,Ltd.,Nantong,Jiangsu226000,China;3.Department of Polymer Science and Engineering,University of Science and Technology of China,ChineseAcademy of Sciences Key Laboratory of MaterialChemistry,Hefei,Anhui 230026,China）Abstract:The umbelliferone chromogenic substrate 4-methyl-7-oxocoumarin-D-glucuronide was synthesizedfrom a simple raw material glucuronide through three-step reaction,the involved intermediates in each step wereanalyzed and characterized by nuclear magnetic resonance(1H-NMR,13C-NMR)and other means,and thereliability of the synthesis process was confirmed.At the same time,the fluorescence color developmentexperiment of pathogenic microorganisms showed that the color development effect was good after the bindingreaction of 4-methyl-7-oxocoumarin-D-glucuronide with the metabolic enzymes of Escherichia coli,and itcould quickly and accurately detect E.coli.Key words:4-methylumbelliferone;chromogenic substrate;microorganism;synthesis process收稿日期：2022-07-27；修改日期：2023-01-08基金项目：国家自然科学基金项目(21875234)；安徽省高校自然科学研究项目(KJ2021ZD0158，KJ2021ZD0159)；安徽省高校优秀青年人才支持计划重点项目(gxyqZD2022124)；安徽省教育厅质量工程项目(2020zyk33)作者简介：*尹伟(1983-)，男，安徽合肥人，教授，博士，主要从事药物、化工中间体的合成研究(E-mail:).病原微生物在自然界中广泛存在，它们是形体微小、种类及数量繁多的一类低等生物体，需借助光学或电子显微镜才得以观察，对人和动物能够产生严重的致病性。近些年，由病原微生物所引起的严重疾病，如阿米巴痢疾、疟疾、H7N9型禽流感、SARS以及目前仍在全球蔓延的新型冠状病毒（2019-nCoV）等，是危害食品安全及医疗卫生的重要因素之一，在人与人及人与动物之间传染性非常强，若被重视程度不够，将会引起全球范围内的大流行1-4。目前微生物的检测方法，主要包括微生物免疫学检测技术及分子生物学检测技术，如酶联免第44卷第4期Vol.44 No.4井冈山大学学报(自然科学版)2023年7月Jul.2023Journal of Jinggangshan University(Natural Science)24井冈山大学学报（自然科学版）25疫吸附检测技术（ELISA）、免疫磁珠分离技术（IMBS）、聚合酶链是反应检测技术（PCR）、基因芯片检测技术等。由于这些传统检测方法伴有时效低、过程繁杂以及成本较高等缺点，如何做到快速、精准、高效的检测出病原微生物是摆在研究者面前亟待解决的课题5-9。显色培养基是在传统的微生物检测培养基中，加入一类与微生物代谢产生酶而进行反应的化合物（胞内酶反应），随之通过肉眼可见或者荧光等条件下显示出一定的颜色，最终鉴别出病原微生物。显色培养基的出现，提高了检测的时效性、准确性，为后期针对性的杀死病原微生物提供了强有力的保障10-12。研究发现13-14，培养基显色底物主要有硝基苯胺类、香豆素类等，各种取代的香豆素，如氨基香豆素、羟基香豆素是糖苷酶的特异性显色或荧光底物，4-甲基-7-氧香豆素-D-葡萄糖苷酸在微生物酶（-葡萄糖苷酶）活力测试上具有很高价值。本研究在前期研究的基础上，通过常见的原料葡醛内酯，对4-甲基-7-氧香豆素-D-葡萄糖苷酸显色底物进行了合成，合成中通过改良的酯化反应、缩合及水解反应等，收率及纯度都较高，通过核磁（1H-NMR、13C-NMR）等手段对目标化合物进行了表征分析，后期课题组拟通过酶参反应对其关键步骤进行合成。有文献报道15-16，该显色底物的合成过程，一般是以D-吡喃葡萄糖作为起始原料，通过酰化反应等，浓酸催化剂，同时进行选择性的溴代，最终与香豆素进行反应得到显色底物，但收率较低，过程较为复杂，且涉及浓酸浓碱，增加了实验的危险性。本研究优化了4-甲基伞形酮类显色底物的合成路线（详见图1），有较多优点：（1）原料简单易采购，价格低廉；（2）改良反应，整体合成步骤相对较少；（3）合成路线中涉及到的浓酸浓碱等试剂较少，降低了实验的危险性。同时，本研究亦考察了病原微生物的生物学实验，验证合成底物的显色效果，为病原微生物的检测提供了参考。图1显色底物4-甲基-7-氧香豆素-D-葡萄糖苷酸的合成工艺路线Fig.1 Synthesis process of 4-methyl-7-oxycoumarin-D-glucosidate as chromogenic substrate1实验部分1.1试剂与仪器（1）主要试剂：D-葡醛内酯（购于上海源叶生物科技有限公司）；乙酸酐（购于国药试剂有限公司）；乙酸钠（购于安田化学有限公司）；NaHCO3（购于潍坊海滨化工有限公司）；二氯甲烷（购于上海凯茵化工有限公司）；4-甲基伞形酮（购于阿拉丁试剂有限公司）；DMAP（购于安徽英瑞骐生物科技有限公司）；冰醋酸（购于国药试剂有限公司）；BF3OEt2（购于阿拉丁试剂有限公司）；H2CO4（购于苏州华鑫化工有限公司）；无水乙醚（购于国药试剂有限公司）；丙酮（购于国药试剂有限公司）；蛋白胨（购于三门峡市高瑞生物技术有限公司）；硫酸锰（购于湖北莱德生物科技井冈山大学学报（自然科学版）26有限公司）；硫酸锌（购于天津市新欣生物技术有限公司）；硫酸镁（购于国药试剂有限公司）；磷酸二氢钾（购于济南行健生物科技有限公司）；磷酸氢二钠（购于济南行健生物科技有限公司）；去氧胆酸钠（购于青岛隆川生物科技有限公司）；亚硫酸钠（购于国药试剂有限公司）。（2）主要仪器：旋转蒸发仪（型号：R220，购于上海生申生科技有限公司）；真空干燥箱（型号：ZDF-5，购于南京卓鼎干燥设备有限公司）；电子天平（型号：ESJ-A，购于沈阳龙腾电子有限公司）；集热式加热搅拌器（型号：08-2G，购于上海梅颍浦仪器仪表有限公司）；紫外灯（型号：ZF-2，购于杭州齐威仪器有限公司）；高压灭菌锅（型号：LMQ-C-50E，购于济南卓隆生物科技有限公司）；恒温培养振荡器（型号：ZD-82，购于常州市臣明实验仪器科技有限公司）；恒温水浴锅（型号：XY-SYG，购于上海昕仪仪器仪表有限公司）。1.2实验过程1.2.1化合物3的合成（1,2,3,4-四-O-乙酰基-D-葡萄糖醛酸甲酯）图2 1,2,3,4-四-O-乙酰基-D-葡萄糖醛酸甲酯的合成工艺路线Fig.2 Synthesis process route of 1,2,3,4-tetra-o-acetyl-D-glucuronic acid methyl ester在N2保护下，将NaOH(100 mg，0.25 mmol)、甲醇（180 mL）加入到三颈烧瓶（250 mL）中，剧烈搅拌1h，使其完全溶解。用冰浴冷却至0，在1 h内，分3次加入D-葡醛内酯(25 g，0.14 mol)，葡醛内酯完全溶解后，减压旋蒸除去溶剂，得到浅黄色泡沫状固体，真空干燥4 h。接着向装有浓缩物的烧瓶中加入乙酸酐（250 mL）及无水乙酸钠（47.5 g，0.51 mol），在N2保护下，将混合物加热至40，反应4 h。冷却后将浅棕色反应液倒入冰水中，加NaHCO3调节至中性。反应液用CH2Cl2萃取(250 mL 2)，接着将有机相依次用去离子水（200 mL 3）、饱和NaHCO3溶液（200 mL3）、饱和食盐水（200 mL 2）洗涤，用无水Na2SO4、无水MgSO4干燥，滤液减压浓缩，无水乙醇重结晶，最终得到白色固体(64.0 g，60.0%)。产物表征：1H-NMR（500 MHz，CDCl3)：5.79（d，J=7.9Hz，1H），5.32（d，J=9.2Hz，1H），5.26（t，J=9.3Hz，1H），5.15（t，J=8.3Hz，1H），4.20（d，J=9.6Hz，1H），3.75（s，3H），2.13（s，3H），2.08（s，3H），2.06（s，3H），2.05（s，3H）。1.2.2化合物2的合成（4-甲基伞形酮-2,3,4-三-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖苷）图3 4-甲基伞形酮-2,3,4-三-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖苷的合成工艺路线Fig.3 Synthesis process route of 4-methylumbellet-2,3,4-tris-O-acetyl-D-glucopyranoside在100 mL三颈烧瓶中加入化合物3（0.376 g，1.0 mmol）、干燥的1,2-二氯乙烷（5 mL）中，使之完全溶解，随后加入4-甲基伞形酮（0.088 g，0.5 mmol），室温 搅拌0.5 h，再加入DMAP（0.245 g，4.0 mmol)，室温搅拌2 h，随后加入BF3OEt2约5.0 mL，室温搅拌2 h，随后升温至80，反应8 h，通过硅胶柱分离纯化乙酸乙酯:正己烷=1:1(V乙酸乙酯:V正己烷)，得到白色固体粉末，收率69.3%。1.2.3化合物1的合成（4-甲基-7-氧香豆素-D-葡萄糖苷酸）图4 4-甲基-7-氧香豆素-D-葡萄糖苷酸的合成工艺路线Fig.4 Synthesis process of 4-methyl-7-oxycoumarin-D-glucosidic acid在N2保护下，在三颈烧瓶中加入Ba(OH)2H2O（71mg，0.0.38mmol）、甲醇（10mL）、水（5mL）井冈山大学学报（自然科学版）27中，搅拌2 h，在冰浴中加入化合物2（62 mg,0.13 mmol），反应在冰水浴中搅拌8 h，随后加入冰醋酸，调节pH值，有固体物产生。将固体滤出，用甲醇洗涤，重结晶后干燥。在冰浴中，将得到的 钡 盐 产 物，加 至 甲 醇（10 mL)中，用H2CO42H2O（40 mg，0.32 mmol）酸化，搅拌2 h，过滤，用甲醇洗涤，合并滤液后减压旋蒸，固体重结晶，得到白色固体67.0 mg，收率75.0%。1.2.4微生物检测（荧光反应）荧光反应实验依据文献方法17进行，精确称取蛋白胨等试剂，详见表1，使用去离子水将所用试剂溶解，定容至1 L，调pH值（pH 7.3 0.1）。将培养基恒速搅拌，加热煮沸至全溶，装至试管中，每个试管5.0 mL，高温高压灭菌（115，0.5 h）。取待检样品（大肠杆菌）接种至试管中，37培养，分别在0、2、6、10 h，在紫外灯（365 nm）下，观察两组（PBS组、4-MUG组）试管的颜色变化情况。表1 4-甲基伞形酮荧光显色实验试剂Table 1 Reagents for 4-methyl umbelliferone fluorescencechromogenic experiment序号成分质量/g1蛋白胨10.02硫酸锰0.00053硫酸锌0.00054硫酸镁0.15氯化钠5.06磷酸二氢钾0.97磷酸氢二钠6.28亚硫酸钠0.049去氧胆酸钠1.0104-MUG0.0752结果与讨论2.1化合物合成部分2.1.1化合物 2 2 的结构分析4-甲基伞形酮-2,3,4-三-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖苷为白色固体，经过NMR（1H、13C）数据分析鉴定为合成目标物详见图3。产物表征：1H-NMR(500 MHz，CDCl3):7.52（d，J=8.7 Hz，1H），7.04 6.92（m，2H），6.17（d，J=1.1 Hz，1H），5.84（d，J=2.3 Hz，1H），5.15 5.23（m，2H），5.02 5.04（m，1H），4.86（d，J=1.7 Hz，1H），3.72（s，3H），2.36（s，3H），2.16（s，3H），2.11（s，3H），2.08（s，3H）；13C-NMR(125MHz，CDCl3)：169.74，169.28，168.81，167.82，160.79，158.41，154.88，152.23，125.76，115.54，113.09，112.70，104.50，98.12，72.58，71.66，70.81，68.87，52.70，20.71（CH3 2），20.52，18.65。HRMS（ESI）：m/z M+Na+Calcd forC23H24NaO12：515.1160；found：515.1165。2.1.2化合物 1 的合成4-甲基-7-氧香豆素-D-葡萄糖苷酸为白色固体，经过NMR（1H、13C）数据分析鉴定为合成目标物详见图4。产物表征：1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)：7.70（d，J=8.3Hz，1H），7.007.17（m，2H），6.24（s，1H），5.21（d，J=6.3，1H），3.98（d，J=8.8Hz，1H），3.283.37（m，3H），2.38（s，3H）。13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)：170.21，160.11，159.64，154.35，153.29，126.51，114.15，113.16，111.72，102.95，99.21，75.69，75.23，72.79，71.23，18.10。2.2微生物检测部分显色培养基作为一种兼顾分离与鉴定功能的新型培养基，在近些年其研究发展迅速，其在检测时的灵敏度与特异性方面，显著优于传统检测培养基。显色培养基主要是在传统培养基中加入了特殊显色底物，且能够显著的分散在培养基中，与被检测微生物在自身代谢过程中产生特异性酶的有效结合，进而发生特异性的化学反应，使得显色底物发生酶解、水解等，在培养皿中显现出特殊的颜色，进而依据颜色的变化，鉴别出病原微生物的种类18-21。病原微生物体内含有多种特异性的酶，由于这些特异性酶与显色底物具有相关特殊的反应，最终显示出特殊的颜色。显色底物一般都是通过人工合成，与病原微生物结合反应后，在显色板上呈现出特殊颜色，实验人员可以直接观察病原井冈山大学学报（自然科学版）28微生物菌落的颜色，从而对病原微生物的种类进行鉴定，并达到筛选目的，此方法在检测的时效性以及检测成本上都具有显著优势。4-甲基伞形酮类显色底物，与病原微生物结合后，在微生物的生长条件下，结合微生物代谢的相关酶，发生特异性的生化反应，进而游离出具有荧光基团的4-甲基伞形酮，在紫外灯特殊波长的照射下，显示出不同强度的蓝色荧光21-24。本实验将对照组（PBS组）及4-甲基-7-氧香豆素-D-葡萄糖苷酸（4-MUG组），在010 h内，在紫外灯（365 nm）下持续观察两组在0、2、6、10 h的荧光颜色变化情况，研究发现，PBS空白对照组，整个实验过程中，颜色始终没有发生变化，而4-MUG组，在2 h时就出现蓝白色，随着时间推移，在6 h时就出现显著亮蓝色，一直持续至10 h左右，同PBS对照组相比，颜色变化明显（详见图5）。主要原因是4-甲基伞形酮类显色底物，与病原微生物（大肠杆菌等）产生的酶发相应的生生化反应，进而游离出能呈现荧光基团的4-甲基伞形酮物质25-26，在紫外光下显蓝色荧光（详见图6）图5 4-甲基-7-氧香豆素-D-葡萄糖苷酸（4-MUG）荧光显色效果Fig.5 Fluorescence color development effect of 4-methyl-7-oxycoumarin-D-glucosidic acid(4-MUG)图6 4-甲基伞形酮类显色底物显色原理Fig.6 Color development principle of 4-methyl umbelliferonecolor substrate3小结食品安全、医疗卫生等受到病原微生物的污染问题，日益受到人们广泛关注，能否高效、简便的检测出病原性微生物，而且由病原微生物引发的疾病呈显著上升趋势，这些问题已经在全球范围内引起了科学家的高度重视。传统病原微生物的检测方法，如生化鉴定方法等，对特殊致病菌的检测特异性较差及时效性较低等。近几年，4-甲基伞形酮类显色底物的合成与应用发展非常迅速，在病原微生物检测、食品安全以及生物检测等领域运用广泛，其检测的主要原理是基于荧光底物或显色底物在特殊酶的诱导下，发生特异性的反应，如水解反应等，进而间接证明特定病原微生物的存在情况或者活力大小等。4-甲基伞形酮类显色底物作为香豆素类化合物，受到广泛的关注，特别是在病原微生物检测方面显得尤为重要。本研究通过常见原料葡醛内酯，对4-甲基-7-氧香豆素-D-葡萄糖苷酸进行了全合成，通过核磁氢谱、碳谱进行了结构确证分析，本合成工艺较为简单，原料成本较低，操作过程较为简单、可行。同时，本实验亦通过4-甲基-7-氧香豆素-D-葡萄糖苷酸显色底物对大肠杆菌的显色实验，验证了其具有很好的荧光显色能力，能够快速、精准、有效的检测出病原微生物。参考文献：1孟晓琴,崔彦,蒲万霞.显色培养基在金黄色葡萄球菌检测中的应用研究J.中兽医医药杂志,2018,37(4):34-36.2 Zhang J,Zhang Y,Shi C L.The detection of enterotoxingeneanditsexpressionoffoodbornestaphylococcusaureusJ.J.Chin.Instit.Food 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