UPRmt改善乙醇诱导的肝细胞坏死性凋亡的分子机制研究.pdf

UPRmt改善乙醇诱导的肝细胞坏死性凋亡的分子机制研究黄嘉1,2，李芮冰2，王成彬1,21解放军医学院，北京100853；2解放军总医院第一医学中心检验科，北京100853摘要：背景坏死性凋亡作为一种新型程序性细胞死亡方式参与酒精性肝病的发生发展。线粒体未折叠的蛋白质反应(mitochondrialunfoldedproteinresponse,UPRmt)能够促进应激反应中细胞修复并改善线粒体网络的调控，探究乙醇诱导下肝细胞内 UPRmt调控机制可能为酒精性肝病的临床治疗提供新的潜在靶点。目的探讨 UPRmt对乙醇诱导下肝细胞线粒体功能和坏死性凋亡的影响，及其在肝细胞线粒体网络中的作用机制。方法利用正常小鼠肝细胞 AML12 构建正常对照组、乙醇组、UPRmt激活对照组、UPRmt激活乙醇组模型。经浓度 250mmol/L 无水乙醇培养细胞构建乙醇组模型，通过造模前6h 给予 10mol/L 寡霉素 A 激活正常小鼠肝细胞 UPRmt构建干预组。利用 RT-PCR 检测 UPRmt、线粒体分裂和坏死性凋亡相关基因转录水平，荧光探针观察线粒体功能，蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白表达水平。结果乙醇诱导下 UPRmt相关基因 mtDNAj、CHOP、ATF5 和炎症因子 TNF-、IL-6、Timp1 转录水平升高，坏死性凋亡关键基因 RIPK3、PGAM5 表达增加(P0.05)。荧光探针观察到乙醇诱导下线粒体膜电位显著下降，线粒体 ROS 产生量增多(P0.05)，蛋白免疫印迹结果显示乙醇诱导下肝细胞内线粒体自噬被抑制，线粒体分裂增加。寡霉素 A 干预增强细胞内 UPRmt，从而改善乙醇诱导下炎症产生和氧化应激，维持线粒体正常功能，抑制肝细胞坏死性凋亡。结论UPRmt通过减少细胞氧化应激、维持线粒体正常功能，从而缓解乙醇诱导的肝细胞坏死性凋亡和炎症损伤。关键词：酒精性肝病；线粒体未折叠蛋白反应；坏死性凋亡；线粒体质量控制；线粒体自噬中图分类号：R363.1文献标志码：A文章编号：2095-5227(2023)06-0700-08DOI：10.3969/j.issn.2095-5227.2023.06.020引用本文：黄嘉，李芮冰，王成彬.UPRmt改善乙醇诱导的肝细胞坏死性凋亡的分子机制研究J.解放军医学院学报，2023，44（6）：700-707.Molecular mechanism of UPRmt in ameliorating alcohol-induced hepatocyte necroptosisHUANGJia1,2,LIRuibing2,WANGChengbin1,21ChinesePLAMedicalSchool,Beijing100853,China;2DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstMedicalCenter,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,ChinaCorrespondingauthors:LIRuibing.Email:liruibingplagh.org;WANGChengbin.Email:Abstract:BackgroundLong-termalcoholconsumptioncancauseseriousliverdamage.Asanewprogrammedcelldeathmode,necroptosis is involved in the pathogenesis of alcoholic liver disease(ALD).Mitochondrial unfolded protein response(UPRmt)canpromotecellrecoveryandimprovemitochondrialnetworksurvival.ExploringtheroleofUPRmtinALDmayprovideanewpotentialtargetforclinicalpractice.ObjectiveToinvestigatetheeffectofUPRmtonmitochondrialfunctionandethanol-inducedhepatocytenecroptosisandsupplementmechanismsofUPRmtinhepatocytemitochondrialnetwork.MethodsFourgroupswereconstructed,includingnormalcontrolgroup(NC),alcoholicliverdiseasegroup(ALD),UPRmtactivationcontrolgroup(NC+Omy),andUPRmtactivationalcoholicliverdiseasegroup(ALD+Omy).ALDgroupwasculturedinthecompletedculturemediumwith250mmol/Lethanol,and10mol/LoligomycinAwasadded6hoursbeforemodelingtoactivatehepatocytesUPRmt.RT-PCRwasusedtodetectkeygenestranscriptionallevelsofUPRmt,mitochondrialfissionandnecroptosis.Fluorescenceprobewasusedtoobservemitochondrialfunction.Westernblottingwasperformedtodetecttheexpressionlevelsofmitophagyproteins,suchasmicrotubule-associatedprotein1lightchain3(LC3),P62andFundc1.ResultsRT-PCRresultsshowedthatthetranscriptionlevelofUPRmtrelatedgenesmtDNAj,CHOP,ATF5andinflammatoryfactorTNF-,IL-6andTimp1increasedinducedbyalcohol,andthe expression of key genes of necrotic apoptosis RIPK3 and PGAM5 also increased(P0.05).The mitochondrial membranepotentialsignificantlydecreasedwhiletheproductionofmtROSincreasedinALDmodel(P0.05).WesternblottingresultsshowedreducedmitophagyandabnormalmitochondrialfissioninALDmodel.OligomycinAinterventionreversedthesedamages,threforereducinginflammationandoxidativestress,maintainingthenormalmitochondrialfunction,andinhibitinghepatocytesnecroptosis.ConclusionUPRmtalleviatesalcohol-inducedhepatocytenecroptosisbyrescuingoxidativestressandmitochondrialdysfunction.Keywords：alcoholicliverdisease;mitochondrialunfoldedproteinresponse;necroptosis;mitochondrialqualitycontrol;mitophagy收稿日期：2022-11-10基金项目：解放军总医院优青培育课题(2020-YQPY-005)；解放军总医院青年自主创新科学基金项目(22QNZ058)作者简介：黄嘉，女，硕士，检验技师。研究方向：线粒体质量控制在酒精性肝病中的作用机制。Email:通信作者：李芮冰，女，博士，主治医师。Email:liruibingplagh.org；王成彬，男，博士，主任医师。Email:700解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/Cited as：HuangJ,LiRB,WangCHB.MolecularmechanismofUPRmtinamelioratingalcohol-inducedhepatocytenecroptosisJ.AcadJChinPLAMedSch,2023,44（6）:700-707.酒精性肝病(alcoholicliverdisease，ALD)是长期大量饮酒引发的一组代谢性疾病，目前已经成为全球慢性肝病的主要病因之一。肝是乙醇代谢的主要器官，长期大量饮酒会造成严重肝组织损伤1。ALD 包括广泛的临床表现谱，如单纯性脂肪变性、急性酒精性肝炎(伴或不伴肝硬化)、肝硬化和肝细胞癌。乙醇诱导肝细胞死亡与肝细胞存活的失衡最终决定酒精性肝病的发病机制2，坏死性凋亡作为一种与细胞凋亡和传统坏死不同的程序性细胞死亡方式，与酒精性肝病的潜在致病分子机制有关，并在氧化应激、脂肪变性和炎症中起着至关重要的作用3-5。线粒体是细胞能量供应站，除此之外其在信息传递、代谢协调、细胞间合作等方面发挥重要作用。线粒体在应激或病原体刺激下导致错误折叠或未折叠的蛋白质积累和功能障碍。线粒体未折叠的蛋白质反应(mitochondrialunfoldedproteinresponse，UPRmt)是修复错误蛋白的逆行适应性转录反应，通过将线粒体蛋白和代谢损伤信号传递到细胞核，上调伴侣蛋白(以加速或改善折叠)和蛋白水解酶(以降解错误折叠的蛋白质)表达，以维持线粒体蛋白正常结构和功能，而线粒体另一个修复机制线粒体自噬则可以消除功能失调的线粒体，两者共同维持线粒体稳态和正常功能6。文献报道，UPRmt损伤可能促进肝硬化由代偿期向失代偿期进展，在非酒精性脂肪性肝病模型中热休克蛋白 60 可调节肝炎症和损伤，从而加速疾病的发展7-8。但 UPRmt在 ALD 的病理生理机制中发挥的作用研究较少。因此，本研究拟通过构建ALD 细胞模型，初步探索激活 UPRmt对 ALD 细胞模型线粒体和坏死性凋亡的影响，进而探究以UPRmt为中心的 ALD 干预机制，为临床治疗提供新的潜在靶点。材料与方法1材料与试剂小鼠正常肝细胞(AML12 细胞株)和 DMEM/F12 完全培养基购于上海中乔新舟生物科技有限公司。DMEM/F12 完全培养基为Dulbecco 改良 Eagle 培养基(DMEM)和 HamsF-12培养基 11 混合后添加 10%胎牛血清、1%青/链霉素、200ng 地塞米松和胰岛素-转铁蛋白-硒元素。UPRmt激活剂寡霉素 A(oligomycinA，Omy)购于美国 MCE 公司。无水乙醇购于国药集团化学试剂有限公司。逆转录试剂盒、SYBRGreen 预混液和 CFX96PCR 仪购于美国 Bio-Rad 公司。Trizol和 MitoSOX 荧光染料购于美国 ThermoFisher 公司。RIPA 蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂和 ECL 超敏化学发光液购于北京索莱宝科技有限公司。-Tubulin 一抗来源于北京华兴博创基因技术有限公司，Fundc1 和 LC3A/B 一抗来源于 CellSignalingTechnology 公司，山羊抗小鼠/抗兔 IgG 第二抗体来源于杭州华安生物技术有限公司。BCA 蛋白定量试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)和Hochest 活细胞染色液购于碧云天生物有限公司。2乙醇诱导肝损伤细胞模型建立利用 AML12细胞株分别建立对照组(Normalcontrol，NC)、酒精性肝病模型组(ALD)、UPRmt激活对照组(NC+Omy)、UPRmt激活酒精性肝病模型组(ALD+Omy)。NC 组和 NC+Omy 组使用 DMEM/F12 完全培养基培养 AML12细胞 48h，ALD 组和 ALD+Omy 组使用含 250mmol/L 无水乙醇的 DMEM/F12完全培养基培养 AML12 细胞 48h，NC+Omy 组和 ALD+Omy 组在模型构建前 6h 向培养基中加入 10mol/L 寡霉素 A，以激活肝细胞 UPRmt。3荧光实时定量 PCR 测定 UPRmt、肝细胞炎症反应标志物、坏死性凋亡和线粒体分裂关键基因mRNA 表达AML12 细胞经 PBS 清洗后，以每6 孔板加入 1mLTrizol 的比例裂解细胞，加入氯仿 4 下 12000r/min 离心 15min 抽提 RNA，上层液相经异丙醇沉淀后每管经 1mL75%乙醇(DEPC 水配制)清洗后弃上清。沉淀的 RNA 室温干燥后用 DEPC 水溶解，Nanodrop 测定 RNA 浓度。按照逆转录试剂盒说明书合成 cDNA，取2L 进行 RT-PCR。RT-PCR 用 SYBRGreen 染料法配制总体系 10L，以-actin 为内参基因，变性 9520s，退火 6020s，延伸 7250s，共循环 40 次。本实验中所需引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列见表 1。检测mtDNAj、CHOP、ATF5mRNA 表达水平以证明UPRmt激活情况，以及肝细胞炎症反应标志物TNF-、IL-6、Timp1，坏 死 性 凋 亡 关 键 基 因RIPK1、RIPK3、MLKL、PGAM5，线粒体分裂指标 Mid49 和 Mid51。4蛋白免疫印迹测定线粒体自噬蛋白 Fundc1、解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/701LC3/、P62 表达量RIPA 蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂按比例配好，加入细胞培养皿提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。目的蛋白和内参蛋白通过 10%或 15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后 200mA 恒流转印至 PVDF 膜，5%脱脂牛奶室温封闭 1h，目的蛋白一抗均用 5%脱脂牛奶稀释至 11000，内参蛋白一抗用 5%脱脂牛奶稀释至 15000，4 孵育过夜，1TBST 缓冲液洗膜 5 次，将膜与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠/抗兔 IgG 第二抗体(140000)在室温下孵育1h；1TBST 缓冲液洗膜 5 次，每次 10min，用ECL 化学发光液进行显影；使用 ImageJ 图像分析软件进行半定量分析。5线粒体活性氧(mitochondrialreactiveoxygenspecies，mtROS)和线粒体膜电位检测mtROS 用2molMitoSOX 染色工作液和 Hochest 活细胞染料加入细胞密度为 60%70%的共聚焦小皿中，37 避光染色 25min，每组各 3 个小皿，吸除工作液，加入新鲜培养液后在激光共聚焦显微镜下观察。每皿选取两张高倍视野(200)图片，使用ImageJ 图像分析软件对红色通道光密度进行半定量，每组取图片荧光通道光密度平均值进行统计学比较。线粒体膜电位用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)和 Hochest 活细胞染料染色观察。染色液加入细胞密度为 60%70%的 12 孔板中，每组各 3 个孔，37 避光孵育洗涤后在荧光显微镜下拍摄荧光图片。线粒体维持正常功能时膜电位较高，JC-1 聚集在线粒体的基质中形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体受损膜电位下降时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中形成单体，产生绿色荧光。红绿荧光的相对比例用于衡量线粒体去极化的比例。每孔选取两张高倍视野(200)图片，使用 ImageJ 图像分析软件，分别对绿色和红色通道光密度进行半定量，每组图片红色与绿色荧光光密度比值进行统计学比较。6统计学方法采用 SPSS24.0 统计软件进行统计分析，使用 GraphPadPrism9.4.0 软件进行图表绘制。符合正态分布的计量资料两两比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P0.05 为差异有统计学意义。结果1寡霉素 A 对肝细胞 UPRmt激活情况RT-PCR检测结果(图 1)显示，经 48h 乙醇诱导后的 ALD模型组 CHOP 基因 mRNA 表达高于 NC 组(P0.05)，乙醇模型构建前 6h 给予 10mol/L 寡霉素A 干预后，相比 NC 组和 ALD 组，NC+Omy 组和 ALD+Omy 组 mtDNAj、CHOP、ATF5mRNA表达均增加(P0.05)，证明寡霉素 A 成功激活AML12 细胞 UPRmt。2UPRmt对乙醇诱导下肝细胞炎症损伤影响RT-PCR 检测结果(图 2)显示，ALD 组炎症反应标志物 TNF-、IL-6、Timp1 均显著高于 NC 组(P0.05)。相比 ALD 模型组，ALD+Omy 组激活 UPRmt后所致 TNF-、IL-6、Timp1 转录水平下降(P0.05)，证明 UPRmt有效抑制乙醇诱导的肝细胞炎症反应。3UPRmt对乙醇诱导下肝细胞坏死性凋亡的影响RT-PCR 检测结果如图 3 所示，ALD 组 RIPK3和 PGAM5 基因转录水平相比 NC 组显著上升，在寡霉素 A 干预后，NC+Omy 组和 ALD+Omy 组RIPK3 和 PGAM5 转录水平相比 NC 组和 ALD 组表 1 小鼠物种引物序列Tab.1 Primers sequence of mouse species基因名称上游引物下游引物-actin5-CATTGCTGACAGGATGCAGAAGG-35-TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG-3CHOP5-GCGACAGAGCCAGAATAACA-35-GCGACAGAGCCAGAATAACA-3mtDNAj5-AGTCACCCACACAAGCACTG-35-CCAGCCTCTCGCCTATCC-3ATF55-TCCGCTCACACCGTCTCT-35-AAGGCGAAGGTGGAGGAC-3TNF-5-ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC-35-GCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3IL-65-CTCCCAACAGACCTGTCTATAC-35-CCATTGCACAACTCTTTTCTCA-3Timp15-GCAAAGAGCTTTCTCAAAGACC-35-CTCCAGTTTGCAAGGGATAGAT-3；PGAM55-GGAGGACAGCTATGAGATCTTC-35-CAGGACCGAGTAATCTTGTCTG-3RIPK15-TACTTGCAAAGAAGAGTCGACT-35-ATAGGGTTCAGGTGTTCATCAG-3RIPK35-GACTAAATTCATGGAGAACGGC-35-TAAAACATCCCAAGCACCACTT-3MLKL5-AGCAAGAAGTCCCATATTTGGA-35-GCTGACATCTGAAACGGTATTC-3Mid495-GTGACGGCTGACCATATCCAACTC-35-CTCACGACGAACCAGGAAGAAACC-3Mid515-TATCCAGTAGAGACCGCCCGTTTG-35-ACACAGCAGCAGCAACAACCTC-3702解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/下调，差异有统计学意义(P0.05)。与 NC 组和ALD 组相比，NC+Omy 组和ALD+Omy 组RIPK1的转录水平降低(P0.05)。与 NC 组相比，ALD组 MLKL 转录水平下降，ALD+Omy 组 MLKLmRNA 表达水平回升(P0.05)。4UPRmt对线粒体功能的影响与 ALD 处理的细胞模型相比，寡霉素 A 的干预增加了红色荧光与绿色荧光量化比值(P0.05)，缓解了乙醇造成的线粒体膜电位下降(图 4)。在亚细胞水平上，MitoSox 红色荧光探针特异性地标记线粒体产生图 1 寡霉素 A 对肝细胞 UPRmt激活情况A：RT-PCR 法检测 NC 组、NC+Omy 组、ALD 组、ALD+Omy 组细胞模型 mtDNAj mRNA 表达水平；B：四组细胞模型 CHOPmRNA 表达水平；C：四组细胞模型 ATF5 mRNA 表达水平Fig.1 Activation of UPRmt by Oligomycin AA:The level of mtDNAj transcription in four groups of NC,NC+Omy,ALD and ALD+Omy detected by RT-PCR;B:The level ofCHOP transcription in four groups;C:The level of ATF5 transcription in four groups图 2 UPRmt对乙醇诱导肝细胞炎症损伤的影响A：四组细胞模型 TNF-mRNA 表达水平；B：四组细胞模型 IL-6 mRNA 表达水平；C：四组细胞模型 Timp1 mRNA 表达水平Fig.2 Effects of UPRmt on ethanol-induced hepatocyte inflammationA:The level of TNF-transcription in four groups;B:The level of IL-6 transcription in four groups;C:The level of Timp1 transcrip-tion in four groups图 3 UPRmt对乙醇诱导肝细胞坏死性凋亡的影响A：RT-PCR 法检测四组细胞模型 RIPK1 mRNA 表达水平；B：四组细胞模型 RIPK3 mRNA 表达水平；C：四组细胞模型 MLKLmRNA 表达水平；D：四组细胞模型 PGAM5 mRNA 表达水平Fig.3 Effects of UPRmt on ethanol-induced hepatocyte necroptosisA:The level of RIPK1 transcription in four groups detected by RT-PCR;B:The level of RIPK3 transcription in four groups;C:Thelevel of MLKL transcription in four groups;D:The level of PGAM5 transcription in four groups解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/703的 ROS，相比 ALD 组，mtROS 产生量在寡霉素A 干预下显著减少，荧光半定量结果显示差异有统计学意义(图 5)(P0.05)，反映 UPRmt激活有效减少乙醇导致的氧化应激。5UPRmt对线粒体质量平衡的维持作用与 NC组相比，ALD 组线粒体分裂指标 Mid49 和 Mid51转录水平升高，经寡霉素 A 干预后 Mid49 和 Mid51转录水平显著下降(图 6A，图 6B)(P0.05)，表明激活 UPRmt能够抑制乙醇诱导下肝细胞线粒体的过度分裂。蛋白免疫印迹实验结果如图 6C 所示，位于线粒体外膜的自噬蛋白 Fundc1 在乙醇诱导下表达显著降低，自噬蛋白 LC3/下降，线粒体自噬底物 P62 比例增加，表明乙醇诱导下肝细胞内自噬被抑制，寡霉素A 干预后Fundc1、LC3/蛋白表达增多，P62 蛋白表达相对乙醇诱导后下降，灰度值量化(图 6D图 6F)(P0.05)，证明UPRmt能重新激活乙醇诱导下肝细胞内抑制的线粒体自噬。讨论在肝内乙醇代谢的主要途径是其在细胞质中被氧化为乙醛，乙醛再由线粒体中的醛脱氢酶进行代谢9；次要代谢途径是通过微粒体酶氧化系统产生过量的活性氧，进而导致脂质过氧化，消耗线粒体谷胱甘肽和 S-腺苷甲硫氨酸。受损的肝细胞释放内源性损伤相关分子模式，招募免疫细胞，促使细胞因子产生，导致无菌炎症10。本研究结果显示，乙醇诱导下的肝细胞特征是炎症标志物上调、线粒体膜电位降低、线粒体 ROS 超负荷和肝细胞坏死性凋亡激活。为了监测和维持细胞内线粒体网络的完整性，真核细胞在蛋白质、细胞器和细胞多层次上启动一系列的复杂机制来修复受损线粒体，包括线粒体裂变/融合、线粒体自噬、UPRmt和线粒体生物发生，这些生物学事件被称为线粒体质量控制(mitochondrialqualitycontrol，MQC)11。首先，99%的线粒体蛋白由核基因组编码并不断导入线粒体，因此线粒体和细胞核之间存在密切通信11。氧化应激和其他威胁细胞稳态的有害过程导致线粒体中错误折叠或未折叠蛋白质的积累，一旦超出线粒体伴侣和蛋白酶调节能力，细胞则以受损蛋白质输入作为线粒体损伤的传感器，启动线粒体伴侣和蛋白酶的靶向转录，动态控制线粒体蛋白的导入或导出，并微调线粒体行为，这一过程图 4 UPRmt对乙醇诱导下肝细胞线粒体膜电位影响A：NC 组、NC+Omy 组、ALD 组、ALD+Omy 组线粒体膜电位荧光图片；B：线粒体膜电位红色荧光与绿色荧光通道光密度量化比值Fig.4 Effects of UPRmt on mitochondrial membrane potential induced by ethanolA:Mitochondrial membrane potential fluorescence images of four groups;B:Ratio of red fluorescence to green fluorescence channeloptical density of mitochondrial membrane potential704解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/称为线粒体未折叠蛋白反应(UPRmt)12。UPRmt是一种适应性转录反应，在哺乳动物细胞中可能由磷酸化真核起始因子-2 亚基(eIF2)介导的综合应激反应机制控制的转录因子CHOP、ATF4、ATF5调节11。其次，在细胞器水平上，轻度受损的线粒体可以通过与其他健康的线粒体融合或通过分裂消除有害成分来补偿其受损的功能，无法通过分裂或融合恢复的受损线粒体随后通过线粒体自噬被清除，这种调控方式与 UPRmt的精细调节不同，线粒体自噬会减少线粒体数量，这种改变在某些情况下可能会引起 ATP 缺失和细胞死亡13。目前 UPRmt已被证实与代谢紊乱和胰岛素抵抗疾病密切相关，如非酒精性脂肪肝和肝纤维化14。在四氯化碳诱发的肝损伤中，触发 UPRmt后抗氧化基因上调以清除自由基，呼吸链酶和线粒体自噬相关基因的转录激活恢复线粒体功能，维持细胞稳态，增强利于肝细胞存活的抗应激性15。本研究初步探索 UPRmt在乙醇诱导肝损伤中的作用，激活乙醇诱导肝细胞内 UPRmt转录表达能够显著降低细胞炎症反应标志物和坏死性凋亡基因转录水平，证明 UPRmt可以降低乙醇诱导下肝细胞的炎症反应和坏死性凋亡。为进一步探究 UPRmt逆转 ALD 损伤机制，在亚细胞水平上对线粒体进行功能测定。与 NC 组相比，ALD 模型中线粒体去极化比例显著增加，而寡霉素 A 的干预通过激活 UPRmt逆转这种改变，维持线粒体膜电位稳定。在氧化应激的条件下，受损的电子传递链蛋白产生过量的 ROS。本研究中 MitoSox 荧光探针的强度显示乙醇诱导下增加的 mtROS 在寡霉素A 干预下显著减少。UPRmt利用蛋白酶去除这些潜在有害的蛋白质，并通过诱导 ATP 依赖性蛋白酶，如副蛋白酶和 YMEL-1，以及超氧化物歧化酶，以限制功能失调的 OXPHOS 积累16。另外，UPRmt激活可以暂时将细胞代谢从线粒体 OXPHOS转变为糖酵解，从而暂时降低细胞在应激期间对线粒体的依赖11。这些结果表明，UPRmt激活可能保护肝细胞线粒体免受炎症和氧化应激损伤从而缓解乙醇诱导肝细胞的坏死性凋亡。与 NC 组相比，本研究中 ALD 模型组线粒体分裂指标 Mid49 和 Mid51 转录水平上升，但由Fundc1 介导的线粒体自噬蛋白被抑制，预示着细胞中可能存在线粒体过度分裂，非正常状态的线粒体无法为肝细胞提供足够 ATP17。乙醇诱发细胞毒性的早期阶段，线粒体片段化可能对细胞有益，与线粒体自噬协调清除功能失调的线粒体，线粒体分裂和自噬共同维持线粒体动态平衡，保图 5 UPRmt对乙醇诱导下异常的 mtROS 产生量影响A：NC 组、NC+Omy 组、ALD 组、ALD+Omy 组细胞模型 mtROS 荧光图片；B：mtROS 红色荧光通道光密度半定量Fig.5 Effects of UPRmt on mtROS production in ALD modelA:mtROS fluorescence images of four groups;B:Quantitative analysis of optical density of mtROS red fluorescent channel解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/705持功能稳定，但当损伤变成慢性时，此适应机制则失效，导致线粒体动力学失衡18。而被抑制的线粒体自噬则无法对受损线粒体进行及时清除，导致细胞衰老、炎症以及 ROS 和脂质氧化的蓄积19。Williams 等20的研究进一步证实急性乙醇诱导引发线粒体自噬增加，而长期摄入乙醇则抑制溶酶体生物发生和自噬18,21-22。本研究采用 48h 的乙醇诱导模型模拟慢性长期乙醇损伤，该模型能够有效抑制线粒体自噬。本研究中线粒体过度分裂和抑制的线粒体自噬在寡霉素 A 干预后明显改善，证明 UPRmt可能对线粒体的分裂和线粒体自噬有直接或间接调控作用。但 UPRmt与线粒体的分裂和线粒体自噬之间关系并不单一，在脓毒症导致的心肌损伤中，UPRmt与线粒体自噬协同作用维持心肌细胞正常功能，在线粒体自噬受到抑制的情况下，UPRmt在维持线粒体稳态方面起到代偿作用13。氧化应激、脂质代谢紊乱、肝炎症和细胞死亡是酒精性肝损伤的关键病理机制23。酒精性肝病、非酒精性肝病小鼠模型研究表明坏死性凋亡在氧化应激、脂肪变性和炎症中起着至关重要的作用4-5。RIPK1、RIPK3 和 MLKL 被认为是执行坏死凋亡的关键介质24。PGAM5 作为 RIPK3/MLKL 的下游分子调节坏死凋亡25。RIPK3 介导的坏死性凋亡促进乙醇引起的肝损伤和炎症26。PGAM5 同时介导氧化应激和 TNF-诱导的坏死性凋亡，在 TNF-诱导的坏死凋亡中，PGAM5-L 与RIPK1/RIPK3/MLKL 复合物结合，磷酸化激活线粒体上的 PGAM5-S，将 Drp1 招募到线粒体中，在 Ser-637 处对 Drp1 进行去磷酸化诱导线粒体裂变并介导坏死性凋亡27。本研究中乙醇诱导下肝细胞坏死性凋亡的关键基因 RIPK3 和 PGAM5 的RNA 表达水平显著上升，而寡霉素 A 能有效干预两者的表达量，同时降低 RIPK1 和 TNF-的转录水平，证明乙醇诱导下存在 TNF-诱导的坏死性凋亡途径，且 UPRmt能够逆转该细胞程序性死亡方式，而 MLKL 的转录水平呈现的趋势可能与其蛋白翻译后修饰发挥作用有关。综上所述，虽然本研究中乙醇诱导下 UPRmt被轻度激活，但并不能代偿乙醇对肝细胞的损伤作用，乙醇诱导下细胞炎症和氧化应激增加、线粒体功能受损、坏死性凋亡的关键蛋白转录水平升高。寡霉素 A 激活 UPRmt在乙醇刺激肝细胞模型中整体呈现保护作用，其能够维持线粒体稳图 6 UPRmt维持乙醇诱导下肝细胞内线粒体质量控制A：RT-PCR 法检测四组细胞模型 Mid49 mRNA 表达水平；B：四组细胞模型 Mid51 mRNA 表达水平；C：Western blot 法检测四组细胞模型线粒体自噬蛋白表达量灰度条带；D：四组细胞模型 Fundc1 蛋白表达量化分析；E：四组细胞模型 LC3/蛋白表达量化分析；F：四组细胞模型 P62 蛋白表达量化分析Fig.6 UPRmt maintained mitochondrial quality control in ALD modelA:The detection of Mid49 transcription level in four groups by RT-PCR;B:The level of Mid51 transcription in four groups;C:Thedetection of mitophagy proteins expression in four groups by Western blot assay;D:The concentration analysis of Fundc1 proteinexpression in the four groups;E:The concentration analysis of LC3/protein expression in the four groups;F:The concentrationanalysis of P62 protein expression in the four groups706解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/态，改善乙醇诱导下肝细胞炎症和坏死性凋亡。另外，本研究也证明线粒体自噬和分裂可能作为UPRmt下游，直接影响肝细胞存亡。但其相互作用关系还十分复杂，需要构建功能敲除或过表达模型进一步验证探究。作者贡献作者贡献黄嘉：整体实验开展，数据分析；李芮冰：实验设计，策划调整实验方向；王成彬：提出实验目标和方向，审阅稿件真实性。利益冲突利益冲突所有作者声明无利益冲突。数据共享声明数据共享声明本篇论文相关数据可依据合理理由从作者处获取，Email：。参考文献Namachivayam A，Valsala Gopalakrishnan A.A review onmolecular mechanism of alcoholic liver diseaseJ.Life Sci，2021，274：119328.1WangSG，PacherP，deLisleRC，etal.Amechanisticreviewof cell death in alcohol-induced liver injuryJ.Alcohol ClinExpRes，2016，40（6）：1215-1223.2Zhou Y，Jin HH，Wu Y，et al.Gallic acid protects againstethanol-induced hepatocyte necroptosis via an NRF2-dependentmechanismJ.ToxicolInVitro，2019，57：226-232.3Pasparakis M，Vandenabeele P.Necroptosis and its role ininflammationJ.Nature，2015，517（7534）：311-320.4HsuSK，ChangWT，LinIL，etal.TheroleofnecroptosisinROS-mediatedcancertherapiesanditspromisingapplicationsJ.Cancers（Basel），2020，12（8）：2185.5Urbina-Varela R，Castillo N，Videla LA，et al.Impact o