柴胡三参胶囊调控HIF-1α_BNIP3_NIX介导的线粒体自噬通路减轻心肌缺血再灌注损伤作用的研究.pdf
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1、 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化心脑血管疾病研究柴胡三参胶囊调控HIF-1/BNIP3/NIX介导的线粒体自噬通路减轻心肌缺血再灌注损伤作用的研究曹蛟,刘建和,张杼惠,何涛,谭彩(湖南中医药大学第一附属医院 长沙 410007)摘要:目的从 HIF-1(Hypoxia-Inducible Factor-1)/BINP3(B lymphocytoma-2 gene-homology 3)/NIX(Nip-like
2、protein X)介导的线粒体自噬通路探讨柴胡三参胶囊保护心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)大鼠的生物学机制。方法选取50只SD大鼠,随机分为假手术(Sham)组、模型(I/R)组、柴胡三参胶囊(CHSS)组、HIF-1抑制剂(2ME2,二甲氧基雌二醇)组、HIF-1抑制剂柴胡三参胶囊(2ME2CHSS)组,每组10只。大鼠灌胃给药,每日1次,连续灌胃4周。末次给药24 h后,结扎左前降支冠状动脉30 min,再灌注120 min建立大鼠MIRI模型。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清中CK-MB(Creatin
3、e kinase-MB)、cTn I(Troponin)及 LDH(Lactate dehydrogenase)含量;HE 染色(Hematoxylin-eosin staining)观察心肌组织改变;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠心肌组织自噬相关蛋白HIF-1、BNIP3、NIX、微管相关蛋白1轻链3-(Microtubule-associated protein 1 light chain 3 B-,LC3-)、微管相关蛋白1轻链3-(Microtubule-associated protein 1 light chain 3 B-,LC3-)表达;流式细胞法检测线粒体
4、膜电位水平;电镜观察线粒体内自噬小体数量。结果与Sham组相比,I/R组血清CK-MB、cTn I、LDH含量升高(P0.05),心肌组织不同程度损伤,HIF-1、BNIP3、NIX表达及LC3-/LC3-比值升高(P0.05),线粒体膜电位水平降低(P0.05),线粒体自噬小体数量增多(P0.05);与I/R组相比,CHSS组血清CK-MB、cTn I、LDH含量降低(P0.05),心肌组织损伤程度较轻,HIF-1、BNIP3、NIX表达及LC3-/LC3-比值升高(P0.05),线粒体膜电位水平升高(P0.05),线粒体自噬小体数量增多(P0.05);与CHSS组相比,CHSS+2ME2组
5、血清CK-MB、cTn I、LDH明显降低(P0.05),心肌组织损伤程度加重,HIF-1、BNIP3、NIX表达及LC3-/LC3-比值最低(P0.05),线粒体膜电位水平降低(P0.05),线粒体自噬小体数量减少(P0.05)。结论柴胡三参胶囊对缺血再灌注大鼠心肌具有保护作用,这种机制与其促进HIF-1/BNIP3/NIX介导的心肌细胞线粒体自噬通路有关。关键词:柴胡三参胶囊 缺氧诱导因子-1 心肌缺血再灌注损伤 线粒体自噬doi:10.11842/wst.20220119003 中图分类号:R285.5 文献标识码:A中国心血管健康与疾病报告2020 显示:我国急性心肌梗死(Acute
6、myocardial infarction,AMI)患者2002-2018 年死亡率总体呈上升态势1。目前,针对AMI的主要治疗方法为短时间内进行血运重建,包括血管内溶栓、经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention,PCI)及冠状动脉旁路术(Coronary artery by pass surgery,CABG),其中PCI术最为常见,此手术方式可在短时间内使狭窄的冠状动脉再通,恢复 收稿日期:2022-01-19 修回日期:2022-06-16 湖南省中医药管理局2021年度湖南省中医药科研计划重点项目(2021011):基于ROS与HIF-
7、1通过线粒体自噬实现的crosstalk探讨柴胡三参胶囊对心肌缺血再灌注损伤的干预机制,负责人:刘建和。通讯作者:刘建和,教授,主任医师,博士生导师,主要研究方向:中医药防治心血管疾病研究。993 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 缺血部位的血液供应,然而当血流恢复后可继发心肌缺 血 再 灌 注 损 伤(Myocardial ischemia rePerfusion injury,MIRI
8、),其主要临床表现包括出现严重的室性心律失常、原有的梗死面积扩大、心衰症状加重、心肌顿抑等2。MIRI的发生已成为AMI治疗后所面对的临床难题,其严重影响了PCI术的临床疗效和AMI的预后,成为不可忽视的临床问题。HIF-1由和两个亚单位组成,其中HIF-1是重要功能单位,可通过调控多种基因表达而参与氧化应激、能量生成、细胞迁移等生理过程3。HIF-1的产生能够激活其下游的众多信号传导路径,以减少氧消耗、促进无氧代谢过程,使机体能够更好地适应低氧环境,此外,HIF-1可诱导缺氧靶基因的激活,调节心肌细胞线粒体自噬,参与MIRI的病理过程4。研究表明,HIF-1可预防MIRI的发生,且具有心脏保
9、护作用,在心肌缺血早期,HIF-1 的表达水平明显升高,急性心肌缺血时心肌组织中HIF-1的表达也明显高于正常心肌组织,其可促进受损心肌毛细血管形成,有效构建了缺血区的侧枝循环,此外HIF-1可以减少心肌细胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成,促进线粒体抗氧化剂产生,抑制心脏成纤维细胞凋亡,从而发挥抗心肌缺血作用5-6。MIRI的病理过程涉及自由基损伤、钙超载、炎症反应与线粒体自噬等多种生物学机制,线粒体自噬是机体进行自我调节的一种方式,通过自噬途径可将受损的线粒体进行分解后再利用,以维持机体物质与能量代谢平衡7。Yamaguchi8认为适当的线粒体自噬行为可
10、促进机体清除受损细胞器,从而对受损心肌产生保护作用,而过度自噬反应可损伤心肌细胞,因此调节线粒体自噬反应可能成为治疗心脏疾病新的突破口。BNIP3和 NIX位于线粒体外膜,BNIP3在缺氧期间可调节线粒体自噬,而在红细胞谱系发育过程中NIX是线粒体自噬所必需的,二者均为单通道跨膜蛋白,跨膜结构域是甘氨酸拉链,形成同型二聚体9。激活HIF-1基因可促进BNIP3和NIX的表达,参与调节线粒体自噬10-11。Wu 等12证实,褪黑激素通过激活MT2(Membrane matrix metalloproteinase)/SIRT3(Silencing information regulator 2
11、related enzymes 3)/FoxO3a(Forkhead box transcription factor O3a)通路,抑制线粒体过度自噬,保护MIRI后H9C2心肌细胞作用。肖钰雪等13证 实 中 药 乌 头 赤 石 脂 丸 可 通 过 调 控 PI3K(Phosphatidylinositol 3 kinase)/Akt(Protein kinase B)/GSK-3(Glycogen synthase kinase 3)信号通路,抑制心肌细胞过度自噬反应,对MIRI大鼠起到保护作用。贾飞凡14证实中药双参宁心胶囊可通过抑制 PINK1(Putative kinase 1 i
12、nduced by phosphatase and tensin homologous genes)/Parkin(E3泛素连接酶)通路介导的线粒体自噬过度激活,减轻心肌组织结构损伤及维持线粒体功能相对完整性,发挥抗MIRI功能。本实验分析各实验组大鼠血清心肌坏死标志物水平,HIF-1及线粒体自噬相关蛋白表达,流式细胞术观察线粒体膜电位变化,透射电镜观察胞内自噬小体数量,证实中药柴胡三参胶囊可通过调节HIF-1/BNIP3/NIX途径,促进HIF-1表达,促进线粒体自噬发生,发挥抗MIRI的生物学效应,为中医药在该领域的研究领域提供新的实验数据支撑。1 材料与方法 1.1动物50只SPF级雄性
13、SD大鼠,体质量220-240 g,由湖南斯莱克景达公司提供,实验动物生产许可证号:SCXK(湘)2019-0004。饲养于湖南中医药大学实验动物中心,每笼3只,温度22-26,湿度50%-70%,大鼠均自由进食饮水。1.2主要药物、试剂柴胡三参胶囊(柴胡、法半夏、黄连、党参、丹参、苦参、青篙、甘草组成,剂量比例15 10 6 15 10 10 10 6),由湖南中医药大学第一附属医院提供(批号:140403)。CK-MB试剂盒(武汉华美生物工程有限公,批号:F10039076)、cTn I试剂盒(武汉华美生物工程有限公司,批号:F09039075),LDH活性试剂盒(南京建成生物工程研究所,
14、批号:A202-2)、HIF-1一抗(美国 proteintech 公司,批号:20960-1-AP)、BNIP3 一抗(英国 abcam 公司,批号:ab109362),NIX 一抗(美国proteintech公司,批号:12986-1-AP)、LC3一抗(英国abcam公司,批号:ab192890)、HRP羊抗兔二抗(美国proteintech公司,批号:ab109362)。1.3主要仪器小动物呼吸机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,WD407型);台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司,H1650R);全自动酶标洗板机(深圳市汇松科技发展有限公司,PW-812);多功能酶994
15、 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化心脑血管疾病研究标分析仪(深圳市汇松科技发展有限公司,MB-530);MB-530电热恒温培养箱(北京市永光明医疗仪器有限公司,DHP-500);透射电镜(日本电子 JEM1400型);数码相机(morada G3)。1.4分组、造模及给药将50只雄性大鼠适应性喂养7天后按随机数字表法分为 Sham 组、I/R 组、CHSS 组、2ME2 组、2ME2+CHSS组,每组10只。柴胡
16、三参胶囊按照成人等效剂量换算为大鼠剂量,按此剂量,CHSS组大鼠每日灌胃0.6 g;Sham组和I/R组分别给予相同体积生理盐水灌胃;2ME2 组给予剂量(2ME2)0.15 mgkg-1,造模前30 min腹腔注射;2ME2+CHSS组给予柴胡三参胶囊内容物溶液剂量同 CHSS 组,造模前 30 min 腹腔注射2ME2 0.15 mgkg-1;所有实验大鼠每日均灌胃 1 次。末次给药 24 h 后,用 10%水合氯醛腹腔注射麻醉老鼠,用心电图机采集大鼠导联心电图,切开气管,连接呼吸机。在胸骨左缘纵行切开皮肤,依次分离组织,暴露心脏,结扎冠状动脉左前降支。以导联T波高耸或ST段明显抬高,结扎
17、线以下心脏表面区域颜色变暗、搏动减弱为造模成功的标准。结扎30 min后再灌注120 min。观察灌注后ECG的变化,观察结束后取材。Sham组:麻醉开胸方法同上,但只穿线,不结扎。1.5检测方法1.5.1ELISA 法测血清CK-MB、cTn I、LDH含量再灌注结束后,立即抽取大鼠腹主动脉血,3000 rmin-1,4离心15 min,吸取上清液,严格按照试剂盒说明书检测方法进行操作,检测血清 CK-MB、cTnI LDH含量。1.5.2心肌组织病理检查再灌注结束后,取一份心脏组织,切取梗死部位心肌,多聚甲醛固定后脱水、利用石蜡对组织进行包埋,连续切出0.5 m切片,然后脱蜡、水化、染色、
18、封片,用普通光学显微镜4010倍数下采集图片并进行结果分析。1.5.3Western blot法检测HIF-1、BNIP3、NIX、LC3B-、LC3B-I表达取一份心脏组织,切取梗死部位心肌,用冰预冷PBS洗组织,加入300 L RIPA裂解液于生物样品均质仪中反复研磨组织,4,12000 rmin-1离心15 min,将上清液转移入1.5 mL离心管中,严格按照说明书要求进行实验。BCA法测总蛋白剂量。每孔各取20 L蛋白上样,电泳恒定电压78 V,时间为2.5 h,待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。切下目的条带后进行转膜,5%脱脂奶粉封闭,一抗室温孵育90 min,二抗室温孵育 90 mi
19、n,孵育结束,1PBST 洗 3次,每次 10 min,使用 ECL化学发光液与膜孵育1 min,在凝胶成像系统中成像,Quantity one专业灰度分析软件进行分析。1.5.4线粒体膜电位检测取一份心脏组织,切取梗死部位心肌,严格遵循JC-1线粒体膜电位检测试剂盒说明书实验步骤,配置并稀释 JC-1工作液,稀释后将其加入纯化的线粒体中,用流式细胞仪检测 JC-1单体(激发波长 488 nm,发射波长527 nm)和聚集体(激发波长488 nm,发射波长590 nm)。线粒体膜电位高时JC-1形成聚集体,表现为红色荧光(右上象限,Q1-UR);线粒体膜电位低时 JC-1 单体较多,表现为绿色
20、荧光(右下象限,Q1-LR)。红/绿荧光比值越高,线粒体膜电位越高。1.5.5电镜观察线粒体内自噬小体取一份心脏组织,切取梗死部位心肌,固定到2.5%戊二醛6-12 h;弃掉固定液,将组织置于PBS缓冲液中 1-6 h;再将组织置于 1%锇酸后固定 1-2 h。梯度乙醇、乙醇醋酸铀、环氧丙烷脱水。环氧树脂包埋、切片,3%醋酸铀-硝酸铅双染色。在透射电镜下观察、拍摄,选取各组代表性电镜图片,人工计数自噬小体数目,并对各组图片自噬小体求平均值。1.6统计学方法采用SPSS 22.0软件对实验结果进行分析,计量资料以均值标准差(x s)表示,多组件比较前进行方差分析,方差齐者用LSD法,若方差不齐,
21、用Dunnett T3法,不满足正态分布用秩和检验,以P0.05表示差异具有统计学意义。2 结果 2.1各组大鼠血清CK-MB、cTn I、LDH含量比较结果见表1,与Sham组相比,I/R组血清CK-MB、cTn I、LDH含量升高(P0.05);与I/R组相比,CHSS组血清CK-MB、cTn I、LDH含量降低(P0.05);与CHSS组相比,CHSS+2ME2组血清CK-MB、cTn I、LDH含量降低(P0.05)。2.2各组大鼠心肌组织病理改变结果见图1,HE染色结果显示Sham组心肌组织结构正常,纤维组织排列整齐,无断裂;2ME2组病变最严重,心肌细胞纤维断裂,丧失完整结构;I/
22、R组与2ME2995 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 CHSS组心肌组织结构紊乱,但损伤程度较2ME2组轻;CHSS组结构较完整,心肌损伤程度轻,结构较完整。2.3各组大鼠 HIF-1、BNIP3、NIX 表达及 LC3-/LC3-比值结果见表 2,Western blot 结果显示与 Sham 组相比,I/R组HIF-1、BNIP3、NIX表达及LC3-/LC3-比值升高(P0.05)
23、;与 I/R 组相比,CHSS 组 HIF-1、BNIP3、NIX表达及LC3-/LC3-比值升高(P0.05);与CHSS组相比,CHSS2ME2组HIF-1、BNIP3、NIX表 达 及 LC3-/LC3-比 值 降 高(P0.05),具 体见图2。2.4各组大鼠线粒体膜电位水平结果见图3,与Sham组相比,I/R组线粒体膜电位水降低(P0.05);与 I/R 组相比,CHSS组膜电位升高(P0.05);与CHSS组相比,CHSS2ME2组膜电位降低(P0.05)。2.5电镜观察线粒体自噬小体由图4可知(箭头所指),与Sham组相比,I/R组单位面积自噬小体数量增多;与I/R组相比,CHS
24、S组数图1各组大鼠心肌组织病理学改变(HE染色,400倍)ABCDEHIF-1BNIP3NIX120 KD30 KD70 KD16 KD14 KD36 KDLC3-LC3-GAPDH图2各组大鼠心肌组织HIF-1、BNIP3、NIX表达及LC3-/LC3-比值蛋白灰度分析注:A:Sham组;B:为I/R组;C:CHSS组;D:2ME2组;E:2ME2+CHSS组。表2各组大鼠HIF-1、BNIP3、NIX蛋白水平表达量及LC3B-/比值(x s,n=5)组别Sham组I/R组CHSS组2ME2组2ME2+CHSS组HIF-1/GAPDH0.170.022)3)0.260.041)3)0.420
25、.051)2)3)0.110.021)2)0.260.051)3)BNIP3/GAPDH0.200.032)3)0.280.031)3)0.430.071)2)3)0.110.021)2)0.270.031)3)NIX/GAPDH0.190.022)3)0.270.061)3)0.440.031)2)3)0.130.031)2)0.280.051)3)LC3-/LC3-0.500.062)3)0.870.191)3)3.790.261)2)3)0.300.401)2)0.950.151)3)注:与Sham组比较,1)P0.05;与I/R组比较,2)P0.05;与CHSS组比较,3)P0.05。
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