贝莱斯芽孢杆菌HN-2次生代谢产物处理下黄单胞菌%28Xoo%29的转录组分析.pdf
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1、文章编号:1674 7054(2023)04 0389 10贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 次生代谢产物处理下黄单胞菌(Xoo)的转录组分析高雪,劳广术,谭峥,方渝凯,刘文波,靳鹏飞,缪卫国(海南大学 植物保护学院/热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室,海口 570228)摘要:为探究贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezens)菌株 HN-2 正丁醇提取物对黄单胞菌(Xoo)的抑菌机制,分别用菌株 HN-2 正丁醇提取物和杆菌肽处理 12 h 后的 Xoo 进行转录组测序(RNA-seq)并利用 GO 数据库和KEGG 数据库对转录组数据进行分析。转录组数据分析结果表明,HN-2 正丁醇
2、提取物和杆菌肽处理后Xoo 菌内均有大量差异表达基因(DEGs),HN-2 处理组共得到 1 512 个差异表达基因,其中上调表达基因871 个,下调表达基因 641 个;GO 富集分析发现 HN-2 正丁醇提取物处理后,Xoo 的差异表达基因主要聚类在代谢过程、细胞组分、大分子复合物、催化活性等方面;KEGG 聚类分析发现 HN-2 正丁醇提取物处理后,核糖体途径所包含的差异表达基因数目最多,差异最显著,其余主要参与的代谢途径有淀粉和蔗糖代谢、苯甲酸酯降解、甘油磷脂降解、细菌趋化性等。结果表明,HN-2 正丁醇提取物主要影响 Xoo 的核糖体途径、淀粉和蔗糖代谢途径、细菌趋化性途径。关键词:
3、贝莱斯芽孢杆菌;黄单胞菌;抑菌活性;表达差异基因中图分类号:Q 78 文献标志码:A引用格式:高雪,劳广术,谭峥,等.贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 次生代谢产物处理下黄单胞菌(Xoo)的转录组分析J.热带生物学报,2023,14(4):389398.DOI:10.15886/ki.rdswxb.2023.04.006 水稻(Oryza sativa L.)白叶枯病是一种由黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的细菌性病害,在各水稻种植区均有发生,并且危害严重,是我国水稻重要病害之一1。发病后叶片产生黄绿色病斑,最终变黄枯死,每年造成水稻产量减少 20%30
4、%,严重时减产 50%,甚至绝收2。虽然目前有一些抗病品种,但是抗病性易随着时间而逐渐减弱。防治白叶枯病的化学药剂有铜制剂、有机磷、有机氮、噻唑类等3 8,这些药剂大部分在田间使用时易使病菌产生抗药性,对环境有影响。如噻枯唑在田间已有明显抗性9;5-氧吩嗪类药剂持效期短,病害易复发,水稻白叶枯病的防治形势依旧严峻。生物防治是一种高效且对环境友好的策略,可以用于植物病害的治理10。生防芽孢杆菌是目前应用最广泛的生防细菌之一,对各种真菌、细菌和病毒的侵染造成的植物病害,都能够有效地抑制11,并且还具有良好的促进植物增产、诱导植物抗病的能力。目前,越来越多生防芽孢杆菌被开发成农药,得到商品化产品12
5、。芽孢杆菌能够产生次级代谢物质来抑制和杀灭有害微生物,这些活性代谢物质主要包括酶类、细菌素类,以及受到关注最多的脂肽类等13 14,如地衣形芽孢杆菌(Bacillus licheni formus)可以发酵产生一种具有良好的抑制细菌活性的脂肽类物质杆菌肽。杆菌肽目前作为一种多肽类抗生素已经被广泛地应 收稿日期:2022 04 28修回日期:2022 06 18基金项目:海南省基础与应用基础研究计划(自然科学领域)高层次人才项目(2019RC163);海南省青年科技英才创新计划(QCXM201903);国家自然基金地区科学基金项目(31960552);海南省基础与应用基础研究计划(自然科学领域)
6、高层次人才项目(322RC591);海南大学校内科研启动经费项目 KYQD(ZR)1842第一作者:高雪(1997),女,海南大学植物保护学院 2019 级硕士研究生.E-mail:通信作者:靳鹏飞(1987),男,副教授.研究方向:微生物生物防治研究.E-mail:;缪卫国(1969),男,教授.研究方向:植物病理学研究.E-mail:M 第 14 卷 第 4 期热 带 生 物 学 报Vol.14 No.42023 年 7 月JOURNALOFTROPICALBIOLOGYJul.2023用于医学15。有研究16表明芽胞杆菌属(Bacillusspp.)能够产生具有较强拮抗 Xoo 的脂肽类
7、活性物质。Bacillus strain D13 可以产生一种挥发性物质,该挥发性物质具有较好的抑制 Xoo 的活性17。解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens FZB42 分泌的抗生素类物质 bacilysin 和 difficidin 对水稻黄单胞菌 Xoo 具有显著的抑菌作用18。笔者所在实验室的研究19发现,贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 产生的 C15surfactin A 对 Xoo 具有较强抗菌活性,能抑制 Xoo 的生长,并通过介导抗氧化剂相关酶的活性而引发过敏性反应,有效地诱导水稻对 Xoo 的抗性。虽然目前已经有一些关于芽孢杆菌抑制Xoo 的研究,然
8、而贝莱斯芽孢杆菌抑制 Xoo 的作用机制尚不明确。因此,本研究以 HN-2 菌株发酵液正丁醇提取物处理 12 h 后的 Xoo 为研究对象,进行转录组测序和分析,拟求得 Xoo 应对 HN-2 抑菌活性成分的代谢途径基因表达差异图谱,为后续进一步揭示贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 的抑植物病原细菌 Xoo 机理提供前期数据和理论参考。1材料与方法 1.1实验材料及样品准备 贝莱斯芽孢杆菌HN-2 为本实验室从土壤中分离保存,稻黄单胞菌Xoo(PXO99A)由笔者所在的实验室提供保存。杆菌肽(98%,分析纯)购自日本和光纯药株式会社有限公司。(1)HN-2 发酵活性物质的提取:接种HN-2 菌株于 L
9、B 培养基 37,180 rmin1振荡培养 48 h 后,离心 10 min 弃去菌体,得到 HN-2 发酵液上清液。等比例并充分混合正丁醇和 HN-2 发酵上清液后,室温下静置过夜,用分液漏斗分离有机相得到上层正丁醇萃取液。在 67 下将得到的上层正丁醇萃取液进行旋转蒸发浓缩,蒸发浓缩后的沉淀用少量甲醇充分溶解并进行冷冻干燥12 h,得到 HN-2 抑菌活性成分粉末粗提物,80 保存备用,使用前称取 0.01 g 粗提物加入 1 mL的超纯水充分溶解,并用一次性细菌过滤器过滤。(2)样品处理:从平板上挑取黄单胞菌的单菌落接种至 PSA 液体培养基中,共接种 9 瓶,在 28,180 rmi
10、n1振荡培养至生长对数期(OD600=0.300)。此时向第一组菌液中加入 HN-2 正丁醇提取物至终浓度为 MIC50值(2.36 mgmL1),第二组菌液加入杆菌肽至终浓度为 MIC50值(11.96mgmL1),第三组菌液不做任何处理,继续振荡培养 12 h,3 次重复,将 HN-2 正丁醇提取物处理 12 h的样品命名为“Xoo-HN-2”,杆菌肽处理 12 h 的样品命名为“Xoo-G”,对照组命名为“Xoo-CK”。1.2转录组测序和生物信息学分析 样品Xoo 总 RNA 的提取使用天根 RNA 提取试剂盒,并将提取的 RNA 送到广州基地奥生物科技公司进行质检,以保证所有样品最终
11、都获得高质量的总 RNA。利用 Illumina HiSeq X Ten 测序平台(Illumina Inc,CA,USA)进行转录组建库测序及分析。步骤:(1)去除核糖体 RNA;(2)RNA 随机打断为 200 nt 片段;(3)加入六碱基随机引物、缓冲液、dNTPs、RNase H 和 DNA 聚 合 酶 合 成cDNA 第一条链;(4)使用 dUTP 代替 dTTP,合成cDNA 第二条链;(5)末端修复 3、5端,加 A 尾,连接接头;(6)使用 UNG 酶降解 cDNA 第二条链,以保留 RNA 方向信息;(7)PCR 扩增产生 DNA 的聚集片段,完成文库制备;(8)利用 Ill
12、umina 测序平台对构建好的文库进行双末端测序,将所得数据过滤后用于后续的转录组分析20。1.3差异基因表达分析 对样品中的 Mappedreads 数目和转录本长度进行归一化处理,使用RAEM 软件,采用 FPKM(Fragments Per Kilobaseof transcript per Million fragments mapped)作为衡量转录本的指标21,采用皮尔森相关系数(PearsonCorrelation Coefficient,PCC)法检测重复样品之间的相关性,并利用 DESeq R 包分析不同处理后 Xoo的差异表达基因。为进一步控制该过程中的错误发现率(fals
13、e discovery rate,FDR),使用 edgeR22软件对不同样品间差异表达基因定量分析。采用 FDR(false discovery rate)与 log2(FoldChange)(log2FC)来作为差异表达基因筛选的关键指标,筛选条件为 FDR1。1.4基因功能富集分析 将筛选得到的差异基因进行 GO 富集分析,用特定的 GO terms 给差异表达基因的表达模式注释;利用 KEGG 数据库找出在差异表达基因中,富集最显著的前 20 条代谢通路画图展示。2结果与分析 2.1RNA-seq 数据质控结果 转录组原始数据质控过滤前后的黄单胞菌 Xoo(PXO99A)转录组390热
14、 带 生 物 学 报2023 年测序数据统计情况见表 1。由表 1 可见,CK 组、HN-2 组、杆菌肽组的样本通过测序获得的原始碱基数(Raw Data)分别为3 669 218 400、3 356 470 200和 5 089 554 000。3 组原始序列经过质控后获得的 Clean data 分别为 3 490 096 417、3 232 110 301和 502 049 243。过滤后的总碱基数占原始序列的比例分别为 98.55%、98.53%和 97.32%,Q20 分别为98.03%、98.03%和97.32%,Q30 分别为94.89%、94.89%和 92.0%,GC 含量分
15、别为 61.61%、61.06%和 60.93%,这些结果表明过滤后所获得的序列质量较好,可靠性高,Clean reads 可以用于后续的生物信息学分析。表1Reads 过滤前后碱基信息统计结果样品碱基信息样本名Xoo-CKXoo-HN-2Xoo-G过滤前Raw data/bp3 669 218 4003 356 470 2005 089 554 000Q20/%3 596 827 023(98.03%)3 293 722 095(98.03%)4 948 281 317(97.22%)Q30/%3 481 614 115(94.89%)3 188 133 592(94.98%)4 674 4
16、17 659(91.84%)N/%5 182(0.0%)4 797(0.0%)41 169(0.0%)GC/%2 260 575 649(61.61%)2 049 438 853(61.06%)3 095 193 280(60.82%)Clean data/bp3 490 096 4173 232 110 3015 020 492 431过滤后Q20/%3 439 489 923(98.55%)3 184 723 700(98.53%)4 886 066 551(97.32%)Q30/%3 336 281 653(95.59%)3 087 417 164(95.52%)4 618 772 86
17、5(92.0%)N/%4 928(0.0%)4 619(0.0%)40 606(0.0%)GC/%2 158 506 542(61.85%)1 978 705 819(61.22%)3 059 001 170(60.93%)注:Raw data:原始下机数据碱基总数(bp);Clean data:过滤低质量reads后获得的有效数据碱基总数及占raw data的百分比;Q20(%):测序碱基正确率达99%以上的碱基数及占过滤前/后碱基总数的比例;Q30(%):测序碱基正确率99.9%以上的碱基数占过滤前/后碱基总数的比例;N(%):N碱基的数目及百分比;GC(%):GC碱基数目及百分比。2.2
18、样品重复性相关性检测 本实验共有 3 个样本(CK 组,HN-2 组,G 组),通过主成分分析(PCA)可以评价样品重复性、找出离群样品、评估组间差异等。使用 R 语言获得各个样本在第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)2 个综合变量中的数值大小,作二维坐标图。如图 1 所示,PC1 可以解释原所有基因的表达量总体方差的 71.3%,PC2 可以解释原所有基因的表达量总体方差的28.7%,PC1 与 PC2 共可以解释总体方差的 100%,表明样品重复性高,组间差异小。通过 R 计算3 个样本及每个样本的 3 个生物学重复间的皮尔森相关系数(Pearson Correlation Coef
19、ficient,PCC)。如图 2 所示,可以看到每个样本的 3 个生物学重复之间的相关系数呈对角线分布,表明测序数据具有较强的重复性和较高的可信度,可以用于后续的差异表达分析。2.3差异基因表达统计分析 如图 3 所示,HN-2组和杆菌肽组相比,共筛选到 1 226 个差异基因,其中有 612 个基因在 HN-2 组中上调,614 个基因 第一主成分(71.3%)样品Xoo-GPCAXoo-GXoo-CKXoo-CKXoo-HN-2Xoo-HN-225 00020 00010 000010 00020 00030 000025 00050 000第二主成分(28.7%)图 1 主成分分析 P
20、CA 图坐标轴标签括号中的数值代表主成分解释总体方差的百分比。第 4 期高 雪等:贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 次生代谢产物处理下黄单胞菌(Xoo)的转录组分析391在 HN-2 组中下调。杆菌肽组和 CK 组相比,共筛选到 1 146 个差异基因,其中,有 730 个基因在杆菌肽组中上调,416 个基因在杆菌肽组中下调。HN-2 组和 CK 组相比,共筛选到 1 512 个差异基因,其中有 871 个基因在 HN-2 组中上调,641 个基因在 HN-2 组中下调。此外无论是加入 HN-2还是杆菌肽,上调表达基因都多于下调表达基因,并且 HN-2 组表达差异的表达基因总数多于杆菌肽组,说明经 H
21、N-2 处理后,Xoo 有更多的基因被调控来参与到对 HN-2 处理后的适应过程中。本研究重点关注的是不同处理之间的差异,因此对两两比较的差异基因绘制了韦恩图(图 4)。图 4可见,与杆菌肽组相比,HN-2 组有 275 个差异表达基因为其特有,是 HN-2 提取物与杆菌肽抑菌机制不同导致,这些 HN-2 组特有的差异基因有助于进一步研究 HN-2 对 Xoo 的作用机理。因此,在后续对于 HN-2 组的差异表达基因定性分析时,这275 个差异基因将作为重点研究分析对象。202259213552275472202Xoo-CK-vs-Xoo-GXoo-CK-vs-Xoo-HN-2Xoo-G-vs
22、-Xoo-HN-2图 4 差异表达基因韦恩图 2.4GO 功能分析和 KEGG 通路分析 2.4.1 差异表达基因差异表达基因的的 G GO O 统计统计 从图 57 中可以看出,在生物过程中,HN-2 组的差异基因主要集中在单体有机体过程、代谢过程和细胞进程等功能条目中,其中,单体有机体过程包含 33 个差异基因,代谢过程包含 35 个差异基因;细胞进程中包含 20 个差异基因,在细胞组分中,HN-2 组的差异基因主要富集在细胞、细胞成分和大分子复合物等功能条目中,其中,细胞核细胞成分均包含 17 个差异基因;在分子功能中,HN-2 组的差异基因主要富集在结合、催化活性和结构分子活性等功能条
23、目中,其中,结合过程包含 26 个差异基因,催化活性包含 24 个差异基因,结构分子活性包含 9 个差异基因。此外,可以看到虽然 HN-2 组和杆菌肽组的富集结果大致相似,但是 HN-2 组的差异基因数目(共 148 个差异基因)显著多于杆菌肽组的差异基因数目(共 117 个差异基因)。2.4.2 转录组数据转录组数据的的 KEGKEGG G 通路分析通路分析 对杆菌肽与 HN-2 正丁醇提取物处理后,菌株 Xoo 的代谢通路显著性富集分析,选取了富集最为显著的20 条代谢通路画图(图 810)展示。图 8 表明,与对照组相比,杆菌肽处理后,富集程度较高、富集较为显著且包含差异基因数目较多的途
24、径有鞭毛组装、核糖体途径、细菌趋化性和双组分系统氧化磷酸化等;图 9 表明,与对照组相比,HN-2 正丁醇提取物处理后,核糖体途径所包含的差异表达基因富集的程度最高、富集最显著且差异表达基因的数目最多,其余主要参与的代谢途径有淀粉和 1.000 0 1.000 01.000 00.572 10.568 0 0.578 30.722 4 0.739 30.736 11.000 0 1.000 01.000 00.569 90.577 4 0.593 40.741 1 0.726 00.729 71.000 0 1.000 01.000 00.579 00.579 2 0.579 30.719 1
25、 0.705 50.714 80.572 1 0.569 90.579 01.000 01.000 0 1.000 00.660 0 0.671 00.674 00.568 0 0.577 40.579 21.000 01.000 0 1.000 00.692 1 0.681 30.683 10.578 3 0.593 40.579 31.000 01.000 0 1.000 00.689 4 0.689 70.690 40.722 4 0.741 10.719 10.660 50.692 1 0.689 41.000 0 1.000 01.000 00.739 3 0.726 00.705
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