CCL18在胶质母细胞瘤中的表达及其对U87MG细胞增殖和迁移的影响.pdf
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1、天津医药 2023 年 9 月第 51 卷第 9 期CCL18在胶质母细胞瘤中的表达及其对U87MG细胞增殖和迁移的影响黄冠又1,葛学成1,甘鸿川1,郝淑煜2,吴震2摘要:目的探讨趋化因子配体18(CCL18)在胶质母细胞瘤(GBM)中的表达与GBM临床预后的关系以及对U87MG细胞增殖和迁移的影响。方法基于癌症基因组图谱(TCGA)和基因型-组织表达(GTEx)数据库中GBM和正常脑组织数据,分析CCL18在GBM与正常脑组织中的表达差异,采用免疫组织化学染色进行验证。应用Kaplan-Meier生存分析、单因素和多因素Cox回归分析评估CCL18对GBM患者预后的影响。基于多因素Cox回归
2、模型构建生存列线图,绘制校准曲线和受试者工作特征(ROC)曲线进行验证。将人胶质母细胞瘤U87MG细胞分为siRNA-CCL18组、siRNA-NC组和Mock-siRNA组,采用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测细胞中CCL18 mRNA表达,CCK-8法和细胞划痕愈合实验检测U87MG细胞的增殖和迁移能力。结果TCGA和GTEx数据库分析结果显示,GBM组织中CCL18基因表达水平高于正常脑组织;免疫组织化学染色结果显示,GBM组CCL18阳性表达率高于对照组(P0.05)。CCL18高表达组患者预后较低表达组差(P0.01)。Cox回归分析结果显示,IDH野生型和CCL18高表达是GB
3、M患者死亡的独立危险因素(P0.05)。校准曲线显示列线图预测模型与实际生存有较好一致性,ROC曲线表明该模型对GBM患者生存概率有较好预测能力。siRNA-CCL18组CCL18 mRNA表达水平、细胞增殖(48 h、72 h和96 h)和迁移能力(24 h)均低于siRNA-NC组和Mock-siRNA组(P0.05)。结论CCL18在GBM中表达上调,可促进GBM肿瘤细胞增殖和迁移,且可导致患者预后不良。关键词:胶质母细胞瘤;趋化因子CCL18;细胞增殖;细胞运动;预后中图分类号:R739.41文献标志码:ADOI:10.11958/20221791Expression of CCL18
4、 in glioblastoma and its effect on proliferation and migration ofhuman U87MG cellsHUANG Guanyou1,GE Xuecheng1,GAN Hongchuan1,HAO Shuyu2,WU Zhen21 Department of Neurosurgery,the Second Peoples Hospital of Guiyang,Guiyang 550081,China;2 Department ofNeurosurgery,Beijing Tiantan Hospital,Capital Medica
5、l UniversityCorresponding AuthorE-mail:Abstract:ObjectiveTo analyze the expression chemokine(C-C motif)ligand 18(CCL18)on the clinical prognosis of基金项目:国家自然科学基金资助项目(81672506,81872052);贵州省卫健委科学技术基金(gzwkj2022-348)作者单位:1贵阳市第二人民医院神经外科(邮编550081);2首都医科大学附属北京天坛医院神经外科作者简介:黄冠又(1982),男,副主任医师,主要从事颅脑肿瘤基础和临床方面研究
6、。E-mail:通信作者E-mail:细胞与分子生物学Front Oncol,2022,12:1054436.doi:10.3389/fonc.2022.1054436.14 XIA L,HUANG W,BELLANI M,et al.CHD4 has oncogenicfunctions in initiating and maintaining epigenetic suppression ofmultiple tumor suppressor genesJ.Cancer Cell,2017,31(5):653-668.e7.doi:10.1016/j.ccell.2017.04.005.
7、15 DALESIO C,PUNZI S,CICALESE A,et al.RNAi screens identifyCHD4 as an essential gene in breast cancer growth J.Oncotarget,2016,7(49):80901-80915.doi:10.18632/oncotarget.12646.16 WUJ,ZHOUZ,LIJ,etal.CHD4promotesacquiredchemoresistance and tumor progression by activating the MEK/ERKaxisJ.Drug Resist Up
8、dat,2023,66:100913.doi:10.1016/j.drup.2022.100913.17 ROUSSEAU P,AUTEXIER C.Telomere biology:Rationale fordiagnostics and therapeutics in cancerJ.RNA Biol,2015,12(10):1078-1082.doi:10.1080/15476286.2015.1081329.18 LU R,PICKETT H A.Telomeric replication stress:the beginningand the end for alternative
9、lengthening of telomeres cancersJ.Open Biol,2022,12(3):220011.doi:10.1098/rsob.220011.19 YUAN X,DAI M,XU D.Telomere-related markers for cancer J.Curr Top Med Chem,2020,20(6):410-432.doi:10.2174/1568026620666200106145340.20 ALDER J K,BARKAUSKAS C E,LIMJUNYAWONG N,et al.Telomere dysfunction causes alv
10、eolar stem cell failureJ.ProcNatl Acad Sci U S A,2015,112(16):5099-5104.doi:10.1073/pnas.1504780112.21 KELICH J,ARAMBURU T,VAN DER VIS J J,et al.Telomeredysfunction implicates POT1 in patients with idiopathic pulmonaryfibrosis J.J Exp Med,2022,219(5):e20211681.doi:10.1084/jem.20211681.(2022-12-21收稿2
11、023-04-20修回)(本文编辑李国琪)915Tianjin Med J,September 2023,Vol.51 No.9glioblastoma(GBM)and its effects on the proliferation and migration of U87MG cells.MethodsThe differential expressionof CCL18 gene in GBM and normal brain tissue was analyzed based on the GBM data from Cancer Genome Atlas(TGGA)database
12、and the normal brain tissue data from Genotype-Tissue Expression(GTEx)database.Immunohistochemicalstaining was used to verification.Kaplan-Meier survival analysis,univariate and multivariable Cox regression analysis wereused to evaluate the impact of CCL18 expression on the prognosis in GBM patients
13、.A nomogram was established based onthe results of multivariate Cox analysis.The calibration curve and receiver-operating characteristic(ROC)curve were drawfor validation.Human glioblastoma U87MG cells were divided into the siRNA-CCL18 group,the siRNA-NC group and theMock-siRNA group.qPCR was used t
14、o detect the content of CCL18 mRNA in the different U87MG cell groups.The CCK-8assay and cell scratch test were used to detect the cell proliferation and migration ability of U87MG cells in each group.ResultsCCL18 was significantly upregulated in GBM tissue(P0.05).The immunohistochemistry results su
15、ggested thatCCL18 protein was significantly increased in GBM tissue(P0.05).Survival analysis indicated that high expression ofCCL18 was associated with poor prognosis in GBM patients(P0.05).Multivariate Cox regression analysis revealed thatIDH wild-type and high level of CCL18 expression were the tw
16、o major risk factors affecting the poor prognosis of GBM(P0.05).The calibration curve showed that the actual survival rate of patients was consistent with the predicted survival rate.The ROC curve demonstrated that the model had a good predictive for predicting the survival of GBM patients.siRNAredu
17、ced the expression of CCL18 in human U87MG cells.The results of CCK-8 assay showed that the proliferation ofU87MG cells was significantly inhibited(P0.05),and the wound healing scratch ability of U87MG cells with lowexpression of CCL18 decreased(P0.01).ConclusionCCL18 is over-expressed in GBM tissue
18、,and high CCL18expression is associated with poor prognosis in GBM patientsCCL18 promotes GBM cell proliferation and migration andmay act as a relevant predictive biomarker for GBM.Key words:glioblastoma;chemokine CCL18;cell proliferation;cell movement;prognosis多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)
19、是成人最常见的中枢神经系统原发恶性脑肿瘤,其恶性程度和复发率较高,患者生存期短1。传统的手术切除结合术后同步放化疗及替莫唑胺辅助化疗方案对改善GBM患者预后效果不佳,其中位生存期仅15个月2。有研究表明,GBM进展迅速,且异质性显著3,趋化因子与肿瘤的侵袭和转移密切相关4。GBM的肿瘤微环境中有大量的小胶质细胞/巨噬细胞浸润,能进一步增强GBM的侵袭性以及促进抑制性免疫微环境的形成5。C-C趋化因子配体18(chemokine CC-motif ligand 18,CCL18)是趋化因子配体家族成员之一,主要由肿瘤相关巨噬细胞分泌,可促进肿瘤细胞上皮间质转化(epithelial tomese
20、nchymal transition,EMT)和自我更新能力,在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用6。研究表明,CCL18在乳腺癌6、肺癌7、口腔鳞癌8等多种恶性肿瘤中表达上调,但关于CCL18在GBM中表达及其对GBM细胞增殖和侵袭的影响尚鲜见报道。本研究通过生物信息学方法和免疫组织化学染色检测分析CCL18在GBM中的表达及其对U87MG细胞增殖和迁移能力的影响。1资料与方法1.1数 据 库 资 料 和 分 组利 用 UCSC XENA(https:/ CancerGenome Atlas,TCGA,https:/portal.gdc.cancer.gov)数据库和基因型-组织表达数据库(The
21、 Genotype-Tissue Expression,GTEx)中提取有关GBM的基因表达谱(RNA-Seq)数据。经Toil流程9标准化处理后分别得到168例GBM患者的RNA-Seq数据和临床资料以及1 157例正常脑组织的RNA-Seq数据。GBM患者纳入标准:(1)病理学诊断为GBM;(2)具有CCL18基因数据的样本。排除临床资料不全者。患者临床信息资料,包括性别、年龄、异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)状态、Karnofsky功能状态评分(Karnofsky performance scale,KPS)10等。总生存期(overalsurv
22、ival,OS)指从患者病理确诊之日起至患者死亡或末次随访的生存时间;无进展生存期(progression free survival,PFS)是指患者接受治疗开始到出现肿瘤复发或死亡的时间。1.2临床标本资料选择2020年1月2021年8月于贵阳市第二人民医院神经外科行手术治疗的GBM患者(GBM组)45例,其中男25例,女20例,年龄2979岁,平均年龄(56.0610.05)岁;另选择2021年15月同科收治的重型颅脑损伤患者15例为对照组,其中男9例,女6例,年龄3076岁,平均年龄(53.439.35)岁;2组患者性别(2=0.090)和年龄(t=0.974)比较差异无统计学意义(P
23、0.05)。GBM组纳入标准:(1)有完整的临床病史记录、影像学及围手术期资料。(2)行常规开颅显微手术切除肿瘤,肿瘤切除程度有明确的手术记录。(3)根据 WHO 中枢神经系统肿瘤第五版分类标准11诊断为GBM,并经术后病理确诊。(4)术前均未接受过放化疗和靶向治疗。本研究经本院伦理委员会批准(批准号:2021伦审第53号),获患者或法定代理人知情同意并签署知情同意书。1.3材料、试剂和仪器人胶质母细胞瘤细胞株U87MG购自中国科学院上海细胞库;兔抗人CCL18单克隆抗体购自英国 Abcam 公 司,免 疫 组 化 试 剂 盒 和 二 氨 基 联 苯 胺(diaminobenzidine,DA
24、B)购自北京中杉金桥生物技术有限公916天津医药 2023 年 9 月第 51 卷第 9 期司;标准胎牛血清、胰酶、乙二胺四乙酸购自美国Gibico公司;RNA提取试剂盒、SYBR Green荧光定量逆转录试剂盒、CCK-8 试 剂 盒 购 自 武 汉 赛 维 尔 生 物 科 技 有 限 公 司;riboFECTTMCP转染试剂购自广州锐博生物科技有限公司;CCL18小干扰RNA(CCL18-siRNA)、阴性对照RNA由广州锐博生物科技有限公司设计合成。紫外分光光度计、CO2培养箱购自美国赛默飞世尔科技有限公司;全自动轮转式切片机购自德国 Leica 公司;酶标分析仪(ELx808)购自美国
25、BioTek公司;qPCR仪购自美国Bio-Rad公司;倒置荧光显微镜(CKX41)购自日本奥林巴斯公司;台式低速离心机购自德国Sigma公司。1.4免疫组织化学染色检测CCL18在GBM中的表达胶质母细胞瘤标本于肿瘤处取材,10%甲醛固定,常规石蜡包埋,4 m切片,常规二甲苯、无水乙醇脱蜡,PBS冲洗3次,切片置于柠檬酸修复液(pH=6.0)中修复,3%H2O2封闭20 min 阻断内源性过氧化物酶,PBS 清洗玻片 3 次,每次 5 min。加入CCL18抗体(1 200稀释)4 孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG二抗(1 500稀释),室温孵育1 h,DAB显色3 min,
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