ApoE基因对老年小鼠脊髓组织炎症因子表达的影响.pdf
《ApoE基因对老年小鼠脊髓组织炎症因子表达的影响.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《ApoE基因对老年小鼠脊髓组织炎症因子表达的影响.pdf(6页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、摇 基金项目:辽宁省自然科学基金项目,项目编号:2022-MS-390。摇 作者简介:穆天驰(1989),男,辽宁锦州人,检验师,硕士学位,主要研究方向为衰老相关疾病。摇 通讯作者:田鹤(1979),女,辽宁锦州人,教授,博士学位,主要研究方向为脊髓损伤发病机制。ApoE 基因对老年小鼠脊髓组织炎症因子表达的影响穆天驰1,田鹤2(1郾 锦州医科大学附属第一医院;2郾 锦州医科大学基础医学院,辽宁 锦州 121000)摇 摇 摘要:目的摇 探讨载脂蛋白 E(apolipoprotein E,ApoE)基因对老年小鼠脊髓组织炎症因子表达的影响。方法摇培养C57/BL6 野生型小鼠和 ApoE 基因
2、敲除小鼠,饲养至 16 18 个月,建立自然衰老模型。取材小鼠脊髓组织,应用免疫组织化学染色技术观察白介素 6(interleukin 6,IL-6)和白介素 10(interleukin 10,IL-10)的表达并分析表达量。通过酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测脊髓组织中 IL-10 和白介素 1茁(interleukin 1茁,IL-1茁)的含量。应用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术检测肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和精氨酸
3、酶 1(arginase-1,Arg-1)mRNA 的表达。结果摇 免疫组织化学染色、ELISA 和 RT-qPCR 实验结果显示与野生型小鼠比较,老年 ApoE 基因敲除小鼠脊髓组织中促炎因子 IL-6、IL-1茁 和 TNF 表达增加,抗炎因子 IL-10 和 Arg-1表达减少。结论摇 ApoE 基因影响衰老小鼠脊髓组织炎症因子的表达,该基因可作为老年脊髓疾病治疗的靶点。关键词:老年;脊髓;ApoE;炎症因子中图分类号:R744郾 3摇 摇 摇 文献标志码:A摇 摇 摇 文章编号:2096-305X(2023)04-0017-05Effect of ApoE Gene on the Ex
4、pression of InflammatoryFactors in Spinal Cord Tissue of Aged MiceMu Tianchi1,Tian He2(1郾 The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medial University;2郾 School of Basic Medicine,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000 China)Abstract:Objective摇 To investigate the effect of apolipoprotein E(ApoE)gene
5、 on the expression of inflammatory factors in thespinal cord tissue of aged mice.Methods摇 C57/BL6 wild-type mice and ApoE gene knockout mice were cultured for 16-18 months toestablish natural aging model.The spinal cord tissues of mice were taken,and the expressions of interleukin 6(IL-6)and interle
6、u鄄kin 10(IL-10)were observed and analyzed by immunohistochemical staining.The contents of IL-10 and interleukin 1茁(IL-1茁)in spinal cord tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Real-time quantitative PCR(RT-qPCR)hasbeen used to detect the mRNA expression of tumor necrosis fac
7、tor(TNF)and arginase-1(Arg-1).Results摇 Immunohistochemicalstaining,ELISA and RT-qPCR showed that the expressions of pro-inflammatory factors IL-6,IL-1茁 and TNF were increased,andthe expressions of anti-inflammatory factors IL-10 and Arg-1 were decreased in the spinal cord of aged ApoE knockout mice
8、comparedwith wild-type mice.Conclusion摇 ApoE gene affects the expression of inflammatory cytokines in the spinal cord tissue of senile miceand can be used as a therapeutic target for senile spinal cord diseases.Key words:aging;spinal cord;ApoE;inflammatory factors摇 摇 衰老是全身各系统都不可避免出现的病理生理过程,伴随器官形态和功能
9、的改变1。如何预防和治疗衰老相关疾病一直是研究的热点,在对老年群体多发疾病的研究过程中,神经系统的改变一直备受关注。神经元和胶质细胞结构和功能的异常会引发氧化应激、炎症等病理反应,反之氧化应激或炎症的异常也会加剧神经元的损伤2。炎症与衰老关系密切,衰老的个体常伴随免疫系统功能的退化,机体内抗炎和促炎的调节网络失去平衡,导致老年人机体内常出现慢性持续的炎症反应3-4。中枢神经系统(central nervous system,CNS)的炎症反应在衰老早期即出现,如胶质细胞异常激活、炎71锦州医科大学学报J Jinzhou Medical University2023 Aug.44(4)症因子分泌
10、改变、细胞因子、自由基、前列腺素等异常分泌5-6。如阿尔茨海默病(alzheimer dis鄄ease,AD)、帕金森病(parkinson忆s disease,PD)等与衰老密切相关的神经系统退行性疾病,患者脑组织内均有异常的神经炎症反应,调控炎症反应可有效减缓疾病的进程7-8。脊髓作为中枢神经系统的重要组成部分,是连接脑和外界的桥梁,传递外界信息给脑,然后调控机体的行为反应9。年龄对脊髓的影响比较显著,而且脊髓的病变早于脑10。研究发现,随着年龄的增加,脊髓的形态、生理特性均有明显改变,脊髓组织中细胞因子的分泌以及信号通路的转导也发生改变11。衰老的脊髓组织内也有炎症因子分泌的改变,但是其
11、具体机制等方面的研究目前较少。载脂蛋白 E(ApoE)是中枢神经系统中主要的载脂蛋白,参与胆固醇的转运及血浆脂蛋白的代谢,主要由星型胶质细胞合成,是生物膜合成必需的脂质,影响神经元的代谢和生长修复,促进突触发生和髓鞘再生,参与神经组织的修复、塑形和保护12。有研究报道,ApoE 与脑卒中、AD、PD 以及脑外伤等疾病都有一定的关系13-14。中枢神经系统损伤后,机体内 ApoE 的表达量在一定时间会有所增加,之后逐渐减少,这说明 ApoE 在中枢神经系统疾病早期发挥积极的作用,促进神经系统修复。脊髓组织中 ApoE 的含量也较丰富,多项研究结果显示 ApoE 与脊髓损伤的修复关系密切15。本课
12、题组之前的研究也证实:与野生型小鼠比较,ApoE 基因敲除小鼠在脊髓损伤之后,神经运动功能恢复较慢16。老年人脊髓损伤或其它脊髓疾病的预后都较青年人缓慢,这是否与 ApoE 基因的多态性或 ApoE 含量改变相关,ApoE 的变化与脊髓组织的炎症反应是否相关?为分析 ApoE 基因与衰老脊髓组织炎症反应的关系,探索脊髓老化的病理生理机制,本研究通过建立自然衰老 C57/BL6 野生型小鼠和 ApoE 基因敲除小鼠模型,通过多种实验手段比较促炎因子和抗炎因子的表达变化,为老龄患者脊髓损伤等疾病的治疗提供新的靶点。1摇 材料与方法1郾 1摇 实验动物及试剂C57BL/6J 小鼠,雄性,8 10 周
13、龄 12 只,体重 25 30 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司;ApoE-/-小鼠,雄性,6 8 周龄 12 只,体重25 30 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠饲养于锦州医科大学实验动物中心,动物饲养环境 SPF 级,自由食水,12 h/12 h 明暗光照周期,室温保持在 22 益 25 益。C57BL/6J 小鼠和 ApoE-/-小鼠饲养至 16 18 月龄后取材。本研究过程的所有动物实验操作符合锦州医科大学动物伦理学的标准和要求。IL-6、IL-10 抗体(购自 ab鄄cam),SP9000 免疫组化染色试剂盒(购自北京中杉金桥生物公司);DAB 显色剂(购自碧云
14、天生物公司);IL-10 和 IL-1茁 ELISA 检测试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司);TNF 和 Arg-1 基因PCR 实验引物(购自鼎国公司)。1郾 2摇 脊髓组织取材及标本制备随机选取 16 18 月龄 C57BL/6J 和 ApoE-/-小鼠各 4 只,配置 3%戊巴比妥钠溶液,按照 40 mg/kg 剂量腹腔注射麻醉小鼠,固定小鼠四肢,剪去皮肤,沿胸骨柄剪开,暴露心脏,用预冷的 4%多聚甲醛心脏灌流固定,灌注成功后,冰上分离取出完整脊髓,置于 4%多聚甲醛溶液中固定 48 h 以上。样本流水冲洗 3 h 以上,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,制备 5 滋m 厚的切片,用
15、于免疫组织化学染色。另取 C57BL/6J 和 ApoE-/-小鼠各 8 只,麻醉后快速剥离取出脊髓组织,置于离心管中,冻存于-80 益,用于 ELISA 和 RT-qPCR 实验。1郾 3摇 免疫组织化学染色脊髓组织石蜡切片,常规脱蜡至水,3%H2O2室温封闭 10 min 去除内源性过氧化物酶活性,双蒸水清洗 3 次,加热柠檬酸钠抗原修复液,温度达到40 益时放入切片,高压修复2 min,室温自然冷却,PBS 清洗 5 min,清洗 3 次。滴加山羊血清封闭液,室温静置 10 min,甩掉封闭液,滴加一抗(IL-6 1 颐 500;IL-10 1 颐 500),4 益 放置(16 20)h
16、。切片回温后,PBS 清洗切片 5 min,清洗 3次,滴加多聚物,室温孵育 15 min,PBS 清洗,滴加二抗,室温孵育 15 min,PBS 清洗。滴加 DAB显色液,随时观察,双蒸水终止显色,苏木素染色细胞核 3 5 min,1%盐酸酒精分色,流水冲洗 10min,脱水,透明,中性树胶封片。显微镜下观察拍照,应用 Image J 软件分析灰度值。1郾 4摇 酶联免疫吸附法(ELISA)取-80 益冻存的脊髓组织样品,随机选取 6 只野生型小鼠和 6 只 ApoE-/-小鼠的脊髓样本。应用ELISA 试剂盒检测 IL-1茁 和 IL-10 的含量。96 孔板设定标准孔、空白孔和样本孔,分
17、别加入标准品、标准品&样品稀释液和样本。在 37 益孵育 90min 后。加入生物素化抗体工作液,37 益孵育1 h,81锦州医科大学学报摇 2023 年 8 月,44(4)清洗 3 次。加入酶结合工作液,37 益孵育 30 min,清洗 5 次。加入底物溶液(TMB),37 益避光孵育15 min 左右,标准孔出现明显梯度时加入终止液终止反应。应用酶标仪器在 450 nm 波长处测量吸光度(OD 值),从标准曲线计算最终样品中的目标蛋白含量。1郾 5摇 定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR)取冻存的脊髓组织,野生型小鼠和 ApoE-/-小鼠各随机选取 6 只小鼠的脊髓组织样本。加入 TR鄄I
18、zol 试剂,剪碎打匀组织,室温孵育 5 min。加入氯仿,剧烈摇动 30 s,室温 3 min。12 000 g,4 益离心 15 min。吸取上层无色水相,加入等体积异丙醇,-20 益离心 30 min。离心后弃上清液,加入 75%乙醇振荡,离心,弃上清液,室温干燥 10min。沉淀溶于 DEPC 水,测 OD260 值,计算浓度与纯度。用 5 滋g 总 RNA 逆转录合成 cDNA。应用SYBR-Green 进行 PCR 反应,95 毅C 扩增2 min,95益、15 s,60 益、45 s,40 个循环,将靶基因的相对表达水平与核糖体蛋白 S18(RPS18)的相对表达水平进行标准化,
19、并用(1+e)-驻驻Ct法将实验组的靶基因与对照组的相应靶基因进行对比,PCR 反应引物,见表 1。1郾 6摇 统计学方法使用 SPSS 19郾 0 软件对实验结果进行统计学分析,数据用均数依标准差表示,应用 ANOVA 检验和 t 检验进行组间差异比较,以 P0郾 05 为差异有统计学意义。表 1摇 PCR 反应引物基因名称上游引物下游引物TNFGCCGATTTGCCACTTCATACGGACTCCGTGATGTCTAAGTACArg-1GAACACGGCAGTGGCTTTAACTGCTTAGCTCTGTCTGCTTTGCRPS18AGGATGTGAAGGATGGGAAGTTCTTCAGCC
20、TCTCCAGGTC2摇 结摇 摇 果2郾 1摇 免疫组织化学染色结果两组老年小鼠脊髓组织的神经元及胶质细胞的胞质中均可以见到 IL-6 和 IL-10 的阳性表达,阳性反应产物呈棕褐色。与野生型老年小鼠比较,ApoE基因敲除老年小鼠,促炎因子 IL-6 的表达增加明显,而抗炎因子 IL-10 的表达减少,见图1 2。IL-6 阳性产物呈棕褐色颗粒状,表达于胞质中;WT:野生型老年小鼠;ApoE-/-:ApoE 基因敲除老年小鼠。图 1摇 两组小鼠脊髓组织 IL-6 免疫组织化学染色结果(上图 200伊,下图 400伊)IL-10 阳性产物呈棕褐色颗粒状,表达于胞质中 WT:野生型老年小鼠;A
21、poE-/-:ApoE 基因敲除老年小鼠。图 2摇 两组小鼠脊髓组织 IL-10 免疫组织化学染色结果(上图 200伊,下图 400伊)2郾 2摇 脊髓组织中 IL-1茁 和 IL-10 含量的 ELISA 检测结果ELISA 是免疫诊断中的新技术,具有简单、快速、稳定等特点,可以检测整个脊髓组织中某种炎症因子的含量。本研究应用双抗体夹心法试剂盒检测小鼠脊髓组织中 IL-1茁 和 IL-10 两种细胞因子的含量。结果显示:野生型老年小鼠脊髓组织蛋白提取液中 IL-1茁 和 IL-10 均有表达,与野生型老91穆天驰,等:ApoE 基因对老年小鼠脊髓组织炎症因子表达的影响年小鼠比较,ApoE 基
22、因敲除老年小鼠脊髓组织中促炎因子 IL-1茁 的含量增加明显,而抗炎因子 IL-10 的含量则显著减少,见图 3 4、表 2。ApoE-/-组与 WT 组比较,*P0郾 001。图 3摇 两组小鼠脊髓组织 IL-1茁 含量 ELISA 检测结果ApoE-/-组与 WT 组比较,*P0郾 001。图 4摇 两组小鼠脊髓组织 IL-10 含量 ELISA 检测结果表 2摇 两组小鼠脊髓组织 IL-1茁和 IL-10 含量 ELISA检测结果比较(軃x依s)分组蛋白名称IL-1茁IL-10WTApoE-/-421郾 9依91郾 20731郾 0依87郾 79*556郾 9依51郾 23397郾 6依
23、61郾 88*摇 注:ApoE-/-组与 WT 组比较,*P0郾 001。2郾 3摇 RT-qPCR 结果摇 摇 为进一步明确 ApoE 基因对衰老脊髓组织炎症因子分泌的影响,本研究采用 RT-qPCR 技术检测脊髓组织中 TNF 和 Arg-1 mRNA 的表达。RT-qPCR 结果显示:与野生型老年小鼠比较,ApoE 基因敲除老年小鼠脊髓组织中 TNF mRNA 的表达增加明显,而 Arg-1mRNA 的表达明显减少。说明ApoE 基因敲除增加脊髓组织促炎因子基因表达,减少抗炎因子基因表达,见图 5 6、表 3。ApoE-/-组与 WT 组比较,*P0郾 05。图 5摇 两组小鼠脊髓组织
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- ApoE 基因 老年 小鼠 脊髓 组织 炎症 因子 表达 影响
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。