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6期第 45 卷6 期2023 年 6 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University能量代谢平衡与生殖功能的实现存在着复杂的相互调控作用，下丘脑对能量代谢及生殖的共调控作用已成为肥胖性不孕不育症的研究热点。以往研究1认为，下丘脑-垂体-性腺轴（hy原pothalamic-pituitary-gonadal axis，HPG）对生殖系统起着关键调控作用。最新研究2发现，下丘脑弓状核的原阿片黑皮质素（proopiomelanocortin，POMC）神经元是调控代谢与生殖交互作用的关键部位。POMC 神经元是感知能量储备的中枢元件，是协调能量平衡控制的关键节点。此外，POMC 神经元也表达多种受体，如瘦素受体、胰岛素受体、雌激素受体等，多种复杂的受体表达为其能够感知与能量平衡相关的不同外周和中枢信号提供物质基础1。POMC 敲除小鼠表现为肥胖且不孕不育，证明 POMC 在生殖调控中具有重要作用3。单独敲除 POMC 神经元上瘦素受体或胰岛素受体导致小鼠肥胖但不引起任何生殖功能障碍4，而同时敲除瘦素受体和胰岛素受体的小鼠肥胖且生育力显著下降，提示 POMC 神经元上有更为关键的共调控分子。胰岛素基因增强蛋白 1（insulin gene enhancerprotein 1，ISL1）可能是 POMC 神经元上能量与生殖共调控的关键分子。ISL1 属 LIM-同源域基因家族转录因子5，其编码蛋白质在朗格汉斯胰岛的胚胎发生中起重要作用6。在胚胎发育时期的下丘脑中，ISL1 在 POMC 神经元中高表达，并且和 POMC 共定位7。ISL1 可能是 POMC 神经元上能量代谢与生殖共调控的关键分子。本研究利用Cre-LoxP 系统构建了 POMC 神经元上 Isl1 条件性敲除小鼠，并进行了基因型鉴定与表型的初步分析，为深入研究 POMC 神经元中 ISL1 的生物学功能以及调控机制提供了重要的动物模型，并为临床上肥胖不育患者的诊疗提供新靶点和治疗新策略。1材料与方法1.1材料POMC 神经元特异性表达 Cre 重组酶转基因工具小鼠（POMCCre）（赛业生物科技公司）；Isl1flox/+实验小鼠委托赛业生物科技公司构建，所有实验小鼠在宁夏医科大学实验动物中心（SPF 级）进行饲养，饲养过程中给予 12 h 光照/12 h 黑暗，自由进食和饮水。动物实验严格按照动物伦理福收稿日期：2022-12-07基金项目：国家自然科学基金项目（82160290）；宁夏自然科学基金项目（2021AAC03133；2021AAC03134）；宁夏医科大学重点项目（XZ2022003；XZ2020003）作者简介：黄笠纹（1995），男，在读硕士研究生，研究方向：男性不育的分子机制。通信作者：裴秀英，教授，博士研究生导师，研究方向：生殖细胞发育及损伤修复。E-mail：POMC 神经元 Isl1 基因条件性敲除小鼠模型构建及表型分析黄笠纹1，李雪1，2，潘朋歌1，2，刘美辰2，张茜2，马萍2，尹海涛2，裴秀英1，2（1.宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室，银川750004；2.宁夏医科大学基础医学院，银川750004）摘要：目的构建 POMC 神经元上 Isl1 基因条件性敲除小鼠模型，并初步分析其表型。方法利用 Cre/loxP 系统构建条件性基因敲除小鼠模型，通过 Isl1flox/+自交获得 Isl1flox/flox小鼠，再将 Isl1flox/flox小鼠与 POMCCre基因型小鼠交配得到 POMCCre；Isl1flox/+雄鼠，POMCCre；Isl1flox/+雄鼠再与 Isl1flox/flox雌鼠交配，通过 PCR 进行基因型鉴定，得到POMC 神经元上 Isl1 条件性敲除小鼠（POMCCre；Isl1flox/flox，缩写为 Isl1驻POMC），免疫印迹法验证其敲除效率。通过功能学及组织病理学方法，观察主要组织器官是否存在自发病变。结果成功构建了 Isl1驻POMC小鼠，Isl1驻POMC小鼠下丘脑弓状核中 ISL1 敲除效率跃90%（P0.05），证明 POMC 神经元 Isl1 基因敲除小鼠模型构建成功。Isl1驻POMC小鼠呈现青春期后自发性进行性肥胖、代谢综合征及生育能力障碍等表型。结论应用 Cre/loxP 技术成功构建了 POMC 神经元 Isl1 基因条件性敲除小鼠，为研究 Isl1 在POMC 神经元中生物学功能和调控机制提供了重要的动物模型。关键词：POMC 神经元；胰岛素基因增强蛋白 1；肥胖；生育力中图分类号：R589.2文献标识码：ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.06.003文章编号：1674-6309（2023）06-553-07论著553窑窑宁夏医科大学学报4缘卷利要求进行，已获宁夏医科大学伦理委员会批准（IACUC-NYLAC-2021-180）。小鼠鉴定引物由上海生工生物公司合成；ISL1 抗体（美国 Abcam公司，Ab109517）；茁-Tubulin 抗体（北京博奥森生物技术有限公司，bs-4511R）；辣根酶标记山羊抗兔 IgG（H+L）（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZB-2301）；基因组 DNA 提取试剂盒（北京聚合美生物科技有限公司，MF280-01）；预染蛋白分子质量标准（美国赛默飞世尔科技公司，26616）；E原CL 发光液（江苏凯基生物技术股份有限公司，KGP1127）。1.2方法1.2.1小鼠模型的构建采用 CRISPR/Cas9 的系统制备基因敲除小鼠（雌雄各 1 只）。Isl1 基因（NCBI 参考序列：NM_021459；Ensembl：ENSMUSG00000042258）位于 13 号染色体上。其转录本（ENSMUST00000036060）具有 6 个外显子，ATG起始密码子位于外显子 1，TGA 终止密码子位于外显子 6，其中外显子 2 为条件性敲除区域。敲除该区域导致小鼠 Isl1 基因移码同时功能丧失，5-loxP 位点插入的内含子 1 的大小：931 bp，3-loxP 位点插入的内含子 2 的大小：2 796 bp。有效 cKO 区域的大小：1 614 bp。靶向载体使用BAC 克隆 RP23-12B3 作为模板通过 PCR 生成同源臂和 cKO 区域，并且 cKO 区域没有任何其他已知基因。Cas9、gRNA 和靶向载体将共同注射到受精卵中，用于 cKO 小鼠的生产。幼崽将通过PCR 进行基因分型，然后进行测序分析。外显子2 大约从 2.77%的编码区开始，见图 1。1.2.2Isl1flox/flox小鼠的获得和基因型鉴定Isl1flox/+杂合小鼠自交得到 Isl1flox/flox小鼠，提取小鼠鼠尾基因组 DNA，PCR 鉴定确定小鼠基因型。Isl1-F和Isl1-R 分别位于敲除片段前后，引物序列见表1。表 1小鼠基因型鉴定引物基因名称引物序列（5-3）Isl1-FACGTGCTTCACGGAAAATATAGACIsl1-RCTCATTTTGTGTTTTCTCCCTCCTPOMC Cre-FTGGCTCAATGTCCTTCCTGGPOMC Cre-RGAGATATCTTTAACCCTGATC1.2.3Isl1 基因 POMC 神经元条件性敲除小鼠的获得和基因型鉴定Isl1flox/flox纯合子小鼠与POMC 神经元特异性表达 Cre 酶的 POMCCre小鼠交配，得到 POMCCre；Isl1flox/+雄鼠，POMCCre；Isl1flox/+雄鼠再与 Isl1flox/flox雌鼠交配，筛选出 Isl1 基因POMC 神经元特异性敲除小鼠 POMCCre；Isl1flox/flox（简称 Isl1驻POMC），Isl1flox/flox作为对照（简称 WT），见图 2。提取小鼠鼠尾基因组 DNA，通过 PCR 鉴定小鼠基因型，引物序列见表 1。1.2.4Western blot 检测组织器官中 ISL1 的表达选取 10 周龄同窝雄性 WT 和 Isl1驻POMC小鼠，取下丘脑弓状核、垂体、睾丸、附睾等组织，用加入RAPI 裂解液，低温冷冻破碎机研磨组织，-30 益低温研磨 1 min，4 益高速离心 20 min 后取上清，加入 5伊Loading buffer，沸水浴变性 5 min，分装后于-20 益保存。蛋白质样品电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭 1 h，一抗 4 益孵育 12 h，洗膜，二抗孵育 1 h，洗膜，ECL 法显影。Western blot 检测 ISL1（39 kDa）的表达，选取 茁-Tubulin（55 kDa）作为内参。1.2.5苏木素-伊红（HE）染色选取 10 周龄同窝雄性 WT 和 Isl1驻POMC小鼠组织切片，脱蜡、HE染色、脱水透明、封片拍照。1.2.6雌雄小鼠生育力检测Isl1驻POMC小鼠出生图 1Isl1flox/+小鼠构建策略LegendsloxP siteHomologyExon of mouse Isl1UTRcKO regionWildtype alleleTargeting vectorTargeted alleleConstitutive KO allele（After Cre recormbination）3335223R2R2R2R1R1F1F1F1F2F2gRNA regiongRNA region554窑窑6期后 60 d，以 WT 小鼠为对照，每只雄鼠和两只正常生育过的雌鼠合笼，每天早晨观察雌鼠阴栓。若有，则取出雌鼠单独放置一笼，产仔后，记录雌鼠产仔数。1.3统计学方法数据采用 GraphPad Prism 8 软件进行统计分析，计量资料以均数依标准差（x依s）表示，组间比较采用方差分析。P臆0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1Isl1 基因 POMC 神经元条件性敲除小鼠的繁育及基因型鉴定结果首先 Isl1flox/+自交获得 Isl1flox/flox小鼠，再将Isl1flox/flox小鼠与 POMCCre基因型小鼠交配得到POMCCre；Isl1flox/+雄 鼠，POMCCre；Isl1flox/+雄 鼠 再 与Isl1flox/flox雌鼠交配，成功获得 POMC 神经元上 Isl1特异性敲除小鼠（POMCCre；Isl1flox/flox，Isl1驻POMC），见图 3。A.Isl1flox/flox鉴定；B.POMCCre鉴定；1：Marker；2：POMCCre；3、4：Isl1驻POMC（POMCCre；Isl1flox/flox）小鼠；5、7：WT（Isl1flox/+）小鼠；6：POMCCre；Isl1flox/+小鼠。图 3Isl1驻POMC小鼠基因型鉴定结果ABIsl1flox/floxPOMCCre2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp12345671234567Homozygous：one band with 205 bpHeterozygous：two bands with 205 bp and 137 bp宰栽：one band with 137 bpMT：one band with 661 bp宰栽：N.A2.2Isl1驻POMC敲除小鼠敲除效率分离小鼠下丘脑弓状核及睾丸，通过免疫印迹检测 ISL1 表达，Isl1驻POMC小鼠弓状核 ISL1 蛋白表达较 WT 小鼠下调（敲除效率达 90%以上）（P约0.01），小鼠睾丸中 ISL1 的表达在两组间差异无统计学意义（P跃0.05），证明 POMCCre；Isl1flox/flox小鼠构建成功，能够高效特异地敲除 POMC 神经元上的 ISL1，见图 4。2.3Isl1驻POMC小鼠呈现青春期后自发性进行性肥胖与 WT 小鼠相比，从 3 周龄开始，Isl1驻POMC小鼠体质量增加（P约0.01），并且随着鼠龄增加呈递增趋势，收取 10 周龄小鼠进行解剖，发现内脏脂肪过度堆积，且脂肪质量增加（P0.01）。收取内脏脂肪固定、包埋、切片以及 HE 染色，结果显示Isl1驻POMC小鼠较 WT 小鼠脂肪细胞的体积明显增大，见图 5。2.4Isl1驻POMC小鼠呈现自发性脂肪肝病变Isl1驻POMC与 WT 小鼠相比，肝脏质量增加（P约0.01），WT 小鼠肝脏组织细胞形态正常，边界清晰，细胞胞质未见溶解和空泡；Isl1驻POMC小鼠肝脏组织排列混乱，细胞间隙含有脂肪空泡，边界模糊，大量细胞核仁发生偏移和破裂，胞质有溶解现象，可见较大的脂质液滴，提示 POMC 神经元上 Isl1 缺失导致肝脏脂肪病变，见图 6。2.5Isl1驻POMC雄性小鼠和雌性小鼠均呈现生殖功能障碍Isl1驻POMC雌性、雄性小鼠均无后代产生（表 2）。4 种小鼠品系的杂合小鼠杂交可得到正常数量比例的子代，Isl1flox/+颐Isl1flox/flox颐POMCCre；Isl1flox/+颐POM原CCre；Isl1flox/flox=1颐1颐1颐1，并且符合孟德尔比率，见表3，提示 Isl1驻POMC雄性小鼠呈现不育。3讨论POMC 神经元作为下丘脑弓状核中调控代谢和生殖的关键神经元，通过产生 ACTH 和 琢-黄笠纹，等.POMC神经元Isl1基因条件性敲除小鼠模型构建及表型分析POMCCreIsl1fl/flIsl1fl/+Isl1fl/+Isl1fl/flIsl1fl/flPOMCCreIsl1fl/flPOMCCreIsl1fl/+POMCCreIsl1fl/+MaleMaleFemaleFemale图 2Isl1驻POMC小鼠交配繁育方案555窑窑宁夏医科大学学报4缘卷MSH 等黑皮质素肽调控食欲和能量代谢8。脑内注射 琢-MSH 和 ACTH 可抑制啮齿动物的食物摄入并增加能量消耗9，而在 POMC 基因敲除小鼠，选择性恢复外周黑皮质素和皮质酮分泌不仅没有减少食物的摄入，反而加剧了肥胖。POMC 敲除小鼠表现出成年进行性肥胖，暴饮暴食以及体质量增加且不孕不育，发生类似于去除大脑中POMC 神经元而产生的代谢性综合征员园。同时POMC神经元作为感知能量的中枢元件，整合了不同的外周和中枢信号，因此，其成为协调能量平衡的关键节点。而作为调控生殖的关键神经元，POMC 神经元不仅可以通过释放神经递质的方式直接或通过 Kisspeptin 神经元间接影响GnRH神经元来达到对HPG轴的调节11。而且，POMC神经元还可以利用神经元内 E2/ER琢 信号通过负反馈的方式来调节 HPG 轴，并且利用 ER琢 对A.小鼠弓状核 ISL1 蛋白的表达及相对表达量；B.小鼠睾丸 ISL1 蛋白的表达及相对表达量；*P0.01。图 4Isl1驻POMC小鼠各器官组织 ISL1 蛋白表达A.小鼠大体外观图；B.小鼠体质量增长曲线；C.小鼠内脏脂肪图；D.小鼠内脏脂肪质量统计图（n=7）；E.小鼠内脏脂肪HE 染色图（bar=100 滋m）；*P0.01。图 5Isl1驻POMC小鼠呈现肥胖和脂肪细胞形态改变AArcuate nuclcusWTIsl1驻POMCWTIsl1驻POMC栽estis月*Isl1驻POMCWTIsl1驻POMCWT陨杂蕴员陨杂蕴员39 kDa55 kDa39 kDa55 kDa0.250.200.150.100.050.000.660.640.620.600.58茁原栽ubulin茁原栽ubulinAB悦阅EWTIsl1驻POMCWTIsl1驻POMCWTIsl1驻POMCWT Isl1驻POMCWTIsl1驻POMCWTIsl1驻POMC*年龄/d151050缘园源园猿园圆园员园园100 滋m100 滋m*正面反面556窑窑6期表 3POMCCre；Isl1flox+小鼠与 WT 小鼠杂交生育力评估表 后代产仔只数（%）基因型POMCCre；Isl1flox+Isl1flox/flox（雄鼠雌鼠）Isl1flox/floxPOMCCre；Isl1flox+（雄鼠雌鼠）Isl1flox/+80（0.259）79（0.261）Isl1flox/flox75（0.243）74（0.245）POMCcre；Isl1flox/+79（0.256）78（0.258）POMCcre；Isl1flox/flox74（0.240）71（0.235）幼仔数（n=608）308（1）302（1）表 2Isl1驻POMC与 WT 小鼠交配生育力评估表（累积产仔数/只）基因型WT 雌鼠（n=18）Isl1驻POMC雌鼠（n=6）WT 雄鼠（n=6）1160Isl1驻POMC雄鼠（n=6）0A.小鼠肝脏大体图；B.小鼠肝脏质量比较（n=7，*P0.01）；C.小鼠肝脏组织 HE 染色图（bar=50 滋m）。图 6Isl1驻POMC小鼠呈现脂肪肝病变能量代谢有一定的调控12-13。其次，作为瘦素和胰岛素信号的直接目标，POMC 神经元单独敲除瘦素受体或胰岛素受体不引起任何生殖功能障碍4，而 POMC 神经元中同时敲除瘦素和胰岛素受体的雌性小鼠则表现出卵泡停滞，导致高雄激素血症和不孕症14。这也证明了 POMC 神经元是能量信号在生殖控制中的整合的关键神经元。POMC神经元调控能量和生殖功能尚不清楚，显然存在更为关键的调控分子。ISL1 广泛参与内分泌相关细胞的分化和维持，例如，ISL1 在胰岛中表达，并且影响着胰腺的成熟、增殖和存活15，并且 ISL1 在一些神经元中扮演着关键的角色16-17，ISL1 高表达于胚胎期及出生后下丘脑的 POMC 神经元，且与 POMC 呈表达共定位，提示 POMC 神经元上的 ISL1 可能扮演关键角色18-19。本课题组前期的生物信息学全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）分析显示，Isl1 基因中有 3 个与肥胖相关的 SNP，同时发现其中 1 个点突变 RS2288468也存在于不孕不育的 GWAS 数据库中。提示POMC 神经元上的 ISL1 可能是能量代谢与生殖共调控的关键分子，其作用机制值得深入探索。构建 POMC 神经元上 Isl1 条件性敲除小鼠模型（Isl1驻POMC）对深入研究 POMC 神经元上 ISL1 的功能及研究肥胖性不孕不育具有重要的意义。本 研 究 利 用 Cre-loxP 系 统 成 功 构 建 了POMC 神 经 元 上 Isl1 条 件 性 敲 除 小 鼠 模 型（Isl1驻POMC），通过表型分析发现 Isl1驻POMC小鼠呈现青春期后自发性进行性肥胖，内脏脂肪过度堆积、体质量增加，并呈现自发性脂肪肝；同时AB悦WTIsl1驻POMCWTIsl1驻POMCWTIsl1驻POMC*54321050 滋m50 滋m黄笠纹，等.POMC神经元Isl1基因条件性敲除小鼠模型构建及表型分析557窑窑宁夏医科大学学报4缘卷Isl1驻POMC雄性、雌鼠均表现为不孕，提示 POMC 神经元上的 ISL1 在能量代谢和生殖功能的共调控中扮演关键角色，其具体作用及机制值得深入研究。本研究构建的 Isl1驻POMC小鼠将为深入研究POMC 神经元中 ISL1 对能量代谢与生殖功能共调控机制提供重要的动物模型，并为肥胖性不孕不育症及生育力下降的研究提供重要的动物模型，为临床上肥胖不育患者的诊疗提供新靶点。参考文献：1 Manfredi-Lozano M，Roa J，Tena-Sempere M.Con原necting metabolism and gonadal function：Novel centralneuropeptide pathways involved in the metabolic con原trol of puberty and fertility J.Front Neuroendocrinol，2018，48：37-49.2 Candler T，K俟hnen P，Prentice AM，et al.Epigeneticregulation ofPOMC；implications for nutritional program原ming，obesity and metabolic disease J.Front Neuroen原docrinol，2019，54：100773.3 Hill JW，Elias CF，Fukuda M，et al.Direct insulinand leptin action on pro-opiomelanocortin neurons isrequired for normal glucose homeostasis and fertilityJ.Cell Metab，2010，11（4）：286-297.4 Varela L，Horvath TL.Leptin and insulin pathways inPOMC and AgRP neurons that modulate energy bal原ance and glucose homeostasis J.EMBO Rep，2012，13（12）：1079-1086.5 Amjad S，Baig M，Zahid N，et al.Association betweenleptin，obesity，hormonal interplay and male infertilityJ.Andrologia，2019，51（1）：13147.6 Park S，Mullen RD，Rhodes SJ.Cell-specific actionsof a human LHX3 gene enhancer during pituitary andspinal cord development J.Mol Endocrinol，2013，27（12）：2013-2027.7Orquera DP，Tavella MB，de Souza FSJ，et al.Thehomeodomain transcription factor NKX2.1 is essentialfor the early specification of melanocortin neuron i原dentity and activates pomc expression in the develop原ing hypothalamus J.Pomc，2019，39（21）：4023-4035.8 van der Valk ES，Kleinendorst L，Delhanty PJD，et al.Obesity andhyperphagiawithincreaseddefectiveACTH：A novel POMC variant J.J Clin EndocrinolMetab，2022，107（9）：3699-3704.9 Poggioli R，Vergoni AV，Bertolini A.ACTH-（1-24）and alpha-MSH antagonize feeding behavior stimulat原ed by kappa opiate agonists J.Peptides，1986，7（5）：843-848.10 Xu AW，Kaelin CB，Morton GJ，et al.Effects of hy原pothalamic neurodegeneration on energy balance J.PLoS Biol，2005，3（12）：415.11 R覬nnekleivOK，QiuJ，KellyMJ.Arcuatekisspeptinneu原rons coordinate reproductive activities with metabolismJ.Semin Reprod Med，2019，37（3）：131-140.12 Xu Y，Nedungadi TP，Zhu L，et al.Distinct hypotha原lamic neurons mediate estrogenic effects on energyhomeostasis and reproduction J.Cell Metab，2011，14（4）：453-465.13 Xu Y，Nedungadi TP，Zhu L，et al.Distinct hypotha原lamic neurons mediate estrogenic effects on energyhomeostasis and reproduction J.Cell Metab，2019，29（5）：1232.14Xu Y，Faulkner LD，Hill JW.Cross-talk betweenmetabolism and reproduction：The role of POMC andSF1 neurons J.Front Endocrinol（Lausanne），2012，2：98.15 Du A，Hunter CS，Murray J，et al.Islet-1 is requiredfor the maturation，proliferation，and survival of theendocrine pancreas J.Diabetes，2009，58（9）：2059-2069.16 Ehrman LA，Mu X，Waclaw RR，et al.The LIM home原obox gene Isl1 is required for the correct develop原ment of the striatonigral pathway in the mouse J.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（42）：4026-4035.17 Cho HH，Cargnin F，Kim Y，et al.Isl1 directly con原trols a cholinergic neuronal identity in the develop原ing forebrain and spinal cord by forming cell type-specific complexes J.PLoS Genet，2014，10（4）：1004280.18 Mazzoni EO，Mahony S，Closser M，et al.Synergisticbinding of transcription factors to cell-specific en原hancers programs motor neuron identity J.Nat Neu原rosci，2013，16（9）：1219-1227.19Nasif S，de Souza FSJ，Gonz佗lez LE，et al.Islet 1specifies the identity of hypothalamic melanocortinneurons and is critical for normal food intake andadiposity in adulthood J.Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（15）：1861-1870.（责任编辑：刘瑛）558窑窑6期inhibitor or normal saline in the hippocampus.In the 6th week，the changes of mice behavior were detected byMorris Water Maze and Elevated Plus Maze.Fast blue staining was used to study the change of myelin sheath inthe corpus callosum.The expressions of P75NTR and myelin basic protein（MBP）in hippocampus were detectedby Western blot.Immunohistochemistry was used to detect the change of MBP positive expression in hippocam-pus.ResultsCompared with the Control group，CPZ mice showed increased in the escape latency，and de-creased the number of platform crossing，entering the open arm，and the time spent in the open arm（Pall0.05）.The fast-blue staining results showed that the mouse treated with CPZ presented demyelination inthe corpus callosum，the coloring is obviously lighter.The expression of MBP in the hippocampus of CPZgroup was decreased，while the expression of P75NTR was increased（P0.05）.Compared with salineintervention，the mice treated with P75NTR cleavage inhibitor showed decreased escape latency，and in-creased the number of entering the open arm，and the time spent in the open arm（P all0.05）.The expres-sion of MBP in the hippocampus of mice were increased after DAPT intervention（P0.05）.ConclusionIn-hibition of P75NTR cleavage can improve cognitive dysfunction in cuprizone model mice，and the mechanism isrelated to the alleviation of demyelination in the hippocampus.Key words：demyelination；neurotrophin receptor P75；-secretase inhibitor；hippocampal；cuprizoneConstruction and Phenotypic Analysis of Conditional Knockout Mice forthe POMC Neuron Isl1 GeneHUANG Liwen1，LI Xue1，2，PAN Pengge1，2，LIU Meichen2，ZHANG Qian2，MA Ping2，YIN Haitao2，PEI Xiuying1，2（1.Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance of Ministry of Education，Ningxia MedicalUniversity，Yinchuan750004，China；2.School of Basic Medical Sciences，Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China）Abstract：ObjectiveTo establish conditional knockout mice for Isl1 on POMC neurons and preliminary anal-ysis of their phenotype.MethodsA conditional knockout mouse model was constructed using the Cre/LoxPsystem，and Isl1flox/floxmice were obtained by Isl1flox/+self-crossing，then Isl1flox/floxmice were mated with POMCCregenotype mice to obtain POMCCre；Isl1flox/+male mice，POMCCre；Isl1flox/+male mice were then mated with Isl1flox/floxfemales and genotyped by PCR to obtain Isl1 conditional knockout mice on POMC neurons（POMCCre；Isl1flox/flox，abbreviated Isl1驻POMC），and the knockout efficiency was verified by immunoblotting.The presence of sponta-neous lesions in major tissues and organs were investigated by functional and histopathological methods.ResultsThe results showed that the knockout efficiency of ISL1 in the hypothalamic arcuate nucleus of Isl1驻POMCmicewas greater than 90%（P0.05），which proved the POMC neuronal Isl1 knockout mouse model was established successfully.The phenotypeof Isl1驻POMCmice showed spontaneous progressive obesity，metabolic syndrome and impaired fertility after puber-ty.ConclusionWe successfully constructed Isl1 conditional knockout mice in POMC neurons by usingCre/LoxP technology，providing an important animal model for studying the biological function and regulatorymechanism of Isl1 in POMC neurons.Key words：POMC neurons；insulin gene endancer protein 1；obesity；fertility（上接第 552 页）黄笠纹，等.POMC神经元Isl1基因条件性敲除小鼠模型构建及表型分析559窑窑