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白细胞介素-6在小鼠肌肉损伤修复中的机制陶 颖，赵同金，王 娟复旦大学 代谢与整合生物学研究院，上海 200438收稿日期：2023-05-06基金项目：国家自然科学基金重点资助项目（3223000129）；青年科学基金资助项目（32100539）作者简介：王 娟，女，青年副研究员，博士，研究方向为代谢生物学，e-mail:wangjuan_，通信作者摘要：目的目的 观察白细胞介素-6基因敲除小鼠与野生型小鼠肌肉损伤后的恢复进程，探究白细胞介素-6在肌肉损伤修复中的机制。方法方法 以8周龄野生型和白细胞介素-6基因敲除小鼠为材料，采用注射氯化钡的方式构建肌肉损伤及修复模型，在损伤过后的不同时间点检测血浆和组织中的脂质含量，并观察肌纤维的形态。结果结果 在野生型和白细胞介素-6基因敲除小鼠中，肌肉损伤修复过程中标志性事件的发生发展无差异。结论结论 白细胞介素-6在调节肌肉稳态和肌卫星细胞增殖中发挥了重要作用，但是本研究表明它在肌肉损伤修复中并不是必需的。关键词：白细胞介素-6；肌肉损伤修复；肌卫星细胞；肌细胞因子中图分类号：Q71文献标识码：Adoi：10.13885/j.issn.1000-2812.2023.06.004Mechanistic study of interleukin-6 in muscleregeneration in mice Tao Ying,Zhao Tongjin,Wang JuanInstitute of Metabolism and Integrative Biology,Fudan University,Shanghai 200438,ChinaAbstract：Objective To explore the mechanism of interleukin-6 in muscle regeneration,we observed the recovery process of wild-type and interleukin-6-knockout mice after muscle injury.Methods In this study,8-week-old wild-type and interleukin-6-knockout mice were chosen to construct muscle injury and repair models by injecting barium chloride.At different time points after injury,we measured the lipid content in plasma and tissues and observed the morphology of muscle fibers.Results The results showed that there was no significant difference in the development of landmark events during muscle injury repair between wild-type and interleukin-6-knockout mice.Conclusions Interleukin-6 plays an important role in the muscle homeostasis regulation and muscle satellite cells proliferation,but the result suggests that interleukin-6 may not be required in the process of muscle regeneration.Keywords:interleukin-6;muscle injury repair;muscle satellite cell;myokine文章编号：1000-2812(2023)06-0020-06第49卷 第6期2023年6月兰州大学学报（医 学 版）Journal of Lanzhou University（Medical Sciences）Vol.49 No.6June.2023骨骼肌是维持生物体生命活动的重要组织，由肌原纤维相互包裹形成肌束，并通过肌膜固定保持一定的形态。外力或生物、化学因素的作用可能导致肌肉损伤，肌肉损伤在一定程度上通过肌卫星细胞的增殖和分化被修复1。近几十年来，肌肉疲劳和肌肉损伤是影响运动员有氧竞技能力的主要原因，肌肉损伤过后的愈合也成了运动生理学的研究重点。白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）是趋化因子家族里一类分子量为 2128 kDa 的糖蛋白，它是第1个被发现分泌到血液中以响应肌肉收缩的肌细胞因子2。炎症细胞浸润损伤的肌肉后，不仅自身会分泌 IL-6，而且还会分泌其他促炎细胞因子，促进肌卫星细胞进一步表达 IL-6，从而增加局部微环境中 IL-6 的浓度3-4。与正常的肌纤维相比，发生急性损伤的肌纤维中IL-6的浓度上升至原先的100倍5。因此，IL-6被认为在肌肉损伤修复过程中具有重要意义6。除了骨骼肌之外，IL-6在肝脏、脂肪、小肠和胰腺等器官中都发挥了内分泌和代谢功能。研究7表明，在肌肉损伤后，IL-6可以促进肝脏合成糖原，并且增加小肠上皮细胞对葡萄糖的吸收，这些作用进一步提高了受损肌肉细胞的能量供应。在脂肪细胞中，IL-6作为脂质代谢平衡的关键调节器，能够促进脂肪分解并产生游离脂肪酸。van Hall等8的研究表明，给成年健康男性输注重组人源IL-6后，实验者血浆中脂肪酸的浓度将持续增加，一直维持至输注结束后的3 h。同样，在给大鼠灌注IL-6后，其血浆中游离脂肪酸和甘油三酯的浓度也会以剂量依赖的方式迅速上升9。这提示IL-6能够作为脂肪分解因子和调节因子给受损肌肉提供能量来源。但是，长期暴露于高浓度的 IL-6 可能会加速衰老和疾病中肌肉萎缩进程，高剂量IL-6还显著抑制了成肌细胞C2C12中晚期分化标记物的表达10-11。IL-6的浓度可能是决定其在肌肉损伤修复中发挥促进或抑制作用的决定性因素，而探究IL-6在肌肉损伤修复中的具体机制，是发挥IL-6在肌肉再生和修复中的潜在价值的基础12-14。因此，本研究观察Il6-/-小鼠与野生型小鼠在肌肉损伤后恢复进程的区别，以探究生理状态下分泌的IL-6是否会对肌肉损伤修复产生影响。1材料与方法材料与方法1.1 实验动物实验动物选择 8 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2019-0002，使用许可证号：SYXK（沪）2020-0032，体重（25 3）g。本研究已通过复旦大学伦理委员会审核批准（批件文号：2022JS代谢整合院-014）。饲育条件：动物房温度1822 C，相对湿度50%60%，日温差不超过3 C。动物房外周做隔音处理，正常环境噪声小于80 dB，24 h循环通风换气，光周期的控制为12 h（明）/12 h（暗）。小鼠的饲料为全价营养颗粒饲料，每周添料1次，小鼠的饮水为灭菌处理的生活饮水，每周换水1次。1.2 实验方法1.2.1 构建小鼠肌肉损伤修复模型根据小鼠体重准备适量的麻醉剂，腹腔注射，等待1520 min，检查小鼠失去角膜反射后可以开始实验。用酒精棉擦拭小鼠后肢，找准比目鱼肌的位置，用32 G的针头在右腿分7次散点状注射生理盐水，共2 L，在左腿同样位置以同样方式注射用生理盐水配制的1.2%氯化钡。在小鼠麻醉的时间内，注意观察小鼠的体温和呼吸状态，等小鼠恢复活动后再送回动物房。注射结束后 0、84、132、168 h，对小鼠眼眶取血并断颈处死。解剖后，用镊子分离出肌肉组织放在10%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）中固定。1.2.2 石蜡切片 解剖小鼠后分离出比目鱼肌，置于10%PFA里固定至少72 h。固定结束后，把组织放进脱水盒中，按以下步骤逐级脱水：在50%乙醇中处理过夜，在 75%乙醇中处理 2 h，在 85%乙醇中处理2 h，在95%乙醇中处理1 h，在100%乙醇中处理1 h。脱水处理结束后，取出组织置于二甲苯中处理 1 h，在融化的石蜡中静置过夜，第 2 天用石蜡包埋。包埋时使肌纤维的方向尽量垂直于包埋盒，等石蜡冷却凝固后，把石蜡组织块固定在切片机上切片。将切片机的切片厚度调整至 5 mm，匀速切片，注意在显微镜下观察肌肉组织横截面形态是否保持完整。在石蜡组织块的不同深度各切3张，用镊子取下组织切片放进37 C 水浴锅展片，用黏附型载玻片取出，在42 C过夜烘干。1.2.3 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法在HE染色前，把组织切片在55 C烘箱放置1 h，将其放入二甲苯溶液中脱蜡，重复脱蜡步骤3次，每次 10 min。按照 100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇的顺序逐级复水，每次5 min，取出后水洗2次。染色时，先把组织切片放在苏木精溶液中染色5 min，然后水洗2次，每次5 min。再把切片放在1%盐酸乙醇中分化30 s，之后迅速放在氨水溶液反蓝15 s，然后水洗2次，每次5 min。最后把组织切片放进伊红溶液染色15 min，并依次在95%乙醇和100%乙醇中脱水5 min。乙醇脱第6期陶 颖，等：白细胞介素-6在小鼠肌肉损伤修复中的机制21水结束后，用二甲苯对组织切片脱水透明，重复该步骤2次，每次5 min，取出后稍稍晾干，用中性树脂封片。1.2.4 免疫荧光染色 按照 HE染色中脱蜡复水的步骤处理组织切片，把处理好的组织切片放入煮沸的柠檬酸抗原修复液（浓度为10 mmolL-1，pH为5.0），在微波炉中先高火处理5 min，再中火处理5 min，重复该步骤3次。把组织切片浸泡在抗原修复液中自然冷却，然后用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗组织切片，重复3次，每次5 min。封闭时，用滤纸吸干玻片上多余的 PBS缓冲液，在组织切片上滴加5%牛血清白蛋白或山羊血清（与二抗同源），在湿润的环境中孵育2 h。吸走封闭液，用滤纸吸干组织切片周围多余的液体，并在组织切片上滴加适量的一抗，在4 C孵育过夜。吸走一抗，用PBS缓冲液冲洗组织切片，重复3次，每次 5 min。用滤纸吸干玻片上多余的 PBS 缓冲液，在切片上滴加适量的荧光二抗，在室温避光孵育1 h。吸走二抗，用PBS缓冲液冲洗组织切片，重复3次，每次5 min。最后用滤纸吸干玻片上多余的PBS缓冲液，用防淬灭剂封片。1.2.5 测定小鼠肌肉组织中的脂质在玻璃离心管中加入4 mL氯仿-甲醇混合液，其中V氯仿 V甲醇=2 1。从液氮中取出冻存的小鼠组织，切取约0.1 g组织块放入该玻璃离心管中。在冰上用组织匀浆仪完全破碎组织，并加入800 L生理盐水。剧烈震荡玻璃离心管1 min后，在4 C，以3 000 r/min离心20 min。离心后，取下层的有机相，氮吹浓缩，并用200 L氯仿-甲醇混合液复溶。在深孔板中加入10 L Triton X-100和氯仿的混合液，其中 VTriton X-100V氯仿=2 1。预估组织中脂质浓度范围，确认好合适的标准曲线梯度后，在深孔板中分别加入200 L样品溶液和不同梯度的标准样溶液，反复吹吸使之混合均匀。把深孔板放进37 C烘箱中过夜烘干，在有机相完全挥发后，加入300 L显色剂孵育15 min，用分光光度仪在600 nm波长测量。1.2.6 统计学分析方法使用SPSS 22.0及R语言4.1.1进行统计分析，并使用 OriginLab 作图。所有数据均采用 t检验，以P 0.05，检验效能1-0.8。2.2 与野生型小鼠相比，Il6-/-小鼠的肌肉损伤修复不受影响为了更直观地观察IL-6对于肌肉损伤修复的影响，本研究还在注射氯化钡后的不同时间点解剖小鼠，并对其肌肉组织进行切片观察。图2A显示的是小鼠比目鱼肌横截面的HE染色结果，其中苏木精为碱性染料，使细胞核呈蓝紫色，伊红为酸性染液，使细胞质呈红色。图2A中0 h的结果显示未受损伤的正常肌纤维的形态特征，可以看到肌纤维是由成肌细胞融合形成的束状合胞体，周围包裹了一层肌膜。肌纤维的横截面呈多边形，直径为3060 m，圆形的细胞核位于肌膜下方。在野生型小鼠和Il6-/-小鼠中，它们肌纤维直径几乎没有差别，肌肉细胞均紧密排列且形态完整。在损伤后84 h，可以看到图中几乎没有完整的肌纤维，大部分肌纤维都在氯化钡的作用下发生了坏死。取而代之的是，图2A中出现了很多直径较小的细胞，根据对其形态的分析，其中一部分是炎症细胞，另一部分则是被激活的肌卫星细胞。在损伤后132 h，除了炎症细胞继续参与肌肉损伤修复之外，肌卫星细胞逐渐分化为直径较小，且细胞核位于中央的肌细胞。在损伤后168 h，有中央核的肌细胞面积明显增大，且浸润在肌肉组织中的炎症细胞大量减少。肌肉损伤修复已进入后期，分化完成的肌细胞将逐渐融合为多核肌纤维。根据肌肉损伤后不同时间点的比目鱼肌切片图，本研究记录了肌肉损伤修复过程中各种标志性事件的发生发展。可以看到肌卫星细胞的增殖分化和肌肉损伤修复的进程在野生型小鼠和Il6-/-小鼠中并无明显差异（图2A）。为了确认以上结果，本研究对小鼠比目鱼肌的组织切片进行了免疫荧光染色。免疫荧光染色结果如图2B所示，其中胚胎肌球蛋白重链（em-bryonic myosin heavy chain，eMyHC）是新生肌纤维标志物，通常位于新生肌肉的细胞质中15；抗肌萎缩蛋白（Dystrophin）是细胞骨架蛋白，通常分布在肌膜下方，它由位于X性染色体上的Dys-trophin基因 DMD 编码，用于指示分化程度成熟的肌纤维。由图2B可以看到损伤后0 h时部分蛋白的定位情况，其中eMyHC在成熟的肌纤维中没A 苏木精-伊红染色结果（代表性区域）B 免疫荧光染色结果（代表性区域）显示为绿色的是抗肌萎缩蛋白，红色的是胚胎肌球蛋白重链，蓝色的是4，6-二脒基-2-苯基吲哚染色的细胞核。图2 野生型小鼠和Il6-/-小鼠比目鱼肌的损伤修复过程有表达，呈阴性反应，Dystrophin染色清晰，正常定位于肌膜下方。而4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）标记的细胞核分布均匀，与HE染色结果相同。损伤后84 h，eMyHC呈阳性的细胞含量明显增多，肌卫星细胞开始增殖分化。同时，Dystrophin呈阴性反应，并且细胞核显著聚集。损伤后132 h，eMyHC和Dystrophin均显示为阳性，Dystrophin不仅定位在细胞膜下方，而且还有一部分定位在细胞质中。损伤后168 h，eMyHC呈阴性反应，肌肉再生基本完成。而阳性的Dystrophin大部分定位于细胞膜下方，逐渐恢复至成熟肌纤维中的定位情况。此外，DAPI标记的细胞核大多位于肌细胞中央，这与HE染色的结果相同。对比上述过程中野生型小鼠和Il6-/-小鼠的差异，可以发现，两者在肌肉损伤修复标志性事件的发生发展上基本一致。第6期陶 颖，等：白细胞介素-6在小鼠肌肉损伤修复中的机制233讨论与展望讨论与展望不规范的锻炼方式和过长时间的重复运动都会导致肌肉疲劳和肌肉损伤。肌肉受到损伤时，肌卫星细胞会被迅速激活，增殖并分化为成肌细胞16-17。在肌肉损伤修复过程中，细胞因子发挥了非常重要的作用，已有研究18表明原位注射重组胰岛素样生长因子-1能够促进肌肉损伤修复。本研究探索了正常生理状态下，肌肉损伤后分泌的另一种细胞因子IL-6是否能够促进肌肉损伤修复。IL-6通常被认为是一种脂解激素，其浓度在运动损伤后显著升高5。研究19表明，服用适量脂肪酸补充剂可以减少损伤导致的肌肉酸痛，帮助恢复肌肉功能。因此，脂肪酸吸收的上调对于肌肉损伤修复过程至关重要。本研究结果显示，在损伤后84 h，小鼠血浆中游离脂肪酸水平明显增加，该过程伴随着肌肉组织中甘油三酯的积累，表明肌肉损伤可能诱导了脂肪组织发生脂解，并将动员的脂肪酸用于肌肉的损伤修复过程。在肌肉损伤修复的后期，肌细胞因子对全身代谢的调节又逐渐恢复至正常水平。相比于野生型小鼠，Il6-/-小鼠肌肉损伤修复过程中标志性事件的发生发展也无明显差异。中央核是再生肌纤维的标志，对于肌肉功能的恢复非常重要。在肌肉发生损伤后，野生型小鼠和Il6-/-小鼠中央核出现的时间点并无差异。此外，无论是正常的肌肉还是损伤修复中的肌肉组织，其 HE 染色和免疫荧光染色的结果也基本一致，说明Il6基因缺失对肌肉发育和损伤修复过程没有产生不良影响，IL-6在肌肉损伤修复过程中并不是必需的。IL-6是一种在调节肌肉稳态和肌卫星细胞增殖中发挥关键作用的肌细胞因子，它能诱导卫星细胞增殖，因此Il6基因缺失的小鼠，体内外卫星细胞增殖均会受损20。这与本研究的结果不一致，可能是由于 IL-6 并不是调控该过程的决定性因子。因为肌细胞因子对全身代谢的调节作用具有重叠性、协同性，所以在Il6-/-小鼠中，可能由其他肌细胞因子发挥了脂肪酸动员和促进脂肪酸吸收的功能。例如细胞因子白细胞介素-17，也被发现在骨骼肌再生修复中发挥重要作用21-22。值得注意的是，IL-6在肌肉损伤后的早期阶段是高度表达的，即IL-6主要在炎症刺激后产生，但在损伤恢复期间，其浓度会逐步降低。同时，研究12表明，只有适当浓度的IL-6才能在肌肉组织中发挥积极作用，并通过自分泌或旁分泌的方式刺激与肌肉生长、肌肉生成和能量代谢调节相关的合成代谢途径。因此，IL-6在肌肉损伤修复过程中的必要性和确切作用仍存在很大争议。目前运动生理学对于IL-6的研究，通常集中于评估剧烈运动后IL-6的浓度变化。IL-6的浓度与由剧烈运动导致的肌肉损伤有关，即运动后血浆中IL-6水平显著高于运动前，因此可以考虑将IL-6的浓度作为评价运动性骨骼肌损伤的指标之一。研究中构建的小鼠模型探究了IL-6在肌肉损伤修复中的具体作用，尽管实验结果与前期猜测并不一致，但是在未来的研究中，我们还会进一步探究运动损伤后大量分泌的IL-6是否发挥了其他的生理功能。参 考 文 献1 Macdonald B,McAleer S,Kelly S,et al.Hamstring reha-bilitation in 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