CXCL9在乳腺癌中的表达及其与肿瘤免疫浸润特征的相关性研究.pdf

Vol.43 No.7 Jul.2023上海交通大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)CXCL9 在乳腺癌中的表达及其与肿瘤免疫浸润特征的相关性研究杜少倩，陶梦玉，曹源，王红霞，胡孝渠，范广建#，臧丽娟#上海交通大学医学院附属第一人民医院肿瘤中心，上海 201600摘要 目的探究C-X-C模体趋化因子配体9（C-X-C motif chemokine ligand 9，CXCL9）表达对乳腺癌患者预后的影响及其与肿瘤浸润免疫细胞（tumor-infiltrating immune cell，TIIC）的相关性。方法从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库获得乳腺癌患者的1 100例癌组织和112例癌旁组织的转录组数据，并采用CIBERSORT反卷积算法分析乳腺癌免疫微环境中TIIC亚群比例及其对患者的预后影响。分别从TCGA数据库、ImmPort数据库和GEPIA2数据平台下载差异表达基因、免疫相关基因和乳腺癌预后相关基因，运用R语言分析该3类基因集的相交关系，以筛选目的基因。根据已下载的转录组数据，分析CXCL9的正相关基因、CXCL9 mRNA在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达差异及其对患者预后的影响。利用STRING数据平台对CXCL9进行蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析，利用R语言对CXCL9正相关基因和PPI网络获得的互作蛋白对应的基因行基因本体数据库（Gene Ontology，GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）通路分析。运用Spearman相关系数分析CXCL9 mRNA表达与TIIC亚群、免疫检查点相关基因的相关性。收集60例乳腺癌患者的石蜡组织样本并制成组织芯片，采用免疫组织化学染色（immunohistochemistry staining，IHC）分析芯片中CXCL9表达和CD8+T细胞浸润的相关性。采用多重荧光免疫组织化学染色（multiplex immunohistochemistry staining，mIHC）分析芯片中乳腺癌组织间质内CXCL9+细胞的类型。采用Kaplan-Meier（KM）生存曲线分析CXCL9 mRNA表达、CD8+T细胞浸润双因素对乳腺癌患者预后的影响。结果CIBERSORT算法分析显示乳腺癌免疫微环境中TIIC亚群的分布比例差异大，其对患者的预后影响也大不相同。绘制上述3类基因集的韦恩图，筛选出目的基因CXCL9。获得与CXCL9正相关的前150个基因。在乳腺癌4种分子分型中CXCL9 mRNA的表达水平高于癌旁组织（均P=0.000），且其高表达与患者的良好预后相关（HR=0.624，P=0.013）。通过PPI网络分析共获得41个互作蛋白。GO和KEGG分析的结果显示，CXCL9及其相关基因主要富集在免疫调控相关的生物功能和通路。Spearman相关系数分析的结果显示，CXCL9 mRNA表达与CD8+T细胞的浸润比例呈正相关，与M2型巨噬细胞的浸润比例呈负相关，且与多数免疫检查点基因的表达呈正相关（均P0.05）。IHC实验结果显示，相较于癌旁组织，乳腺癌组织中CXCL9的表达较高，且伴随CD8+T细胞浸润比例增加（P=0.000）；mIHC结果发现，乳腺癌间质中CXCL9在部分CD68+肿瘤相关巨噬细胞和CD11c+树突状细胞内表达。KM生存曲线显示，当CXCL9高表达时，CD8+T细胞高浸润才能延长乳腺癌患者的生存期。结论CXCL9可作为乳腺癌患者良好预后的生物标志物，在乳腺癌微环境中CXCL9的高表达与CD8+T细胞的浸润比例呈正相关并可能激活其抗肿瘤作用。同时，CXCL9的表达可能与肿瘤组织中募集淋巴细胞至肿瘤微环境发挥抗肿瘤免疫应答功能密切相关。关键词乳腺癌；C-X-C模体趋化因子配体9；肿瘤免疫浸润；生物信息学分析；CD8+T细胞DOI10.3969/j.issn.1674-8115.2023.07.008 中图分类号R737.9 文献标志码ACXCL9 expression in breast cancer and its correlation with the characteristics of tumor immunoinfiltrationDU Shaoqian,TAO Mengyu,CAO Yuan,WANG Hongxia,HU Xiaoqu,FAN Guangjian#,ZANG Lijuan#Department of Oncology Center,Shanghai General Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 201600,China论著 基础研究基金项目 上海申康医院发展中心临床三年行动计划（SHDC2020CR2065B，SHDC2020CR5005）；浙江省自然科学基金（LY20H160010）。作者简介 杜少倩（1997），女，硕士生；电子信箱：。通信作者 臧丽娟，电子信箱：。范广建，电子信箱：。#为共同通信作者。Funding Information Clinical Research Plan of Shanghai Hospital Development Center(SHDC2020CR2065B,SHDC2020CR5005);Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LY20H160010).Corresponding Author ZANG Lijuan,E-mail:.FAN Guangjian,E-mail:.#Co-corresponding authors.860杜少倩，等CXCL9在乳腺癌中的表达及其与肿瘤免疫浸润特征的相关性研究http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（7）Abstract Objective To explore the effect of C-X-C motif chemokine ligand 9(CXCL9)expression on the prognosis of breast cancer patients and its correlation with tumor-infiltrating immune cells(TIICs).Methods Transcriptome data of 1 100 breast tumor tissues and 112 adjacent tissues were obtained from The Cancer Genome Atlas(TCGA)database.CIBERSORT deconvolution algorithm was used to analyze the proportion of TIIC subgroups in breast cancer immune microenvironment and its effect on the prognosis of patients.Differentially expressed genes,immune-related genes and breast cancer prognostic-related genes were downloaded from TCGA database,ImmPort database and GEPIA2 data platform,respectively.The intersection relationships of the three gene sets were analyzed by using R language,and the target genes were screened.Based on the downloaded transcriptome data,CXCL9 positive-related genes,the difference of CXCL9 mRNA expression in breast cancer tissues and adjacent tissues and its effect on the prognosis of patients were analyzed.STRING data platform was used to analyze the protein-protein interaction(PPI)network of CXCL9.Gene Ontology(GO)function analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome(KEGG)pathway analysis were performed on CXCL9 positive correlation genes and the genes corresponding to the interacting proteins obtained from the PPI network by using R language.Spearman correlation coefficient was used to analyze the correlation between CXCL9 mRNA expression and TIIC subgroups and immune checkpoint-related genes.Paraffin tissue samples of 60 clinical breast cancer patients were collected and made into tissue chips.The correlation between CXCL9 expression and CD8+T cells infiltration in the tissue chips was detected by immunohistochemical staining(IHC).The types of CXCL9+cells in breast cancer interstitium were analyzed by multiplex immunohistochemistry staining(mIHC).Kaplan-Meier(KM)survival curve was used to analyze the effect of CXCL9 mRNA expression and CD8+T cell infiltration on the prognosis of breast cancer patients.Results CIBERSORT algorithm analysis showed that the distribution proportion of TIIC subgroups in breast cancer immune microenvironment varied greatly,and their effect on patients prognosis was also different.The Venn diagram of three types of gene sets was drawn,and CXCL9 was screened out.The top 150 positive correlation genes with CXCL9 were obtained.CXCL9 mRNA expression levels in four molecular types of breast cancer were higher than those in adjacent tissues(all P=0.000),and their high expressions were significantly associated with good prognosis of patients(P=0.013).A total of 41 interacting proteins were obtained through PPI network analysis.GO and KEGG analysis showed that CXCL9 and its related genes were mainly enriched in biological functions and pathways related to immune regulation.Spearman correlation coefficient analysis showed that the expression level of CXCL9 mRNA was positively correlated with CD8+T cells infiltration ratio,negatively correlated with M2-type macrophages infiltration ratio,and positively correlated with most immune checkpoint genes expression(all P0.05).IHC experiments showed that CXCL9 was highly expressed in breast cancer tissues compared with adjacent tissues,accompanied by an increased percentage of CD8+T cells infiltration(P=0.000).mIHC results showed that CXCL9 was expressed in some CD68+tumor-associated macrophages(TAMs)and CD11c+dendritic cells(DCs)in the stroma of breast cancer.KM survival curve showed that when CXCL9 was highly expressed,CD8+T cells high infiltration could prolong the survival of breast cancer patients.Conclusion CXCL9 can be used as a biomarker for good prognosis of breast cancer patients.The high expression of CXCL9 in the microenvironment of breast cancer is positively correlated with the infiltration ratio of CD8+T cells and may activate its anti-tumor effect.The expression of CXCL9 may be closely related to the recruitment of lymphocytes into the tumor microenvironment for anti-tumor immune response.Key words breast cancer;C-X-C motif chemokine ligand 9(CXCL9);tumor immunoinfiltration;bioinformatics analysis;CD8+T cell乳腺癌是女性最常见的癌症之一，也是女性癌症相关死亡的第二大原因1。据统计，2022年全球女性乳腺癌新发病例数约占所有新诊断癌症数的31%1，位居女性恶性肿瘤第1位，因其死亡的人数估计占女性癌症相关死亡总人数的15%。近年来，临床上常采用免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）对乳腺癌患者进行治疗，该方法虽能大幅提升转移性乳腺癌患者的总生存率2-4，但多数患者存在对免疫疗法无响应或在响应治疗后出现复发等问题，缓解率各不相同。因此，探究乳腺癌转移的分子机制并发现有潜力的预后生物标志物和分子靶点对于乳腺癌早期转移过程中的干预和治疗具有重要的科学意义。研究5-6显示，乳腺癌的侵袭性和耐药性可能是由于其肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的高度异质性所致。有研究发现，TME由肿瘤细胞、肿瘤浸润免疫细胞（tumor-infiltrating immune cell，TIIC）、细胞因子、趋化因子、细胞外基质等组成7，且各组分间的相互作用是TME异质性的重要原因之一，可直接或间接地促进肿瘤转移8-9。其中，有研究10已证实TIIC的数量和活动状态可决定结直肠癌患者的生存时间。相关研究11-13显示，运输和招募免疫细胞到肿瘤组织中是启动和传递抗肿瘤免疫反应的重要环节，而运输和招募过程需通过特定的免疫细胞受体与趋化因子结合来介导。同时，肿瘤细胞也可以通过免疫检查点抑制T细胞的激活，从而逃避免疫杀伤。与免疫细胞低浸润肿瘤（“冷”肿瘤）的患者相比，免疫细胞高浸润肿瘤（“热”肿瘤）的患者预后较好14，其更有可能从 ICI 中获益15-16。多种肿瘤类型的研究发现，CD8+T细胞浸润比例的增加与患者更好的预后相关14，且肿瘤抗原呈递和突变负荷是CD8+T细胞浸润相关的重要因8612023,43（7）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)素之一17-18。在TME中，长期的抗原暴露刺激可导致CD8+T细胞出现耗竭状态；在理想情况下，ICI则可逆转这种耗竭19-20。在本研究中，我们利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、STRING、ImmPort和GEPIA2等多个数据库进行生物信息学分析，描述乳腺癌TME中免疫细胞的浸润特征，并筛选得到目的基因即 C-X-C 模体趋化因子配体 9（C-X-C motif chemokine ligand 9，CXCL9）。而后，通过临床乳腺癌石蜡组织标本进行实验验证，探究CXCL9与乳腺癌TME中募集淋巴细胞并促进其发挥抗肿瘤免疫应答功能的相关性，旨在为CXCL9抑制乳腺癌进展的机制研究提供新的方向，并为其作为乳腺癌的良好预后标志物和治疗靶点提供新的证据。1资料与方法1.1公共数据来源从TCGA数据库（https：/）获得乳腺癌患者的1 100例癌组织和112例癌旁组织的转录组数据及其相应的临床信息。对上述乳腺癌组织进行筛选，其分子分型可用数据如下：三阴（triple-negative，TN）型 190 例、人类表皮生长因子受体 2 过表达（human epidermal growth factor receptor 2 over-expression，HER2+）型 82 例、管腔 A（Luminal A，LA）型564例、管腔B（Luminal B，LB）型217例。1.2生物信息学数据分析1.2.1乳腺癌微环境中 TIIC 的相关分析根据从TCGA数据库获取的转录组数据和患者临床信息，采用CIBERSORT反卷积算法评估乳腺癌微环境中22种TIIC 亚 群 的 比 例，并 通 过 R 语 言 ggplot2 包 和pheatmap 包绘制可视化聚类热图21；采用 Kruskal-Wallis检验分析TIIC亚群在4种分子分型间的占比差异。运用Kaplan-Meier（KM）生存曲线分析TIIC浸润水平与乳腺癌患者总生存期（overall survival，OS）的相关性。1.2.2目的基因CXCL9的筛选根据TCGA数据库的转录组数据，使用R语言limma包分析乳腺癌和癌旁组织的差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）；将校正P2作为DEG的筛选条件，取 log2（FC）2 的上调基因作为基因集一。从ImmPort 数据库（https：/www.immport.org/home）中下载免疫相关基因，记为基因集二。从GEPIA2数据平台（http：/gepia2.cancer- mRNA的表达分析及其对患者的预后影响根据从TCGA数据库获得的转录组数据和患者临床信息，在 GEPIA2 数据平台分析 CXCL9 mRNA在不同类型的癌症及其对应的正常组织中的表达，利用Kruskal-Wallis检验分析CXCL9 mRNA在乳腺癌和癌旁组织、不同分子分型乳腺癌间的表达差异。根据CXCL9 mRNA表达量的中位数将患者分为高表达组和低表达组，并利用KM生存曲线分析其表达与乳腺癌患者OS的相关性。1.2.4蛋白质相互作用网络的构建利用 STRING（http：/string-db.org）数据平台筛选CXCL9相关的互作 蛋 白 并 构 建 蛋 白 质 相 互 作 用（protein-protein interaction，PPI）网络。即以“相互作用蛋白的交互作用得分（中位数置信度）大于 0.4”作为筛选条件22，将获得的蛋白用以构建PPI网络，并将该网络中的所有蛋白对应的基因作为数据集一。1.2.5CXCL9及其相关基因的GO功能分析和 KEGG通路分析根据TCGA数据库获取的转录组数据，运用Spearman相关系数评估CXCL9和其他基因之间的相关性，并筛选出正相关系数中前150位的基因作为数据集二。使用R语言clusterProfiler包对数据集一和数据集二合并行基因本体数据库（Gene Ontology，GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）通路分析；其中，GO功能分析包括生物学过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）分析。设定P1.5为筛选标准。1.2.6CXCL9 mRNA表达与TIIC亚群的相关性分析及对患者 OS 影响运用 Spearman 相关系数分析 CXCL9 mRNA表达与乳腺癌微环境中TIIC亚群、免疫检查点基因的相关性。根据CXCL9 mRNA表达量中位数和CD8+T细胞浸润比例中位数分为4组，即组别1为CXCL9 mRNA低表达+CD8+T细胞低浸润、组别2为CXCL9 mRNA低表达+CD8+T细胞高浸润、862杜少倩，等CXCL9在乳腺癌中的表达及其与肿瘤免疫浸润特征的相关性研究http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（7）组别3为CXCL9 mRNA高表达+CD8+T细胞低浸润、组别4为CXCL9 mRNA高表达+CD8+T细胞高浸润，利用KM生存曲线分析CXCL9 mRNA表达和CD8+T细胞（TIIC亚群之一）浸润比例双因素对乳腺癌患者OS的影响。1.3组织标本收集选择 20162019年上海交通大学医学院附属第一人民医院的60例乳腺癌患者的石蜡组织样本（其中癌组织60例、癌旁组织40例），将其制作成组织芯片；采集患者的相关临床信息，包括肿瘤大小、分子分型、病理分期、生存时间等。1.4主要试剂及仪器二甲苯和乙醇（国药集团化学试剂有限公司），通用型强力抗原修复液（上海碧云天生物技术有限公司），多重荧光免疫组织化学试剂盒（OpalTM 7-Color Manual IHC Kit，Akoya Biosciences，美国），CD8抗体（Proteintech，美国），CXCL9 抗体（Affinity，美 国），CK7 抗 体、CD68 抗 体、CD11c 抗 体（Abcam，英国）。光学显微镜（Nikon，日本），全自动 定 量 病 理 成 像 分 析 系 统（PerkinElmer Vectra PolarisTM，美国）。1.5实验方法1.5.1CXCL9 表达水平及其与 CD8+T 细胞浸润的 相 关 性 分 析 采 用 免 疫 组 织 化 学 染 色（immunohistochemistry staining，IHC）对组织芯片中的乳腺癌和癌旁组织进行分析，即将芯片经65 烘烤60 min、二甲苯脱蜡、乙醇梯度浓度水化后，用通用型强力抗原修复液水浴修复20 min，自然冷却至室温。采用内源性生物素封闭液进行封闭后，一抗（CD8抗体、CXCL9抗体的工作浓度分别为1 20 000、1 200）4 孵育过夜。次日使用二抗增强液、增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物先后分别孵育20 min。DAB 辣根过氧化物酶显色后，采用苏木精染细胞核，随后乙醇梯度浓度脱水、二甲苯透明，封片后于显微镜下进行观察，统计CXCL9阳性、CD8阳性的细胞比例以及染色强度，并进行病理评分。具体标准如下：对阳性细胞的占比进行统计，即小于5%记为0分，5%25%记为1分，26%50%记为2分，51%75%记为3分，75%记为4分。对阳性细胞的染色强度进行统计，即淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分。将前述阳性细胞占比得分和染色强度得分相乘获得每个样本的分数，再将所有样本分数行Wilcoxon秩和检验。1.5.2乳腺癌间质 CXCL9+细胞种类分析采用多重 荧 光 免 疫 组 织 化 学 染 色（multiplex immunohistochemistry staining，mIHC）分析组织芯片中乳腺癌组织间质内的CXCL9+细胞种类，即将芯片进行烘烤、二甲苯脱蜡、乙醇梯度浓度水化、通用型强力抗原修复液水浴、自然冷却、内源性生物素封闭液封闭后，室温下一抗（CXCL9抗体的工作浓度为 1 200）孵育 12 h或 4 孵育过夜，而后于室温下使用多聚辣根过氧化物酶标记的鼠兔混合二抗孵育10 min，荧光染料室温孵育10 min。而后，在同一张芯片上重复3轮上述从抗原修复至荧光染料孵育的步骤，每轮仅孵育一种抗体（分别为CK7抗体、CD68抗体、CD11c抗体，工作浓度依次为 1 500、1 500、1 300），顺序自定，直至所有一抗被荧光染料逐一标记完成。于室温下，用DAPI工作液孵育芯片5 min，抗荧光淬灭封片剂进行封片。最后，采用全自动定量病理成像分析系统扫描组织芯片，观察乳腺癌组织间质内CXCL9阳性的细胞类型。1.6统计学分析使用R语言软件和GraphPad Prism 9软件进行数据分析和可视化作图。使用Wilcoxon秩和检验进行2组间比较，使用Kruskal-Wallis检验进行3组及以上比较。使用KM生存曲线对CXCL9 mRNA表达或TIIC浸润水平与乳腺癌患者 OS 的相关性进行分析。P0.05).C.Differential analysis of 22 types of TIICs in different molecular types of breast cancer(P=0.010,P=0.001,P0.05).图1乳腺癌TME中TIIC亚群的差异分析Fig 1Differential analysis of TIIC subgroups in breast cancer TME864杜少倩，等CXCL9在乳腺癌中的表达及其与肿瘤免疫浸润特征的相关性研究http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（7）的占比进行比较，结果（图1C）发现多数TIIC亚群在不同亚型中的占比差异明显，其中 CD8+T 细胞、滤泡辅助 T细胞、活化 NK细胞、巨噬细胞 M0、巨噬细胞 M1 在 TN 型和 HER2+型中的比例明显高于Luminal 型，活 化 的 肥 大 细 胞 和 巨 噬 细 胞 M2 在Luminal 型中的占比远高于另外 2 种分型（均 P0.05）。采用KM生存曲线分析TIIC浸润水平的高低与乳腺癌患者OS的相关性，结果（图2）显示在22种TIIC中，仅CD8+T细胞、巨噬细胞M1、滤泡辅助T细胞和T细胞的高浸润与乳腺癌患者较长的OS相关（均P2 的 275 个上调基因作为基因集一。从ImmPort 数据库获取 1 793 个免疫相关基因作为基因集二。从 GEPIA2 数据平台筛选出影响乳腺癌患者生存的前 500 个基因作为基因集三。利用 R 语言分析上述 3 个基因集相交关系并绘制韦恩图，筛选获得目的基因CXCL9（图 3B）。随后，通过GEPIA 数据平台分析 CXCL9 mRNA 在不同类型癌HR=0.773,P=0.000HR=1.35,P=0.000HR=0.802,P=0.003HR=0.855,P=0.049Low Macrophage M1High Macrophage M1Low Macrophage M2High Macrophage M2Low T cell gamma deltaHigh T cell gamma deltaLow T cell follicular helperHigh T cell follicular helper1.00.80.60.40.20Probability of survivalt/month20015010050-1.00.80.60.40.20Probability of survivalt/month20015010050-1.00.80.60.40.20Probability of survivalt/month20015010050-1.00.80.60.40.20Probability of survivalt/month20015010050-1.00.80.60.40.20Probability of survivalt/month20015010050HR=0.836,P=0.014Low T cell CD8+High T cell CD8+图2TME中TIIC浸润水平对乳腺癌患者预后影响Fig 2Effect of TIICs infiltration ratio in TME on the prognosis of breast cancer patients1 708249432CXCL921463BALog2(FC)-Lg PGene set 2Gene set 34003002001000-5-2250Gene set 1Up-regulated genes:log2(FC)2Down-regulated genes:log2(FC)-2Note：A.Volcano plot of DEGs between breast cancer tissues and adjacent tissues.B.Venn diagram of the target gene screened in the three gene sets.图3目的基因的筛选Fig 3Screening of target gene8652023,43（7）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)症中的表达水平，和部分癌种及其对应正常组织的差异表达，结果（图 4A）显示 CXCL9 mRNA 在乳腺癌、膀胱尿路上皮癌、胆管细胞癌、结肠腺癌、食管癌、胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、肝细胞癌、肺腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、胃腺癌、子宫内膜癌等癌组织中的表达均高于其对应的正常组织（均P0.05）。采用 Kruskal-Wallis检验对乳腺癌（不同分子分型）及其癌旁组织中CXCL9 mRNA的表达水平进行分析，结果（图4B）显示，CXCL9 mRNA在乳腺癌的4种分子分型中的表达水平高于癌旁组织（均P=0.000），在 TN 型和 HER2+型中的表达高于 Luminal型（均P0.05）。利用IHC对组织芯片进行分析，结果（图4C、D）显示相较于癌旁组织，乳腺癌组织内肿瘤上皮细胞普遍高表达CXCL9，且差异具有统计学意义（P=0.000），与上述生物数据库的分析结果一致。为进一步探讨CXCL9 mRNA表达与患者生存之间 的 关 系，我 们 使 用 KM 生 存 曲 线 评 估 CXCL9 mRNA 高表达和低表达对患者预后的影响。结果（图4E）显示，CXCL9 mRNA高表达与乳腺癌患者较长的OS有关（P=0.013）。2.3CXCL9 的 PPI 网络构建和 CXCL9 及其相关基因的GO功能、KEGG通路分析为进一步探讨CXCL9基因在肿瘤发生中的分子机制，本研究对 CXCL9相关的 PPI网络蛋白对应的基因、乳腺癌中与CXCL9表达正相关的基因行GO功能分析和KEGG富集分析。图5A显示构建的PPI网络包括了41个蛋白，我们将其对应的基因记为数据集一。同时，将乳腺癌中与CXCL9表达正相关的前150位基因记为数据集二。将上述 2个数据集合并，运用R语言对其行GO功能分析和KEGG通路分析。GO功能分析的结果（图5B）显示，多数基因与免疫细胞的生物过程有关，如适应性免疫应答、调节T细胞活化、免疫系统过程的负调控、免疫效应过程的调节、白细胞分化的调节、细胞因子产生的正调控等。KEGG通路分析的结果（图5C）显示，CXCL9可能通过参与病毒蛋白与细胞因子或细胞因子受体的相互作用、T细胞受体信号传导、自然杀伤细胞介导的细胞毒性等通路对TME中TIIC进行调节，来影响肿瘤发展及患者预后。2.4乳腺癌中 CXCL9 mRNA表达与 TIIC相关性分析本研究进一步探讨乳腺癌中 CXCL9 mRNA 表达水平与 TIIC 浸润丰度的关系。采用 Spearman 相关系数分析乳腺癌微环境中免疫细胞浸润评分与CXCL9 mRNA 表 达 的 相 关 性 并 绘 制 热 图。结 果（图 6A）显示，CXCL9 mRNA表达水平主要与记忆B 细胞、CD8+T 细胞、CD4+记忆 T 细胞、T 细胞、滤泡辅助 T 细胞、巨噬细胞 M1 等 TIIC 的浸润比例呈正相关（均 P0.05），与静息型自然杀伤细胞、巨噬细胞M0、巨噬细胞M2、活化髓系树突状细 胞、肥 大 细 胞 等 的 浸 润 比 例 呈 负 相 关（均P0.05）。随后，采用 IHC 对组织芯片进行分析，以验证CXCL9 的表达水平与 TIIC 浸润数目的相关性。结果（图 6B、C）显示高表达 CXCL9 的肿瘤组织中CD8+T 细胞浸润数目也较高，且该浸润数目的组间差异具有统计学意义（P=0.000）。采用 mIHC 对肿瘤间质中 CXCL9+细胞种类进行检测，结果（图6D）显示乳腺癌间质中部分 CD68+肿瘤相关巨噬细 胞（tumor-associated macrophage，TAM）和CD11c+树 突 状 细 胞（dendritic cell，DC）均 有CXCL9表达。2.5乳腺癌中 CXCL9 mRNA 表达水平和 CD8+T细胞浸润高低与患者预后的分析本 研 究 使 用 Spearman 相 关 系 数 分 析 CXCL9 mRNA表达和TIIC浸润比例、免疫检查点