SLC1A5协同TM4SF1通过mTOR信号通路调控食管鳞癌细胞迁移.pdf
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1、2023,27(14):33-39,45.实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in Practice33SLC1A5协同TM4SF1通过mTOR信号通路调控食管鳞癌细胞迁移胡效林1,郝鑫,李文倩1,赵恬恬1,侯思聪(1.扬州大学附属医院消化内科,江苏扬州,2 2 50 0 1;2.扬州大学医学院临床医学系,江苏扬州,2 2 50 0 1;3.江苏省宝应县人民医院消化内科,江苏宝应,2 2 58 0 0)摘要:目的探讨氨基酸转运载体溶质载体家族1成员5(SLC1A5)在食管鳞癌(ESCC)中的表达及其与临床病理特征的相关性,以及SLC1A5对ESCC细胞迁移
2、的影响及潜在分子机制。方法采用TNM plot在线数据库分析 SLC1A5基因在ESCC组织和正常组织中的表达情况。通过实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测ESCC组织和癌旁组织中SLCIA5mRNA表达情况;采用免疫组化(IHC)法检测SLC1A5蛋白表达情况,并分析其与患者临床病理资料的相关性。分别构建SLC1A5过表达(SLC1A5-0E组)、四跨膜蛋白超家族成员1过表达(TM4SF1-OE组)、SLC1A5和TM4SF1共同过表达的Eca109细胞。采用细胞增殖试验、Transwell实验检测Eca109细胞的增殖、迁移和侵袭能力。通过免疫共沉淀(IP)实验证实SLC1A
3、5和TM4SF1的相互作用;采用蛋白质免疫印迹(WB)法检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白的表达水平。结果TNMplot数据库分析显示,ESCC组织中SLC1A5基因表达水平高于正常组织,差异有统计学意义(P0.05)。ESC C 组织中SLC1A5mRNA表达高于成对的癌旁组织,差异有统计学意义(P0.05)。T r a n s w e l l 实验结果显示,与Con组比较,SLC1A5-OE组细胞迁移及侵袭能力增强,差异有统计学意义(P0.01)。I P结果表明,SLC1A5与TM4SF1存在相互作用。WB结果显示,相对于SLC1A5-OE组或TM4SF1-OE组,p-
4、mTOR、p-S6 蛋白表达水平在SLC1A5和TM4SF1共同过表达的细胞中最高。Transwell实验证实,共同过表达SLC1A5和TM4SF1的ESCC细胞迁移能力最强。结论ESCC中SLC1A5呈高表达,且与患者临床分期、淋巴结转移显著相关,SLC1A5可能通过与TM4SF1相互作用,激活mTOR信号通路,进而促进ESCC细胞迁移。关键词:氨基酸转运载体溶质载体家族1成员5;四跨膜蛋白超家族成员1;食管鳞癌;转移;哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路中图分类号:R735.1;R446 文献标志码:A文章编号:16 7 2-2 353(2 0 2 3)14-0 33-0 7 D0I:10.7
5、6 19/j c m p.2 0 2 30 7 7 2SLC1A5 combined with TM4SF1 regulatesthe migration of esophageal squamous cellthrough mTOR signaling pathwayHU Xiaolin 2,HAO Xin,LI Wenqian 2,ZHAO Tiantian 2,HOU Sicong(1.Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital of Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu,225001;
6、2.Department of Clinical Medicine,Medical College of Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu,225001;3.Department of Gastroenterology,Baoying County Peoples Hospital of JiangsuProvince,Baoying,Jiangsu,225800)Abstract:Objective To explore the expression of amino acid transporters solute carrier family-1m
7、ember-5(SLC1A5)in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)and its correlation with clinico-pathological features,and investigate the potential molecular mechanisms of SLC1A5 in ESCC metasta-sis.Methods The expression of SLCIA5 gene in ESCC and normal tissues was analyzed by TNM plotonline database.T
8、he SLCIA5 mRNA expression in ESCC and paracancer tissues was examined byquantitative real time polymerase chain reaction(qRT-PCR);the protein expression of SLC1A5 wasdetected by immunohistochemistry(IHC)and the correlations between SLC1A5 and clinic pathologicalcharacteristics in patients were analy
9、zed;SLC1A5 overexpression(SLC1A5-OE group),transmembrance-4收稿日期:2 0 2 3-0 3-13基金项目:国家自然科学基金青年科学基金资助项目(318 0 0 6 7 5);江苏省自然科学基金面上项目(BK20221373)通信作者:侯思聪,E-mail:s h o u y z u.e d u.c n修回日期:2 0 2 3-0 6 -1634L-six family member-1 overexpression(TM4SF1-OE group),SLC1A5 and TM4SF1 co-overexpressionEcal09 c
10、ells were constructed respectively.Cell proliferation test and Transwell test were used todetect the proliferation,migration and invasion ability of Ecal09 cells.The interaction betweenSLC1A5 and TM4SF1 was confirmed by immunoprecipitation(IP)assays;the expression level ofmammalian target of rapamyc
11、in(mTOR)signaling pathway-related protein was detected by Westernblot(WB).Results TNM plot database analysis showed that the expression level of SLCIA5 genein the ESCC tissues was significantly higher than that in the normal tissues(P0.05).The expres-sion of SLCIA5 mRNA in ESCC tissues was significa
12、ntly higher than that in paired para-canceroustissues(P0.05).The results of Transwell experiment showed that compared with the Con group,the cell mi-gration and invasion ability of the SLC1A5-OE group were significantly enhanced(P 5cm),标本收集后,放于-8 0 冰箱保存用于后续研究。本研究通过扬州大学医学院伦理委员会审批。1.2细胞系和细胞培养本研究所使用的 E
13、SCC 细胞系(Eca-109)来自中国科学院细胞库。使用含有10%胎牛血清(FBS)(杭州天杭生物科技股份有限公司,中国)的RMPI-1640培养基培养。HEK293T用无血清培养基DMEM培养。培养条件均为37、5%CO,恒温培养。1.3在线数据库分析使用TNMplot在线数据库(https:/ 1个ESCC 组织和418 个正常组织中SLC1A5基因表达水平。1.4构建过表达质粒TM4SF1的相应过表达质粒来自实验室前期的构建7 。SLC1A5 的全长cDNA是以 Eca-109细胞总cDNA为模板扩增得到,然后亚克隆到pDONR201载体中。随后通过Gateway技术将SLC1A5的c
14、DNA从pDONR201载体中置换到pLenti-CMV-Puro DEST(w l 18-1)(A d d g e n e,#17452)或 pLenti-CMV-Hygro DEST(w 117-1)(A d d g e n e,#17 454)载体中,从而得到相关慢病毒表达载体。1.5构建病毒包装感染以及稳转细胞系基于慢病毒的TM4SF1或SLC1A5过表达载体与pCAG-HIVgp和pCMV-VSV-G-RSV-Rev共同转染至HEK293T细胞。转染48 h后,收集慢病毒上清液。用所得病毒上清液感染相应细胞7 2 h后,通过潮霉素B或嘌呤霉素对细胞进行筛选,最终获得相应抗性的稳转细胞
15、系。1.6IHC取石蜡包埋的标本切片,将组织切片脱蜡和水化,进行高压抗原修复,SLC1A5一抗(CST,美国,货号#8 0 57,稀释比例1:150)在4冰箱孵育过夜,二抗工作液37 孵育30 min,3,3-二氮基联苯胺盐酸盐(DAB)显色和苏木素复染,最后脱水、透明、封片。SLC1A5染色结果判读方法如下:阳性细胞数的百分比分5个等级,即0 分(0%)、1 分(0%2 5%)、2 分(2 5%50%)、3分(50%7 5%)、4分(7 5%10 0%);染色强度分4个等级,即0 分(无色)、1分(淡黄色)、2分(棕黄色)、3分(棕色或棕褐色);最终染色分实用临床医药杂志Journal of
16、 Clinical Medicine in Practice数=染色强度分数阳性细胞百分比分数。0 3分为低表达,412 分为高表达。1.7实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)采用TRIzol试剂(Invitrogen,美国)从组织中提取总RNA,按照制造商说明,使用iScriptcDNA合成试剂盒(Bio-Rad,美国)对分离的RNA进行逆转录,采用 iTaq Universal SYBR Green Kit(Bi o-Ra d,美国)进行qRT-PCR。以GAPDH为内参基因进行分析。相关引物序列见表1。表1qRT-PCR相关的引物序列基因序列SLC1A5正向5-TCGTCGA
17、GATCGAGGATGTG-3反向5-GGAACTGGAAGAGGTCCCAA-3GAPDH正向5-GGAGTCAACGGATTTGGT-3反向5-GTGATGGGATTTCCATTGAT-31.8蛋白质免疫印迹(WB)从收获的细胞中提取总蛋白,用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce,美国)测定蛋白浓度,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(伯乐系统,美国)分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)(Si g ma,美国)膜上。在室温下封闭1h,一抗在4下孵育过夜,二抗在室温下孵育1h。用ECL发光液(Pierce,美国)检测目标蛋白。所用一抗包括:TM4SF1(R&D,美国,货号AF7514,稀释比例0.5
18、g/mL);SLC1A 5,p-mTOR,m T O R,p-S6 和S6(C ST,美国;货号分别为#8 0 57,#2 97 1,#2 97 2,#2 2 11和#2 2 17;稀释比例均为1:3 0 0 0)以及-actin(Santa Cruz Biotech-nology,美国,货号#sc-47778,稀释比例1:10 0 0)。1.9免疫共沉淀(IP)收集1mg(约10 0 0 L)细胞裂解液中,吸取1/10上清液(约10 0 L),作为Input,放人-20冰箱备用,将剩余上清液加人10 0 L预处理的 protein A/G 琼脂糖珠(Santa Cruz Biotech-no
19、logy,美国)中,在4轮转仪上轮转30 min,离心后留取上清液,分别加人相应的抗SLC1A5抗体(CST,美国,货号#8 0 57,稀释比例1:7 5)及IgG抗体(Bio-Rad,美国,货号#PRABPO1,稀释比例1:50),4轮转过夜后,新的10 0 L预处理protein A/G琼脂糖珠孵育结合,4轮转孵育2h,离心并进行样品处理,最后进行WB检测。1.10细胞增殖实验将对应的细胞(310 4个)接种到6 0 mm 培养皿,培养箱中培养过夜后,更换无血清培养基培3536养2 4h,更换为完全培养基,并通过显微镜拍照记录后,计数该视野内的细胞数目。之后每2 4 h拍照记录相同视野的细
20、胞并计数,共3次。统计不同时间点、相同视野内细胞数目以记录细胞增殖情况,绘制增殖曲线。1.11Tranwell 侵袭和迁移实验使用2 4孔Transwell小室(Corning,美国)评价食管癌细胞的侵袭能力。预冷的无血清培养基配制Matrigel,按每个小室10 0 L铺胶,37 培养箱孵育1h。消化细胞,在无菌上室中加人200L的细胞悬液(310 4个),在下室中加人500L含有10%FBS培养基,37 培养箱中孵育12 h,用镊子小心取出小室,用甲醇室温固定30min,结晶紫室温染色15 30 min,室温晾干后显微镜下拍照并选取3个随机视野计数,统计结果。迁移实验无需铺胶,在无菌上室中
21、加人200L的细胞悬液(2 10 4个),在下室中加人500L含有10%FBS培养基,于37 培养箱中孵育8 h后,其余步骤参考侵袭实验。1.12统计学分析采用GraphPadPrism5和SPSS16.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以(xs)表示,2 组间比较采用t检验;符合偏态分布的8000600040002000A:T NM p l o t 在线数据库分析比较食管癌组织及正常组织中SLCIA5基因表达差异;B:ESC C 组织和正常组织中SLC1A5mRNA表达差异。与正常组织比较,*P 3分,n=60)和低表达组(3分,n=24),并分析其表达情况与临床病理资料的相关性,结
22、果显示,SLC1A5的表达与患者的临床分期(P=0.036)、淋巴结转移(P=0.029)呈正相关,与年龄、性别、吸烟史、T分型、分化程度、肿瘤直径无相关性(P0.05),见表2。实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in Practice计量资料采用中位数(四分位间距)表示,2 组间比较采用Mann-WhitneyU检验;计数资料结果以n(%)表示,组间比较采用卡方检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1SLC1A5 在ESCC 组织中的表达情况通过TNM plot在线数据库(https:/ 对),采用qRT-PCR对组织中SLC1A5表达水平
23、进行分析,结果显示,ESCC组织中SLC1A5mRNA水平高于正常组织,差异有统计学意义(P0.01),见图1B。此外,利用IHC分析了8 4例ESCC组织石蜡切片标本中SLC1A5蛋白的表达情况,结果显示,SLC1A5蛋白在癌旁组织(图2 E、2 F、2 G、2 H)中的表达水平低于癌组织,差异有统计学意义(P0.05)(图2A、2 B、2 C、2 D)。以上结果提示,SLC1A5在ESCC组织中高表达。P 0.0 5),见图3B;T r a n s w e ll实验结果显示,与临床病理特征分类标本癌旁组织ESCC组织年龄60岁60 岁性别女男吸烟史无有临床分期I I期期T分型T1+T2T3
24、+T4淋巴结转移否是分化程度高分化中/低分化肿瘤直径4 cm4.cm2.4SLC1A5与TM4SF1存在相互作用本课题组在前期工作中的质谱分析发现SLC1A5是TM4SF1的潜在相互作用蛋白7 ,故本研究首先在SLC1A5过表达的Eca-109细胞中,通过IP验证了其与TM4SF1 的相互作用,见图4。2.5SLC1A5-TM4SF1复合物促进下游哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路活化及ESCC细胞迁移为进一步研究SLC1A5-TM4SF1复合物介导ESCC 细胞迁移的分子机制,本研究在Con 组或SLC1A5-OE组的Eca-109细胞中上调TM4SF1表Con组相比,SLC1A5-
25、OE组细胞迁移和侵袭能力提高,差异有统计学意义(P0.01),见图3C。表2 SLC1A5 表达和临床病理资料的相关性分析n(%)SLC1A5表达n高表达8439(46.4)8460(71.4)2417(70.8)6043(71.7)139(69.2)7151(71.8)3123(74.2)5337(69.8)4830(62.5)3630(83.3)3725(67.6)4735(74.5)5132(62.7)3328(84.8)1811(61.1)6649(74.2)2920(69.0)5540(72.7)达,即TM4SF1过表达细胞(TM4SF1-OE组)、SLC1A5和TM4SF1共表达细
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