CaMKⅡ对多囊卵巢综合征模型小鼠颗粒细胞中Caspase-3表达的影响.pdf

第 49 卷 第 4 期2023年 7 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.4Jul.2023DOI：10.13481/j.1671587X.20230418CaMK对多囊卵巢综合征模型小鼠颗粒细胞中 Caspase-3表达的影响谢贤国1,2,马亚博1,2,徐娅秀1,2,张燕1,2,杜长征1,2,徐金瑞1,2,杨易1,2（1.宁夏大学 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏 银川 750021；2.宁夏大学生命科学学院微生物与分子生物学系，宁夏 银川 750021）摘要 目的目的：探讨钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMK）在正常小鼠卵巢和多囊卵巢综合征（PCOS）小鼠卵巢组织中的差异表达，阐明 CaMK 对 PCOS 小 鼠 卵 巢 颗 粒 细 胞 凋 亡 的 影 响。方法方法：用蓖麻油溶解脱氢表雄酮（DHEA）皮下注射诱导 PCOS小鼠模型（PCOS组），对照组小鼠注射等体积蓖麻油，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测 2组小鼠血清中睾酮水平，阴道涂片监测2组小鼠发情周期变化，HE 染色观察 2组小鼠卵巢组织病理形态表现，免疫荧光染色法检测 2组小鼠卵巢组织中 CaMK蛋白定位和荧光强度，Western blotting 法检测 2 组小鼠卵巢组织中 CaMK和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 3（Caspase-3）蛋白表达水平。采用短发夹 RNA（sh-RNA）-CaMK慢病毒转染人卵巢颗粒细胞（KGN 细胞）建立 稳 转 体 系，分 为 空 白 对 照 组、sh-CaMK-1 组 和sh-CaMK-2组，Western blotting法检测 各 组 KGN 细 胞 中 CaMK 和 Caspase-3 蛋 白 表 达 水 平。结果结果：与对照组比较，PCOS组小鼠血清中总睾酮和游离睾酮水平明显升高（P0.01），发情周期紊乱，停滞于发情中期，卵巢组织中出现颗粒细胞层数较少的空泡状卵泡，表明 PCOS小鼠模型建立成功。CaMK蛋白在小鼠卵巢组织的卵母细胞、颗粒细胞和间质细胞中均有表达；与对照组比较，PCOS组小鼠卵巢组织中 CaMK荧光强度和蛋白表达水平明显降低（P0.01），Caspase-3蛋白表达水平明显升高（P0.01）。与空白对照组比较，sh-CaMK-1和sh-CaMK-2组KGN细胞中CaMK蛋白表达水平明显降低（P0.01），Caspase-3 蛋白表达水平明显升高（P0.01）。结论结论：PCOS 小鼠卵巢组织中 CaMK蛋白表达水平降低诱导 Caspase-3蛋白表达水平升高，进而促进颗粒细胞凋亡。关键词 钙调蛋白依赖性蛋白激酶；多囊卵巢综合征；动物模型；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 3中图分类号 R711.75文献标志码 AEffect of CaMK on Caspase-3 expression of granulosa cells in mice with polycystic ovary syndrome modelXIE Xianguo1,2,MA Yabo1,2,XU Yaxiu1,2,ZHANG Yan1,2,DU Changzheng1,2,XU Jinrui1,2,YANG Yi1,2（1.Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources with Western Characteristics，Ministry of Education，Ningxia University，Yinchuan 750021，China；2.Department of Microbiology and Molecular Biology，School of Life Sciences，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）文章编号 1671587X(2023)04096807收稿日期 20220908基金项目 科 技 部 国 家 重 点 研 发 计 划 项 目（2018YFC1003701）；宁 夏 回 族 自 治 区 科 技 厅 自 然 科 学 基 金 项 目（2021AAC03014）作者简介 谢贤国（1996），男，甘肃省临夏县人，在读硕士研究生，主要从事动物生物学方面的研究。通信作者 杨易，副教授，硕士研究生导师（E-mail：）968谢贤国，等.CaMK对多囊卵巢综合征模型小鼠颗粒细胞中 Caspase3表达的影响ABSTRACT Objective：To discuss the differential expressions of calmodulin-dependent protein kinase （CaMK）in ovarian tissue of the normal mice and the mice with polycystic ovary syndrome（PCOS），and to clarify the effect of CaMK on the apoptosis of ovarian granulosa cells of the PCOS mice.Methods：The dissolved dehydroepiandrosterone（DHEA）was used to induce the PCOS mouse models by subcutaneous injection，and the mice in control group were injected with the equal volume of castor oil.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method was used to detect the serum testosterone level of mice in two groups；vaginal smear was used to monitor the changes of estrous cycle of the mice in two groups；HE staining was used to observe the pathomorphology of ovarian tissue of the mice in two groups；immunofluorescence staining was used to detect the localization and fluorescence intensity of CaMK protein in ovarian tissue of the mice in two groups；Western blotting method was used to detect the expression levels of CaMK and cysteine-containing aspartate protein hydrolase 3（Caspase-3）proteins in ovarian tissue of the mice in two groups.The short hairpin RNA（sh-RNA）-CaMK lentivirus was used to transfect the human ovarian granulosa cells（KGN cells）to establish the stable transfection system.The experiment was divided into blank control，sh-CaMK-1，and sh-CaMK-2 groups.The expression levels of CaMK and Caspase-3 proteins in the KGN cells in various groups were detected by Western blotting method.Results：Compared with control group，the serum total testosterone and free testosterone levels of the mice in PCOS group were significantly increased（P0.01），the estrous cycle was disordered and stagnated in the middle of estrus，and the ovarian tissue showed the vacuolated follicles with fewer layers of granulosa cells，indicating that the PCOS mouse model was successfully established.The CaMK protein was expressed in the oocytes，granulosa cells，and mesenchymal cells in ovarian tissue；compared with control group，the fluorescence intensity of CaMK and expression level of protein in ovarian tissue of the mice in PCOS group were significantly decreased（P0.01），and the expression level of Caspase-3 protein in ovarian tissue of the mice was significantly increased（P0.01）.Compared with blank control group，the expression levels of CaMK protein in the KGN cells in sh-CaMK -1 and sh-CaMK -2 groups were significantly decreased（P0.01），and the expression levels of Caspase-3 protein were significantly increased（P0.01）.Conclusion：Decreasing the CaMK protein expression level in ovarian tissue of the PCOS mice induces the increasing of Caspase-3 protein expression level，thereby promoting the apoptosis of granulosa cells.KEYWORDS Calmodulin-dependent protein kinases ；Polycystic ovary syndrome；Animal model；Cysteinyl aspartate specific proteinase-3钙 调 蛋 白 依 赖 性 蛋 白 激 酶 （calmodulin-dependent protein kinases，CaMK）是一种功能多样的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞生长和增殖等过程中发挥重要的调控作用1。在乳腺癌和前列腺癌细胞中2，CaMK参与细胞增殖过程，抑制 CaMK 表 达 可 防 止 恶 性 肿 瘤 的 发 生3。CaMK通过直接激活核因子-B（nuclear factor kappa-B，NF-B）促进细胞增殖，抑制 CaMK表达可减弱甲状腺癌细胞 DNA 合成4。CaMK过表达可明显促进 B 淋巴细胞增殖。CaMK作为Ca2+信号通路的下游蛋白参与调控细胞凋亡5。研究6-7显示：CaMK具有抗凋亡活性，通过抑制含 半 胱 氨 酸 的 天 冬 氨 酸 蛋 白 水 解 酶 3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）表 达 和活化发挥抗凋亡作用，过表达 CaMK可预防或减弱 Caspase家族蛋白的活化。多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是女性内分泌及代谢异常疾病8。研究9显示：PCOS 患者颗粒细胞凋亡率明显升高。在PCOS 大鼠模型颗粒细胞中，随着卵泡的发育颗粒细胞中 Caspase-3 蛋白表达水平逐渐升高，导致颗粒细胞凋亡。但 CaMK对 PCOS 颗粒细胞凋亡的调控作用尚不清楚，本研究通过建立 PCOS小鼠模型和构建 CaMK敲降稳转细胞系，分析 CaMK在 PCOS 小鼠卵巢组织中的表达及敲降 CaMK对卵巢颗粒细胞凋亡蛋白 Caspase-3 的影响，探讨CaMK在 PCOS 颗粒细胞凋亡中的潜在作用，为PCOS的研究和治疗提供有效靶点。969第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）1 材料与方法 1.1实 验 动 物实 验 动 物、细 胞 和 主 要 试 剂细 胞 和 主 要 试 剂 SPF 级C57/BL6 小 鼠 20 只，4 周 龄，动 物 生 产许可证号：SCXK（京）2020-0006，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，在宁夏大学实验动物房饲养。人卵巢颗粒细胞（KGN 细胞）购自研究细胞库（research cell banks，RCB）。DMEM 培养基、胰蛋白酶和胎牛血清购自美国 Gibco 公司，青霉素和链霉素购自美国 Hyclone 公司，CaMK抗体购自美国 CST 公司，Caspase-3 抗体购自中国Affinity 公司，GAPDH 抗体购自美国 Abcam 公司，山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物科技有限公司，异 硫 氰 酸 荧 光 素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标 记 的 山 羊 抗 小 鼠 IgG（H+L）和Hoechst 33342 抗体购自上海碧云天生物技术有限公司，BCA 蛋白定量检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，4%组织细胞固定液和迪夫细 胞 染 色 剂 购 自 北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司，TritonTMX-100 购自美国 Sigma-Aldrich 公司，驴血清购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，酶联 免 疫 吸 附 试 验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自上海酶联试剂公司。1.2小鼠小鼠 PCOS 模型制备和动物分组模型制备和动物分组4 周龄体质量约 15 g 的 C57BL/6 小鼠分为 PCOS 组和对照组，每组 10 只。PCOS 组小鼠皮下注射 60 g g1体 质 量 脱 氢 表 雄 酮（dehydroepian drosterone，DHEA）（DHEA 溶于蓖麻油，浓度为 12 g L1），对照组小鼠皮下注射等体 积 蓖 麻 油，连 续 注 射21 d，建立 PCOS 小鼠模型。PCOS 小鼠应满足高雄激素水平、排卵异常和卵巢多囊样改变。1.3ELISA 法检测法检测 2 组小鼠血清中总睾酮和游离组小鼠血清中总睾酮和游离睾酮水平睾酮水平通过小鼠 眼 球 取 血，4 静 置 过 夜，4 000 r min1离心 20 min收集血清，采用 ELISA 试剂盒检测小鼠血清中总睾酮和游离睾酮水平。1.4连续阴道涂片染色检查小鼠发情周期连续阴道涂片染色检查小鼠发情周期使用PBS缓冲液浸湿的棉签采集小鼠阴道黏液，均匀涂于载玻片后甲醇固定 20 s，迪夫染色液染色，光学显微镜下拍照，连续 14 d记录小鼠发情周期，以白细胞、有核细胞、角质化无核细胞和有无黏液作为判断标准：只有白细胞和黏液为发情间期，具有有核细胞、少量白细胞和黏液为发情前期，只有角质化无核细胞为发情中期，白细胞、有核细胞、角质化无核细胞和黏液同时存在为发情后期。检测 2周内小鼠发情周期动态变化。1.5HE 染色观察染色观察 2 组小鼠卵巢组织病理形态表组小鼠卵巢组织病理形态表现现取小鼠卵巢组织，组织固定液固定 24 h；脱水：70%酒精 30 min，80%酒精 30 min，95%酒精 30 min，100%酒 精 30 min，100%酒 精 30 min，二甲苯 30 min，二甲苯 30 min；石蜡包埋切片；梯度酒精复水：二甲苯 5 min，二甲苯 5 min，100%酒精 3 min，100%酒 精 3 min，95%酒精 3 min，80%酒精 3 min，70%酒精 3 min，蒸馏水 5 min；HE 染色后观察 2 组小鼠卵巢组织病理形态表现。1.6免疫荧光染色法检测免疫荧光染色法检测 2 组小鼠卵巢组织中组小鼠卵巢组织中CaMK蛋白定位和荧光强度蛋白定位和荧光强度取小鼠卵巢组织，脱蜡复水步骤与 HE 染色相同。切片放入盛有柠檬酸缓冲液（工作液）的容器中，置 微 波 炉 内 高 火4 min 1次，低火 4 min 3次，室温冷却。抗原修复后，0.01 mol L1 PBS 缓 冲 液（pH7.4）洗涤 5 min 1 次。置于湿盒中，用 3%过氧化氢孵育 510 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；置于染缸中，PBS 缓冲液洗涤 5 min 3次。封闭：湿盒中进行血清封闭 30 min；弃去血清，加入一抗4 过 夜。在 暗 室 中 加 入 荧 光 标 记 二 抗（Alexa Fluor 488/555），按 1200比例采用 PBS 缓冲液稀释，37 孵育 60 min，移去二抗并用 PBS 缓冲液避 光 洗 涤，细 胞 核 染 色 及 封 片：滴 加 Hoechst 33342 染色 1 min，PBS 缓冲液洗涤 5 min3 次后滴加抗荧光淬灭封片剂，加盖玻片封片，荧光显微镜避光观察 CaMK蛋白在小鼠卵巢组织中的定位，采用 Image J 软件分析荧光强度。1.7Western blotting 法检测法检测 2 组小鼠卵巢组织和组小鼠卵巢组织和敲 减敲 减 CaMK 后 各 组后 各 组 KGN 细 胞 中细 胞 中 CaMK 和和Caspase-3 蛋 白 表 达 水 平蛋 白 表 达 水 平 6 孔 细 胞 培 养 板 培 养KGN 细胞，当 KGN 细胞密度在 75%左右时，采用 短 发 夹 RNA（short hairpin RNA，shRNA）-CaMK（sh-CaMK-1 和 sh-CaMK-2）慢病毒和 对 照 慢 病 毒 感 染 细 胞 48 h，分 别 为 shRNA-CaMK-1 组、shRNA-CaMK-2 组和空白对照组。使用含浓度为 2 mg L1嘌呤霉素的完全培养基进行筛选，每隔 24 h 筛选 1 次，连续筛选 3 代，建立稳转细胞体系。取小鼠卵巢组织和各组 KGN细胞，全 蛋 白 提 取 试 剂 盒 提 取 蛋 白。4、10 000 r min1离心 15 min 后吸取上清液。BCA 蛋白试剂盒检测蛋白浓度，用细胞裂解液调平蛋白浓970谢贤国，等.CaMK对多囊卵巢综合征模型小鼠颗粒细胞中 Caspase3表达的影响度。按 15比例加入 6 loading buffer，100 煮沸 10 min。进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，每孔上样量 10 L。电泳完成后湿转法转膜，根据目的蛋白相对分子质量选择合适的 PAGE胶和转膜时间。转膜完 成 后 用 5%脱 脂 牛 奶 封 闭 2 h。兔 源 抗 体CaMK、Caspase-3和 GAPDH 以 11 000比例稀释后 4 冰箱过夜孵育一抗。PBS缓冲液洗涤 5次，每次 3 min。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG用 TBST 以 15 000 比例稀释后孵育 1 h。PBS 缓冲液洗涤 5 次，每次 3 min。化学发光法曝光成像后用 Image J 软件分析灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。1.8统计统计学分析学分析采用Graphpad Prism version 8.0统计软件进行统计学分析。2 组小鼠卵巢组织中CaMK荧光强度及 CaMK和 Caspase-3 蛋白表达水平，各组 KGN 细胞中 CaMK和 Caspase-3蛋白表达水平，均以 xs表示，2组间样本均数比较采用两独立样本 t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以 P0.05为差异有统计学意义。2 结 果 2.12 组小鼠血清中总睾酮和游离睾酮水平组小鼠血清中总睾酮和游离睾酮水平与对照组比较，PCOS 组小鼠血清中总睾酮和游离睾酮水平均明显升高（P0.01），表明成功构建高雄激素血症模型小鼠。见表 1。2.22组小鼠发情周期组小鼠发情周期对照组小鼠发情周期为56 d，不同周期阶段的时间较稳定；PCOS 组小鼠发情周期紊乱，并且停滞于发情中期。表明在连续 14 d 中 PCOS小鼠未发生排卵，该变化与 PCOS临床表征相近。见图 1和 2。2.32 组小鼠卵巢组织病理形态表现组小鼠卵巢组织病理形态表现对照组小鼠无空泡囊状卵泡，有明显黄体；PCOS 组小鼠卵巢出现颗粒细胞层数较少的空泡状卵泡，无黄体产生，与临床卵巢多囊样改变相似。见图 3。表明PCOS小鼠模型建立成功，可用于后续实验。2.42 组小鼠卵巢组织中组小鼠卵巢组织中 CaMK蛋白定位蛋白定位、荧光荧光强度和蛋白表达水平强度和蛋白表达水平免疫荧光染色结果显示：CaMK蛋白在卵巢组织卵母细胞、颗粒细胞和间质 细 胞 中 均 有 表 达，与 对 照 组 （2 318.15422.727）AU 比 较，PCOS 组 小 鼠 卵 巢 组 织 中CaMK蛋白荧光强度（698.85073.860）AU明 显 降 低（P0.01）。Western blotting 法检测结果显示：与对照组（1.6410.058）比较，PCOS组小鼠卵巢组织中 CaMK蛋白表达水平（0.7610.139）明显降低（P0.01）。见图 4和 5。2.52 组小鼠卵巢组织中组小鼠卵巢组织中 Caspase-3 蛋白表达水蛋白表达水平平与对照组（0.6080.061）比较，PCOS 组小鼠卵巢组织中 Caspase-3 蛋白表达水平（1.1130.042）明显升高（P0.01）。见图 6。2.6各组各组 KGN 细胞中细胞中 CaMK和和 Caspase-3 蛋白蛋白表达水平表达水平与空白对照组（1.4080.961）比较，Sh-CaMK-1 组和 Sh-CaMK-2 组 KGN 细胞中CaMK蛋白表达水平（0.9950.061 和 0.704表表 12组小鼠血清中总睾酮和游离睾酮水平组小鼠血清中总睾酮和游离睾酮水平TabTab.1 1 L Levels of total testosterone and free testosterone evels of total testosterone and free testosterone i in serum of mice in two groupsn serum of mice in two groups（n=10，xs）GroupControlPCOSTotal testosteroneB/(g L1)6.421.5819.873.79*Free testosteroneB/(ng L1)174.6247.572 372.17172.64*P0.01 compared with control group.A：Proestrus；B：Estrus；C：Metestrus；D：Diestrus.图图 12组小鼠发情周期阴道涂片组小鼠发情周期阴道涂片（迪夫染色迪夫染色，Bar=75 m）Fig.1Vaginal smear of mice in two groups at oestrus cycle（Diff staining,Bar=75 m）971第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）0.042）明 显 降 低（P0.01）。与 空 白 对 照 组（0.7010.481）比 较，Sh-CaMK -1组 和Sh-CaMK-2 组 KGN 细胞中 Caspase-3 蛋白表达水平（1.5790.056 和 2.1040.165）明显升高（P0.01）。见图 7。3 讨 论 PCOS 作为女性生殖系统疾病，临床上主要表现为卵泡发育停滞导致的无排卵、雄激素水平升高和月经周期紊乱等。研究10表明：PCOS 的发生发展与颗粒细胞凋亡有关。PCOS 患者典型的特征表现为次级卵泡增加，鞘细胞层增厚，囊性卵泡增多。高雄激素血症11是 PCOS 的主要临床特征之一，高 雄 激 素 能 够 降 低 PCOS 患 者 的 妊 娠 率，PCOS 颗粒细胞凋亡受雄激素调控12-13。本研究利用小鼠皮下注射 DHEA 的方法14成功构建了具有发情周期紊乱、高雄激素和卵巢多囊样改变的PCOS小鼠模型。颗粒细胞作为维持卵巢生理功能的重要组成部分，在卵泡发育及卵母细胞成熟过程中具有决定性作用15。颗粒细胞凋亡会导致卵泡发育停滞或闭锁、卵母细胞成熟受阻和卵巢排卵障碍16。研图图 22组小鼠发情周期组小鼠发情周期Fig.2Oestrus cycles of mice in two groups 图图 42组小鼠卵巢组织中组小鼠卵巢组织中 CaMK蛋白定位蛋白定位（免疫荧光染色免疫荧光染色,Bar=50 m）Fig.4Localizations of CaMK protein in ovarian tissue of mice in two groups（Immunofluorescence staining,Bar=50 m）A：Control group；B：PCOS group.图图 32组小鼠卵巢组织病理形态表现组小鼠卵巢组织病理形态表现（HE，Bar=100 m）Fig.3 Pathomorphology of ovarian tissue of mice in two groups（HE，Bar=100 m）972谢贤国，等.CaMK对多囊卵巢综合征模型小鼠颗粒细胞中 Caspase3表达的影响究17表明：PCOS 小鼠卵巢颗粒细胞凋亡是引起卵巢多囊样改变的主要原因之一。CaMK对维持正常细胞增殖至关重要18，其表达水平降低可影响细胞活性和细胞凋亡率19。CaMK 通 过 抑 制B 细胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）拮抗/杀伤因子（Bcl-2-antagonist/killer，Bak）和 Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）的寡聚化阻止细胞色素 c（cytochrome-c，Cytc）释放至细胞外和 Caspase-3 活化，从而缓解细胞凋亡20。CaMK还能促进细胞 FLICE 样抑制性蛋白（cellular FLICE-like inhibitory protein，c-FLIP）的表达和磷酸化，进而抑制 Caspase-3 释放，影响细 胞 凋 亡 进 程21。CaMK 抑 制 内 质 网 膜 上 的Bax、Bak 多聚化和 Caspase-12 激活进而影响细胞中 Caspase-3 的 剪 切 活 化。本 研 究 结 果 显 示：PCOS 小鼠卵巢组织中 CaMK蛋白表达水平明显降低，并且伴随有凋亡蛋白 Caspase-3 表达水平升高；细胞实验结果也显示：敲降 CaMK后 KGN细胞中 Caspase-3蛋白表达水平明显升高。综上所述，PCOS 小鼠颗粒细胞中 Caspase-3蛋白表达水平升高与 CaMK表达水平降低有关。CaMK表达水平变化可能受雄激素 DHEA 的调控，但其具体机制有待于进一步研究。本课题组下一步将继续研究 CaMK在 PCOS 发生发展过程中的调控机制，以期为 PCOS的治疗提供新的靶点。参考文献1 HA T T，BURWELL S T，GOODWIN M L，et al.Pleiotropic roles of Ca2+/calmodulin-dependent pathways in regulating cadmium-induced toxicity in human osteoblast-like cell lines J.Toxicol Lett，2016，260：18-27.2 ARGUETA J，SOLS-CHAGOYN H，ESTRADA-REYES R，et al.Further evidence of the melatonin calmodulin interaction：effect on CaMK activityJ.Int J Mol Sci，2022，23（5）：2479.3 LI J N，ZHAO L，WU J，et al.Differences in gene expression profiles and carcinogenesis pathways between colon and rectal cancerJ.J Dig Dis，2012，13（1）：24-32.4 RUSCIANO M R，SALZANO M，MONACO S，et al.The Ca2+-calmodulin-dependent kinase is activated in papillary thyroid carcinoma（PTC）and mediates cell proliferation stimulated by RET/PTCJ.Endocr Relat Cancer，2010，17（1）：113-123.5 LIANG D F，ZENG Q Y，XU Z G，et al.BAFF activates Erk1/2 promoting cell proliferation and survival by Ca2+-CaMK -dependent inhibition of PP2A in normal and neoplastic B-lymphoid cellsJ.Biochem Pharmacol，2014，87（2）：332-343.6 LIU W，XU C，RAN D，et al.CaMK mediates cadmium induced apoptosis in rat primary osteoblasts through MAPK activation and endoplasmic reticulum stress J.Toxicology，2018，406/407：70-80.7 HART M R，SU H Y，BROKA D，et al.Inactive ERBB receptors cooperate with reactive oxygen species Lane 1：Control group；Lane 2：PCOS group.图图 5 Western blotting 法 检 测法 检 测 2 组 小 鼠 卵 巢 组 织 中组 小 鼠 卵 巢 组 织 中CaMK蛋白表达电泳图蛋白表达电泳图Fig.5Electrophoregram of expressions of CaMK protein in ovarian tissue of mice in two groups Lane 1：Control group；Lane 2：PCOS group.图图 6 Western blotting 法 检 测法 检 测 2 组 小 鼠 卵 巢 组 织 中组 小 鼠 卵 巢 组 织 中Caspase-3蛋白表达电泳图蛋白表达电泳图Fig.6Electrophoregram of expressions of Caspase-3 protein in ovarian tissue of mice in two groups Lane 1：Control group；Lane 2：sh-CaMK-1 group；Lane 3：sh-CaMK-2 group.图图 7各组各组 KGN 细胞中细胞中 CaMK和和 Caspase-3 蛋白表蛋白表达电泳图达电泳图Fig.7 Electrophoregram of expressions of CaMK and Caspase-3 proteins in OGN cells in various groups973第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）to suppress cancer progressionJ.Mol Ther，2013，21（11）：1996-2007.8 CHAPPELL N R，GIBBONS W E，BLESSON C S.Pathology of hyperandrogenemia in the oocyte of polycystic ovary syndromeJ.Steroids，2022，180：108989.9 LIM J J，LIMA P D A，SALEHI R，et al.Regulation of androgen receptor signaling by ubiquitination during folliculogenesis and its possible dysregulation in polycystic ovarian syndrome J.Sci Rep，2017，7（1）：10272.10ZHAO Y Y，PAN S H，LI Y Y，et al.Exosomal miR-143-3p derived from follicular fluid promotesgranulosa cell apoptosis by targeting BMPR1A in polycystic ovary syndrome J.Sci Rep，2022，12（1）：4359.11CAMPION C E，TREWIN A L，HUTZ R J.Effects of follicle-stimulating hormone administration on oestradiol-induced cystic ovaries in Guinea pigsJ.Zoolog Sci，1996，13（1）：137-142.12YETIM AHIN A，BA F，YETIM，et al.Determination of insulin resistance and its relationship with hyperandrogenemia，anti-Mllerian hormone，inhibin A，inhibin B，and insulin-like peptide-3 levels in adolescent girls with polycystic ovary syndromeJ.Turk J Med Sci，2019，49（4）：1117-1125.13YI S，ZHENG B，ZHU Y，et al.Melatonin ameliorates excessive PINK1/Parkin-mediated mitophagy by enhancing SIRT1 expression in granulosa cells of PCOSJ.Am J Physiol Endocrinol Metab，2020，319（1）：E91-E101.14MA H X，XIE J，LAI M H.Effe