rAAV5阴离子交换层析工艺的开发.pdf
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1、doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2023.04.107rAAV5 阴离子交换层析工艺的开发许 琳1,梁欢欢1,李红英2,韩 旭2,戴柳冰2,马 超2,朱 涛1,2(1.天津科技大学 生物工程学院,天津 300457;2.康希诺生物股份公司,天津 300000)摘 要 建立一种有效提高重组 5 型腺相关病毒(rAAV5)实心载体比率的阴离子交换层析的纯化方法。对亲和层析捕获的 rAAV5 样品,使用多种阴离子交换层析柱进行离子强度线性梯度洗脱,CIMmultus QA(CIMQ)层析柱能够有效分离不含目的基因组的病毒(病毒空颗粒)和含目的基因组的病毒(实心载体)。基于
2、CIMQ 层析柱,进行纯化缓冲液体系、紫外目标峰收集范围的优化。通过 qPCR 检测病毒基因组(Vg)含量计算回收率,高效液相色谱法(HPLC)或体积排阻色谱-多角度静态光散射技术(SEC-MALS)测定实心载体比率。使用 Tris,Na2HPO4,pH 8.0 缓冲体系,洗脱时收集紫外吸收值 UV260/UV280比值大于 1 的部分,收集的样品实心载体比率达到 80.3%。成功建立一种简单方便的阴离子交换层析方法,能去除 rAAV5 样品中的病毒空颗粒,使实心载体比率达到基因治疗临床产品要求。关键词 rAAV5;阴离子交换层析;实心载体比率;回收率;纯化中图分类号 TQ425文献标识码 B
3、文章编号 2095-1736(2023)04-0107-07Development of rAAV5 anion exchange chromatography processXU Lin1,LIANG Huanhuan1,LI Hongying2,HAN Xu2,DAI Liubing2,MA Chao2,ZHU Tao1,2 1.College of Bioengineering Tianjin University of Science and Technology Tianjin 300457 China 2.Cansino Biologics Inc.Tianjin 300000 C
4、hina Abstract A purification method was established for effectively increasing the proportion between vector capsids of rAAV5-a viral prod-uct containing the therapeutic DNA sequence and empty capsids viral vectors lacking the therapeutic gene.For the rAAV5 samples obtained from affinity chromatogra
5、phy several anion exchange chromatography and related gradient elution methods were tested in which CIMmultus QA CIMQ can effectively remove empty capsids from vector capsids.For the CIMQ purification the buffer matrix and the collection of rAAV5 fractions were optimized.Subsequently qPCR was used t
6、o quantify the recovery rate of the virus genome Vg content and high-performance liquid chromatography HPLC or size exclusion chromatography-multi-angle static light scattering SEC-MALS was used to determine the vector capsids proportion of rAAV5 samples.In the CIMQ purification process the proporti
7、on of vector capsids in the collected fraction at UV absorbance UV260/UV280 greater than 1 eluted with Tris-Na2HPO4 buffer at pH 8.0 reached 80.3%.A simple and convenient method using anion exchange chromatography was successfully established which can effec-tively eliminate empty capsids of rAAV5 f
8、rom vector capsids so that vector capsids proportion can meet the requirements of clinical ap-plication of gene therapy.Keywords rAAV5 anion exchange chromatography vector capsids proportion recovery purification腺相关病毒(Adeno-Associated Virus,AAV)最早于 20 世 纪 60 年 代 在 实 验 室 腺 病 毒 制 剂 中 发现1-2,随后不久在人体中发现3
9、。AAV 是一类无包膜、直径 20 26 nm 的二十面体结构,含有 4.7 kb的单链 DNA 基因组,属于细小病毒家族4-6。由于其安全性好、宿主范围广(分裂和非分裂细胞)、物理性质稳定,并且感染人体后不会导致任何生理或病理变化而成为基因治疗最具应用前景的载体之一7-8。目前,以 AAV 为载体成功用于临床基因治疗的药物有 3 种,即 Glybera(AAV1)、Luxturna(AAV2)701第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023收稿日期:2022-05-10;最后修回日期:2022-08
10、-17基金项目:天津市自然科学基金项目(No.18JCQNJC09700)作者简介:许琳,硕士研究生,研究方向为基因治疗,E-mail:通信作者:朱涛,博士,教授,研究方向为疫苗及其他生物制品的开发,E-mail:tao.zhu 和 Zolgensma(AAV9)。不同的 AAV 血清型具有不同的组织趋向性,已被证明在肺、肌肉、大脑、脊髓、视网膜和肝脏等多种组织中可以进行长期有效的表达9-10。基因治疗产品的质量对临床药物的安全性至关重要。使用三质粒转染人胚肾细胞(HEK293)时,病毒包装成实心载体的过程往往是低效的,导致在生产制备过程中形成缺乏载体基因组的空颗粒11-12,病毒空颗粒被认为
11、是最难以去除的杂质。Gao 等13研究表明去除 AAV 制剂中的病毒空颗粒会提高 AAV 在临床应用中的治疗效果和安全性。使用氯化铯梯度超速离心法纯化的 AAV 载体已被用于一些临床试验中,然而这些纯化方法并不容易工艺放大14。最近阴离子交换层析、阳离子交换层析和凝胶过滤层析被报道用于分离病毒空颗粒,然而这些方法主要是针对 AAV1-6、AAV8和 AAV915-17。本研究使用亲和捕获后的 rAAV5 样品,进行层析填料与层析柱的筛选,根据筛选结果作进一步纯化体系和方法的优化。最终可以得到符合产品质量要求的病毒载体,为 rAAV5 载体工业生产放大提供了一种方法。1 材料与方法1.1 材料1
12、.1.1 病毒载体采用三质粒共转染的方式进行上游发酵,收获的发酵液需粗纯(裂解,酶解与澄清)去除杂质,然后进行亲和层析,但是亲和层析捕获的 rAAV5 样品中仍然含有大量的病毒空颗粒(一般在 70%95%),需进一步进行精纯优化,使得样品符合质量要求(实心载体比率大于 70%)。1.1.2 填料与层析柱 SOURCE 30Q(Cytiva 公司);Q ImpRes(Cytiva 公司);NanoQ-30L(苏州纳微科技有限公司);MC30-Q(苏州赛分科技股份有限公司);CIMmultus QA 层析柱(BIA Separations 公司);CIMQ AAV full/empty 0.1 m
13、L analytical column(BIA Separations 公司)。1.1.3 主要仪器与试剂AKTA avant 150 层析系统(Cytiva 公司);新型 XP Cycler PCR 基因扩增仪(杭州博日科技股份有限公司);QuantStudio 3 荧光定量 PCR 仪(Thermo 公司);al-liance e2695 高效液相色谱仪(Waters 公司);Optilab 示差折光仪(Wyatt 公司);DAWN 18 角度静态光散射仪(Wyatt 公司);JEM-2010FEF 场发射透射电子显微镜(JEOL 公司);Elx808 酶标仪(BioTek 公司);三羟甲
14、基氨基甲烷(Tris,Angus Chemical Company);Bis-Tris propane(BTP,BBI);NaCl(天津市海光药业有限公司);Na2HPO4(天津市科密欧化学试剂有限公司);NaAC(四川金山制药有限公司);AAVpro Titration kit(for Real Time PCR)(TaKaRa 公 司);resDNASEQ Quantitative Human DNA Kit(Thermo 公司);PrepSEQTM Nucleic Acid Extraction Kit(Thermo 公司);PrepSEQTM Residual DNA Samplle
15、Perparation kit(Thermo 公司);HEK 宿主细胞蛋白检测试剂盒(Cygnus Technologies公司)。1.2 方法1.2.1 阴离子交换层析柱筛选缓冲液配制:A 液:20 mmol/L Tris,pH 9.0;B 液:20 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,pH 9.0。使用直径约 16 mm 柱管,对 SOURCE 30Q、Q ImpRes、NanoQ-30L、MC30-Q 等 4 种阴离子层析填料进行装柱,高度均为 0.8 cm,CIMQ 为 1 mL 阴离子交换层析柱。层析过程:(1)平衡:90%A 液,10%B 液,流速 4 mL/m
16、in 进行柱平衡;(2)上样:流速 4 mL/min;(3)再平衡:90%A液,10%B 液,流速 4 mL/min 进行柱平衡;(4)洗脱:10%100%B 液,200 个柱体积,进行离子强度线性梯度洗脱,流速 4 mL/min;(5)清洗:2 mol/L NaCl,流速4 mL/min,进行柱清洗。根据病毒基因组(Vg)含量和实心载体比率检测结果,初步筛选出表现良好的阴离子交换层析柱。1.2.2 CIMQ 层析柱工艺优化(1)纯化缓冲体系的筛选。使用 UNICORN 7.6 软件中的交互过程模型,采用全因子混合设计方案,根据不同缓冲体系,设计方案包含 2 个中心点(实验编号7、8),8 个
17、实验,筛选出重要的影响因素,实验方案见表 1。表1 中缓冲体系的配制:Na2HPO4缓冲体系 A 液:10 mmol/L BTP,5 mmol/L Na2HPO4,B 液:10 mmol/L BTP,65 mmol/L Na2HPO4;NaAC 缓 冲 体 系 A 液:10 mmol/L BTP,5 mmol/L NaAC,B 液:10 mmol/L BTP,185 mmol/L NaAC;NaCl 缓 冲 体 系 A 液:10 mmol/L BTP,5 mmol/L NaCl,B 液:10 mmol/L BTP,185 mmol/L NaCl。所有缓冲体系按照表 1 调节至所需 pH。层析过
18、程:使用平衡液 90%A 液,10%B 液进行柱平衡,样品上样流速 2 mL/min,平衡后使用3%100%B 液,200 个柱体积,进行离子强度线性梯度洗 脱,流 速 4 mL/min,使 用 2 mol/L NaCl,流 速4 mL/min 进行柱清洗。基于峰宽和峰距,根据公式分辨率 RS=2(V2-V1)/(W1+W2)计算病毒空颗粒和实心载体峰的分辨率。其中,V1、V2分别为病毒空颗粒和实心载体洗脱峰最高点对应的体积;W1、W2为相邻两峰的峰宽。以病毒空颗粒和实心载体峰的分辨率作为响应值,根据Mixed Logistic Regression(MLR)混合逻辑回归模型,分析预测合适的层
19、析缓冲体系。801第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023表 1 全因子混合设计方案及实验结果Table 1 Full factorial mixed design scheme and experimental results编号Number缓冲体系Buffering system分辨率Resolution1NaCl,pH 8.00.522Na2HPO4,pH 8.00.643NaAC,pH 8.00.684NaCl,pH 10.00.585Na2HPO4,pH 10.00.626NaAC,pH
20、10.00.567Na2HPO4,pH 9.00.648Na2HPO4,pH 9.00.65 (2)目标峰收集范围优化。为提高分离效果,洗脱时将离子强度线性梯度调整为 10%60%B 液。缓冲液配制:A1 液:10 mmol/L BTP;B1 液:10 mmol/L BTP,50 mmol/L Na2HPO4;B2 液:10 mmol/L BTP,150 mmol/L NaAC。以 上 缓 冲 液 pH 值 均 为 8.0。Na2HPO4缓冲体系层析过程:使用平衡液 90%A1 液,10%B1 液,流速 4 mL/min 进行柱平衡,样品上样流速2 mL/min,平衡后使用 10%60%B1
21、液,200 个柱体积,进行离子强度线性梯度洗脱,流速 4 mL/min,设置收集器 0.8 mL/管收集目标峰,使用 2 mol/L NaCl,流速 4 mL/min 进行柱清洗。针对 NaAC 缓冲体系使用相同过程进行层析。所收集目标峰根据峰面积 UV260/UV280和实心载体比率检测结果确定最终收集范围。(3)纯化缓冲液体系优化。缓冲液配制:A1 液:10 mmol/L BTP;B1 液:10 mmol/L BTP,50 mmol/L Na2HPO4;B2 液:10 mmol/L BTP,150 mmol/L NaAC;A2 液:20 mmol/L Tris;B3 液:20 mmol/L
22、 Tris,50 mmol/L Na2HPO4。以上缓冲液 pH 值均为 8.0。BTP、Na2HPO4缓冲体系层析过程:使用平衡液 90%A1 液,10%B1 液进行柱平衡,样品上样流速 2 mL/min,平衡后使用10%60%B1 液,200 个柱体积,进行离子强度线性梯度洗脱,流速 4 mL/min;BTP、NaAC 缓冲体系,Tris、Na2HPO4缓冲体系使用相同的过程进行层析。1.2.3 rAAV5 Vg 含量检测、实心载体比率检测、杂质残留检测以及电镜观察 纯化后的样品用 DNase I 消化去除宿主细胞核酸(HCD)残留和质粒转染相关的游离核酸,然后使用裂解液使病毒的衣壳蛋白变
23、性,完成简单的目的病毒基因组提取后,利用 qPCR 对病毒基因组进行定量。实心载体比率通过高效液相色谱系统,采用 CIMac AAV分析柱来定量 AAV 实心载体比率,或运用尺寸排阻色谱(SEC)与多角度散射(MALS)相结合,检测 rAAV 实心载体比率。HCD 残留和质粒 DNA(pDNA)残留检测,从纯化后的样品中提取残留 DNA,使用相应的引物,采用 qPCR 技术检测 HCD 和 pDNA。宿主细胞蛋白(HCP)是使用双抗体夹心法测定 HEK293 宿主细胞中蛋白残留水平。最后利用透射电镜观察纯化后rAAV 病毒的形态和颗粒完整性。2 结果与分析2.1 阴离子交换层析柱筛选rAAV5
24、 实心载体衣壳内含有完整的病毒载体基因组,而病毒空颗粒衣壳内缺乏病毒基因组,两者之间的电荷差异微弱,需选择分辨率相对较高的,填料粒径相对较小(约 30 m)的填料,或者选择 CIMQ 整体柱(通道孔径约 6 m),进行阴离子交换层析柱的筛选。实心载体因含有完整的病毒载体基因组,在纯化图谱中表现出相对较高的 UV260紫外吸收峰,而病毒空颗粒在纯化图谱中会显示相对较高的衣壳蛋白 UV280吸收峰。基于两者在纯化图谱中的紫外吸收峰差异,如图 1 所示,当 UV260UV280时,收集实心载体(洗脱 2)样品。层析图谱,CIMQ 层析柱具有较好分离病毒空颗粒与实心载体的效果图 1(e)。将收集的样品
25、进行 Vg 和实心载体比率检测(HPLC 法),检测结果见表 2。结果显示,使用 4 种阴离子填料进行离子强度线性梯度洗脱所收集的实心载体洗脱液中,实心载体比率相对较低,不能 有 效 分 离 病 毒 空 颗 粒 与 实 心 载 体,这 与图 1(a)(d)的结果是一致的。相比之下,CIMQ 层析柱分离 rAAV5 空颗粒和实心载体的效果相对较好,实心载体比率最高。2.2 CIMQ 层析柱工艺优化2.2.1 纯化缓冲体系筛选为进一步提高 CIMQ 层析柱的回收率和实心载体比率,需对纯化缓冲体系进行筛选,使用软件进行交互过程模型中的全因子混合方案设计,实验结束后,根据公式计算不同缓冲体系纯化图谱中
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