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第 40 卷 第 4 期 2023 年 8 月 张悦 等 HPLC 法测定清开灵注射液中辅料含量 17 HPLC 法测定清开灵注射液中辅料含量 张 悦1 曹云飞2 张岩岩3，4（1.北京市平谷区市场监督管理局检验检测中心，北京 101200；2.镇江市食品药品监督检验中心；3.神威药业集团有限公司，石家庄 051430；4.云南省配方颗粒重点实验室，楚雄 675000）摘 要 目的：建立清开灵注射液中辅料硫代硫酸钠和依地酸二钠的含量测定方法。方法：使用高效液相色谱法检测硫代硫酸钠和依地酸二钠的含量，对于硫代硫酸钠：Inerstil-ODS-SP（250mm4.6 mm，5m）色谱柱，乙腈0.85 g/L 的四丁基硫酸氢铵水溶液梯度洗脱；检测波长 214 nm，柱温为 25，流速 1mLmin-1；对于依地酸二钠，Inerstil-ODS-SP（250mm4.6mm，5m）色谱柱；0.3%四丁基氢氧化铵（磷酸调 pH 至 4.0）-乙腈-水（18:37:45）为流动相，流速 0.6mLmin-1，柱温为 25，检测波长 254 nm。结果：硫代硫酸钠、依地酸二钠分别在 10.12303.6 g/mL（R2=0.9999）1.66349.89g/mL（R2=0.9999）浓度范围内线性关系良好，平均回收率分别为 99.3%和 99.6%。结论：该方法可作为清开灵注射液中硫代硫酸钠和依地酸二钠的含量测定方法。关键词 清开灵注射液；硫代硫酸钠；依地酸二钠；高效液相色谱法 HPLC Determination of excipients in Qingkailing Injection Zhang yue1;Cao yunfei2;Zhang Yanyan3,4（1.Inspection and Testing Center of Market Regulation Administration of Pinggu District,Beijing 101200,China；2.Zhenjiang Food and Drug Supervision and Inspection Center；3.Shineway Pharmaceutical Group Co.,Ltd.,Shijiazhuang 051430,China;4.Yunnan Provincial Key Laboratory of Formula Granules Chuxiong 675000,China）Abstract Objective:To establish determination methods of contents of sodium thiosulphate and edetate disodium in Qingkailing injection.Method:HPLC was used to determine the contents of sodium thiosulphate and edetate disodium.For sodium thiosulphate,the separation was performed on the Inerstil-ODS-SP column(4.6 mm 250 mm,5 m)at 25.The mobile phase consisted of acetonitrile and water with XXX%tetrabutylammonium hydrogen sulfate at a flow rate of 1.0 mLmin-1.The detection wavelength was 214 nm.The content determination of edetate disodium was also conducted using Inerstil-ODS-SP column(4.6mm 250mm,5m).0.3%tetrabutylammonium hydrogen sulfate(whose pH was adjusted to 4.0 by phosphoric acid),acetonitrile and water,with the proportion being 18:37:45,was used as the mobile phase.The flow rate was set at 0.6 mLmin-1.The temperature of the column was maintained at 25 and the signal was detected at 254 nm.Results:A linear relationships between the concentration of test solution and aera could be acquired in 10.12 303.6 g/mL(R2=0.9999)for sodium thiosulphate.The linearity range for edetate disodium was 1.66349.89 g/mL(R2=0.9999).Average recovery rates were 99.3%and 99.6%,respectively.Conclusion:The method can be used for quality control of Sodium Thiosulfat andedetate disodium in Qingkailing Injection Key words Qingkailing Injection;Sodium Thiosulfat;EDTA-2Na;HPLC 收稿日期：2023-03-09 基金项目：中央引导地方科技发展资金项目，项目名称：经典名方开发关键技术体系创建及应用（项目编号：206Z2502G）作者简介：张悦（1986-），男，本科，汉，主管药师，研究方向：中药质量标准研究 曹云飞（1982-），男，副主任药师，研究方向：药物监督检验 通讯作者：张岩岩（1986-），男，高级工程师，研究方向：现代中药研发及质量控制。E-mail: Modern Scientific Instruments Vol.40 No.4 Aug.2023 18 清开灵注射液由中医著名“安宫牛黄丸”古方拆方改制而成，被中国药典一部（2020 年版）收载1，具有化痰通络，醒神开窍的功效，用于治疗中风偏瘫、小儿高热惊厥、小儿肺炎、急性肝炎、缺血性脑血管疾病、上呼吸道感染等28。中药注射剂的成分比较复杂，使用过程中会存在一定的风险。药物的氧化反应是引起注射剂不稳定的主要因素之一。药物的氧化通常是与空气中普遍存在的氧发生缓慢的反应，为了防止或延缓注射液中药物氧化反应的进行，在清开灵注射液中添加了具有还原特性的硫代硫酸钠（Na2S2O3）作为抗氧剂9。金属离子对自氧化反应可产生催化作用，而金属络合剂乙二胺四乙酸二钠（又称依地酸二钠，EDTA-2Na），可阻止金属离子的催化，从而减慢或抑制自氧化反应10。目前未见针对清开灵注射液所添加辅料硫代硫酸钠和乙二胺四乙酸二钠含量测定方法的文献资料。为了患者可以安全用药，急需研发一种适用于清开灵注射液中辅料硫代硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠含量测定的方法。中国药典 2020 版二部中采用碘量法测定硫代硫酸钠的含量11；中国药典 2020 版四部中依地酸二钠的含量应用滴定法测定12。因中药注射液本身呈一定颜色，会干扰滴定终点的判断，给精确测定造成了困难。本研究分别建立了适用于清开灵注射液中硫代硫酸钠、依地酸二钠含量测定的液相色谱方法，该实验方法便操作、灵敏度高、专属性强、结果准确，可用于清开灵注射液中硫代硫酸钠和乙二胺四乙酸二钠的质量控制。1 仪器与试药 1.1 仪器 1260 型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；色谱柱 Inerstil-ODS-SP（250mm4.6mm，5m）（日本 GLSciences 技尔公司）；CPA225D 型分析天平（德国赛多利斯）；KH3200E型超声波清洗器（昆山禾创）。1.2 试剂 对照品硫代硫酸钠（批号 MKBN2652V，纯度99%，美国 Sigma-Aldrich 公司）、二水合乙二胺四乙酸二钠（分析纯，南京化学试剂股份有限公司生产），四丁基硫酸氢铵（美国 Sigma-Aldrich 公司），40%四丁基氢氧化铵溶液（萨恩化学试剂股份有公司），磷酸（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），硫酸铁（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），色谱纯乙腈，超纯水。供试品：清开灵注射液 17101231、18101532、190910B1 共三批次，由神威药业提供。2 方法与结果 2.1 硫代硫酸钠含量测定 2.1.1 色谱条件 色谱柱 Inerstil-ODS-SP（250mm4.6mm，5m）；流动相 A 乙腈，流动相 B 四丁基硫酸氢铵（0.85g1L）水溶液，采用梯度洗脱，0-15min：10-30%A；15-20min：30-70%A；20-25min：70-70%A；进样量10L；流速 1mLmin1；25柱温；检测波长为214nm。2.1.2 制备对照品溶液 精密称取硫代硫酸钠对照品约 10mg，加入 100nl量瓶中，用水溶解定容至刻度，混匀，制成每 1ml含 100g 硫代硫酸钠的溶液。2.1.3 制备供试品溶液 精密量取 190910B1 批清开灵注射液 2mL，加入10mL 容量瓶中，加入水，定容至刻度，混匀。2.1.4 制备阴性对照溶液 按处方制备未添加硫代硫酸钠辅料的清开灵注射液样品，依照“2.1.3”项下同法制成阴性对照溶液。2.1.5 专属性 取上述三种溶液，按 2.1.1 分别进样各 10L，发现阴性对照溶液图谱中在与供试品溶液中硫代硫酸钠相同的保留时间处无干扰峰存在（图 1）。第 40 卷 第 4 期 2023 年 8 月 张悦 等 HPLC 法测定清开灵注射液中辅料含量 19 A 对照溶液（硫代硫酸钠）B 对照溶液（阴性）C 供试品溶液 图 1 清开灵注射液中硫代硫酸钠含量测定高效液相色谱图 2.1.6 线性关系 取对照品溶液依次进样 1l、2l、5l、10l、20l、30l 后测定。以横坐标是进样量（g/mL），纵坐标是峰面积，进行线性回归，可得硫代硫酸钠的回归方程为：y=6.3648x+5.549，r2=0.9999（n=6）。说明在10.12303.6g/mL，硫代硫酸钠呈较好线性关系。2.1.7 精密度 取 190910B1 批清开灵注射液制备供试品溶液，精密吸取 10L 进样，连续 5 次，记录硫代硫酸钠的峰面积，计算其相对标准偏差（RSD）为 0.3%。表明精密度良好。2.1.8 溶液的稳定性 取 190910B1 批清开灵注射液制备供试品溶液，在放置 0、1、2、4、8、12、24h 时进样，分别精密吸取 10L 测定，记录硫代硫酸钠峰面积，计算其相对标准偏差（RSD）为 0.7%。说明表明溶液在 24 h内稳定。2.1.9 重复性试验 取 190910B1 批的清开灵注射液，分别量取1.6mL、2.0mL、2.4mL 各三份置 10ml 量瓶中，用水定容至刻度，混匀后作为供试品溶液，按 2.1.1 的色谱条件分别测定。以上样品硫代硫酸钠含量的相对标准偏差（RSD）为 1.7%。结果说明本方法重复性良好。2.1.10 加样回收 精密吸取 9 份批号为 190910B1 已知含量的清开灵注射液各 1mL，分成 3 组，每组分别精密加入一定量的硫代硫酸钠对照品贮备液，使得加入对照品的量约相当于样品中所含硫代硫酸钠量的 50%、100%、150%，按 2.1.1 的色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表 1。表 1 硫代硫酸钠加样回收率的结果（n=9）已有量 mg添加量 mg结果 mg 回收率%平均回收率%RSD（%）0.3199 0.1518 0.4733 101.1%99.6 1.1 0.3199 0.1518 0.4705 99.2%0.3199 0.1518 0.4696 98.6%0.3199 0.3036 0.6291 101.8%0.3199 0.3036 0.6205 99.0%0.3199 0.3036 0.6213 99.3%0.3199 0.4554 0.7712 99.1%0.3199 0.4554 0.7707 99.0%0.3199 0.4554 0.7714 99.1%2.1.11 耐用性试验 分 别 考 察 了 不 同 品 牌 的 色 谱 柱（Agilent ZORBAX Eclipse plus C18、Kromasil 100-5 C18、Modern Scientific Instruments Vol.40 No.4 Aug.2023 20 Welch Ultimate XB-C18）、考察柱温（20、25、30）、不同的流速条件（0.9、1.0、1.1mLmin1）、不同的盐浓度条件（0.70g1L、0.85g1L、1.00g1L）以及不同的流动相比例，结果发现即使改变以上色谱条件，实验结果无显著差异，说明此方法有较好耐用性。2.1.12 多批样品的含量测定 取 17101231、18101532、190910B1 共三批次清开灵注射液，按“2.1.3”项下方法制成供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件测定，按外标一点法计算清开灵注射液中硫代硫酸钠的含量，结果见表 2。表 2 硫代硫酸钠含量测定结果（n=2）批号 硫代硫酸钠 mg/ml 17101231 0.63 18101532 0.65 190910B1 0.64 2.2 依地酸二钠含量测定 2.2.1 色谱条件 色谱柱 Inerstil-ODS-SP（250mm4.6mm，5m）；以 0.3%四丁基氢氧化铵（磷酸调 pH 至 4.0）-乙腈-水（18:37:45）为流动相；进样量 20L；柱温 25；流速 0.6mLmin1；检测波长 254nm。2.2.2 制备对照品溶液 精密称取二水合乙二胺四乙酸二钠约 15mg，加入 50ml 量瓶中，用水溶解，定容，混匀，制成 0.3mg/ml的溶液。再精密吸取 2ml，加入 20ml 量瓶中，用0.2mg/ml 硫酸铁溶液定容至刻度，混匀，放置 15min，过滤，即得。2.2.3 制备供试品溶液 精密吸取 190910B1 批清开灵注射液 5mL，加水稀释定容至 10mL 容量瓶中，混匀。再精密吸取 2ml，加入到 20ml 量瓶中，用 0.2mg/ml 硫酸铁溶液定容至刻度，混匀，放置 15min，滤过，即得。2.2.4 制备阴性对照溶液 按处方制备未添加辅料依地酸二钠辅料的清开灵注射液样品，依照“2.2.3”项下方法制备，即得。2.2.5 专属性 取上述三种溶液，分别进样各 20L，发现阴性样品色谱中在与供试品溶液中依地酸二钠相同的保留时间处无干扰峰存在（图 2）。A 对照溶液（依地酸二钠）B 对照溶液（阴性）C 供试品溶液 图 2 清开灵注射液中依地酸二钠含量测定高效液相色谱图 第 40 卷 第 4 期 2023 年 8 月 张悦 等 HPLC 法测定清开灵注射液中辅料含量 21 2.2.6 线性 取对照品溶液，依次进样 1l、2l、5l、10l、20l、30l。以横坐标是进样量（g/mL），纵坐标是峰面积，进行线性回归，可得依地酸二钠的回归方程为 y=2.3472x-9.1229，相关系数 r2=0.9999（n=6）。说明在 1.66349.89g/mL 范围内，依地酸二钠呈良好的线性关系。2.2.7 精密度 取 190910B1 批的清开灵注射液制备一份供试品溶液，进样量 20L，连续 5 次，记录每次依地酸二钠的峰面积值，计算其相对标准偏差（RSD）为 0.4%（n=5）。说明精密度良好。2.2.8 溶液的稳定性 取批号 190910B1 的清开灵注射液制备供试品溶液，分别在放置 0、1、2、4、8、12、24h 时测定，每次进样 20L，记录依地酸二钠的峰面积，计算其相对标准偏差（RSD）为 0.6%。结果表明样品在 24 h内稳定。2.2.9 重复性 取批号为 190910B1 的清开灵注射液样品，分别量取 4.0mL、5.0mL、6.0mL 各三份置量瓶中，按上述方法制成依地酸二钠的供试品溶液，再按上述色谱条件测定。外标法计算依地酸二钠含量，并得出其相对标准偏差（RSD）为 1.1%。说明本方法重复性良好。2.2.10 加样回收 精密量取 9 份已知含量的批号为 190910B1 的清开灵注射液各 2.5mL，分成 3 组，每组再分别精密加入一定量的对照品贮备液，使加入的对照品量约相当于样品中所含依地酸二钠含量的 50%、100%、150%的，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表 3。表 3 依地酸二钠加样回收率试验结果（n=9）已有量 mg添加量 mg测得量 mg 回收率%平均回收率%RSD（%）0.3199 0.1663 0.4833 98.3 99.6 0.8 0.3199 0.1663 0.4852 99.4 0.3199 0.1663 0.4867 100.3 0.3199 0.3326 0.6519 99.8 0.3199 0.3326 0.6550 100.8 0.3199 0.3326 0.6531 100.2 0.3199 0.4989 0.8121 98.7 0.3199 0.4989 0.8170 99.0.3199 0.4989 0.8141 99.1 2.2.11 耐用性试验 分别考察了不同的对色谱柱（Agilent ZORBAX Eclipse plus C18、Kromasil 100-5 C18、Welch Ultimate XB-C18），不同的柱温条件（20、25、30）、不同的流速条件（0.5、0.6、0.7mLmin1）、不同的 pH 值条件（3.5、4.0、4.5）以及不同比例的流动相，结果发现即使改变以上色谱条件，实验结果无显著差异，说明此方法有较好耐用性。2.2.12 多批样品的含量测定 取 3 批不同生产时间的清开灵注射液样品，按上述方法每批平行取样 2 份并制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录依地酸二钠色谱峰面积，按外标法计算每批清开灵注射液样品中依地酸二钠的含量，结果见表 4。表 4 依地酸二钠测定结果（n=2）批号 依地酸二钠 mg/ml 17101231 0.64 18101532 0.63 190910B1 0.64 3 讨论 3.1 硫代硫酸钠色谱条件的优选 参考文献方法1316分别考察了以甲醇为流动相、四丁基硫酸氢铵水溶液-乙腈为流动相，比较色谱图后发现以乙腈-四丁基硫酸氢铵（0.85g1L）水系统为流动相时各色谱峰分离效果较好。文献中分别采用 Modern Scientific Instruments Vol.40 No.4 Aug.2023 22 240、214 nm 作为检测波长，通过二极管阵列检测器的扫描，将硫代硫酸钠对照品溶液于 190400 nm 波长扫描，测得对照品溶液在 214 nm 处有最大吸收，故选用 214 nm 作为检测波长。3.2 依地酸二钠色谱条件的优选 目前，依地酸二钠的含量测定一般采用滴定法和比色法。但这两种方法专属性差，直接影响了测定结果的准确性，故本研究参考专属性较高的高效液相色谱法10,1517相关文献进行研究。利用 HPLC 法检测依地酸二钠的金属螯合物来定量的，有文献提到依地酸二钠与 Fe3+形成的螯合物稳定系数较高15，故本研究采用硫酸铁溶液与依地酸二钠和 Fe3+形成稳定的螯合物，在 254nm 处有最大吸收。本研究分别建立了用于测定清开灵注射液中辅料硫代硫酸钠和依地酸二钠的高效液相色谱方法，该法为不仅可用于清开灵注射液的检测，同时也为其他药品中硫代硫酸钠、依地酸二钠含量的检测提供了思路。参考文献 1 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部S.2020 年版.北京:中国医药科技出版社,2020:930-931.2 张玲,梅波,刘中洋.清热解毒类中药注射剂治疗呼吸系统感染的研究进展J.中国医药,2019,14(11):1750-1753.3 郝璐,谢雁鸣,章轶立,等.基于医院信息系统的清开灵注射液治疗缺血性脑血管疾病的真实世界疗效分析J.中医杂志,2019,60(13):1123-1128.4 马重阳.基于网络药理学研究精制清开灵注射液抗缺血性脑卒中的作用机制D.北京中医药大学,2019.5 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