MiR-144-3p调控E2F8对肾透明细胞癌增殖、凋亡的影响.pdf
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1、收稿日期:基金项目:国家自然科学基金();江西省重点研发计划(B B G L )作者简介:田捷(),男,硕士研究生,主要从事泌尿系肿瘤的研究.通信作者:刘飞,副主任医师,E m a i l:p h i g e r c o m.M i R p调控E F 对肾透明细胞癌增殖、凋亡的影响田捷,余黄琴,周敏,郭龙,刘飞(南昌大学第二附属医院泌尿外科,南昌 ;九江市第一人民医院耳鼻喉科,江西 九江 )摘要:目的研究m i R p对肾透明细胞癌(K I R C)增殖、凋亡的影响并探究其分子机制.方法检测肾小管上皮细胞HK 和K I R C细胞系 O、A CHN、O S R C 中m i R p、E F m
2、R NA和E F 蛋白的表达差异;检测K I R C组织和癌旁组织中m i R p和E F mR NA的表达差异.采用荧光素酶报告实验验证E F mR NA和m i R p的互作关系.分别在 O细胞中过表达m i R p和沉默E F,采用WB检测增殖、凋亡相关蛋白的表达;同时在 O细胞中过表达m i R p和过表达E F,并检测增殖、凋亡相关蛋白的表达;分别采用C C K 法和流式细胞术检测上述转染细胞的增殖和凋亡.结果与HK 细胞相比,K I R C细胞系 O、A CHN、O S R C 中m i R p表达水平较低(P ),与E F 表达水平呈负相关;与癌旁组织相比,K I R C组织中m
3、 i R p表达水平较低(P ),E F 表达水平较高(P).过表达m i R p可以抑制 O细胞增殖并促进其细胞凋亡,沉默E F 也可以达到相同性质的效果.过表达E F 可以逆转过表达m i R p对 O细胞增殖和凋亡的影响.荧光素酶报告实验证实m i R p靶向调控基因E F.结论m i R p可以通过调控基因E F 抑制K I R C肿瘤细胞 O的增殖和促进其细胞凋亡.关键词:m i R p;E F;K I R C;增殖;凋亡中图分类号:R 文献标志码:A文章编号:()D O I:/j c n k i l c s y E f f e c t o fM i R pR e g u l a t
4、 i o no fE F o nP r o l i f e r a t i o na n dA p o p t o s i s i nR e n a lC l e a rC e l lC a r c i n o m aT I A NJ i e,Y UH u a n g q i n,Z H O U M i n,G U OL o n g,L I UF e i(D e p a r t m e n t o fU r o l o g y,t h eS e c o n dA f f i l i a t e dH o s p i t a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i
5、 t y,N a n c h a n g ,C h i n a;D e p a r t m e n t o fO t o l a r y n g o l o g y,J i u j i a n gF i r s tP e o p l esH o s p i t a l,J i u j i a n g ,C h i n a)A B S T R A C T:O b j e c t i v e T oe x p l o r e t h e e f f e c t o fm i R po np r o l i f e r a t i o na n da p o p t o s i s i nk i d
6、 n e yr e n a l c l e a r c e l l c a r c i n o m a(K I R C)a n d i t sm o l e c u l a rm e c h a n i s m s M e t h o d s T h e e x p r e s s i o no fm i R p,E F mR NAa n dE F mR NAp r o t e i nw a sm e a s u r e d i nr e n a l t u b u l a r e p i t h e l i a l c e l l s(HK)a n dK I R Cc e l l l i n
7、 e s(E F O,A CHNa n dO S R C )I na d d i t i o n,t h e e x p r e s s i o no fm i R pa n dE F mR NA w a sm e a s u r e di nK I R Ca n dp a r a c a n c e r o u st i s s u e s T h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nE F mR NAa n dm i R pw a sv e r i f i e db yl u c i f e r a s ea s s a y I n Oc e l l s,
8、m i R pw a so v e r e x p r e s s e d,E F w a s s i l e n c e d,o rb o t hm i R pa n dE F w e r eo v e r e x p r e s s e d T h e e x 实用临床医学 年第 卷第期P r a c t i c a lC l i n i c a lM e d i c i n e,V o l ,N op r e s s i o no fp r o l i f e r a t i o n a n da p o p t o s i s r e l a t e dp r o t e i n sw
9、 a sd e t e c t e db y W e s t e r nb l o t F u r t h e r m o r e,t h ep r o l i f e r a t i o na n da p o p t o s i so ft h et r a n s f e c t e dc e l l sw e r ed e t e c t e db yC C K a s s a ya n df l o wc y t o m e t r y,r e s p e c t i v e l y R e s u l t s T h e e x p r e s s i o no fm i R p
10、i nHK c e l l sw a sh i g h e r t h a nt h a t i n O,A CHNo rO S R C c e l l s(P ),a n d i t se x p r e s s i o nw a sn e g a t i v e l yc o r r e l a t e dw i t ht h ee x p r e s s i o no fE F C o m p a r e dw i t ht h ea d j a c e n tn o r m a l t i s s u e s,m i R pe x p r e s s i o nd e c r e a
11、s e da n dE F e x p r e s s i o ni n c r e a s e di nK I R C(P )B o t hm i R po v e r e x p r e s s i o na n dE F s i l e n c ei n h i b i t e dt h ep r o l i f e r a t i o na n dp r o m o t e dt h ea p o p t o s i si n Oc e l l s O v e r e x p r e s s i o no fE F r e v e r s e dt h ee f f e c to fm
12、 i R po v e r e x p r e s s i o no np r o l i f e r a t i o na n da p o p t o s i so f Oc e l l s L u c i f e r a s er e p o r t e ra s s a yc o n f i r m e dt h a tm i R pd i r e c t l yt a r g e t e dE F g e n e C o n c l u s i o n m i R pc a ni n h i b i tt h ep r o l i f e r a t i o na n dp r o
13、m o t et h ea p o p t o s i s i nK I R C Oc e l l sb yr e g u l a t i n gE F g e n e K E Y WO R D S:m i R p;E F;K I R C;p r o l i f e r a t i o n;a p o p t o s i s肾透明细胞癌(k i d n e yr e n a l c l e a rc e l l c a r c i n o m a,K I R C)是肾细胞癌中最常见的病理分型,其最有效的治疗方法仍是手术干预 .目前,K I R C发生发展的分子机制尚不明确,K I R C相关的
14、基础研究对未来K I R C的临床诊疗水平的进步有重要意义.微小R NA(m i R NA)属于非编码R NA,有些m i R NA可以与目标基因mR NA的 端非翻译区(UT R)结合,以此在转录水平调控基因表 达,m i R NA的 异 常 表 达 与 肿 瘤 的 发 生 发 展 密 切 相关.有研究 表明,许多m i R NA作为肿瘤抑制因子在人类癌症发生中发挥作用,例如m i R p在肺癌、胶质瘤、甲状腺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌中表达水平降低,它可作为肿瘤抑制因子与下游靶基因结合抑制肿瘤的进展.E F转录因子家族的主要功能是对细胞周期的调节,其功能的变化影响着肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁
15、移 .E F 是新发现的E F家族成员,其在K I R C中的生物学功能和临床转化意义尚未被研究,但是T a r g e t S c a n软件预测(h t t p s:/wwwt a r g e t s c a n o r g)E F 存在 与m i R p的结合位点,提示E F 的表达可能受m i R p的调节.本研究旨在探究m i R p和E F 在K I R C中的表达情况,并对其相互作用对K I R C细胞增殖和凋亡调控产生的影响展开研究,以期为K I R C的早期诊断和治疗手段开发提供新的线索.材料与方法实验材料与试剂肾小管上皮细胞系HK 和K I R C细胞系 O,A CHN和O
16、 S R C 均购自武汉普诺赛生命科技有限公司;澳洲胎牛血清(F B S)、T r a n s I n t r oE L转染试剂、T r i z o l总R NA抽提试剂购自北京全式金生物技术有限公司;R PM I 培养基、DMEM培养基、胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司;荧光素酶试剂盒购自南昌聚焦生物科技有限公司;兔源多克隆E F 抗体购自艾博抗(上海)贸易有限公司;C C K 试剂和细胞凋亡检测试剂盒购自广州锐博生物公司.收集南昌大学第二附属医院泌尿外科 年月至 年 月进行的 例腹腔镜下肾癌根治术中获取的肾癌及对应癌旁组织标本,保存于液氮中备用.纳入标准:患者术后病理组织学检查确诊肾透明
17、细胞癌.排除标准:术前接受免疫治疗或其他治疗者.本研究已取得患者的知情同意,并通过医院伦理委员会审核.试验方法细胞培养采用含 F B S、青链霉素的R PM I 培养HK 、O、O S R C 细 胞,采 用 含 F B S、青链霉素的DMEM培养基培养A CHN细胞,并置于、C O的无菌恒温培养箱中.选择处于对数生长期的细胞进行后续实验.实时定量P C R使用T r i z o l提取细胞和组织的总R NA,经逆转录合成c D NA模板后,使用荧光定量P C R试剂盒配置反应体系,在P C R仪中进行扩增,检测m i R p和E F mR NA的表达水平.m i R p实用临床医学 年第 卷
18、第期P r a c t i c a lC l i n i c a lM e d i c i n e,V o l ,N o上引物 G G C C G G C G T A C AG T AT AGAT GA ;下 引 物 G T G C AG G G T C C GAG G T .内 参 基因U 上 引 物:C T C G C T T C G G C AG C A C A ;下 引 物:AA C G C T T C A C GAAT T T G C G T .E F 上引物:C C T GAGAT C C G C AA C AGA GAT ;下 引 物:AGAT G T C AT T AT T C
19、 A C AG C AG G G .内 参 基 因GA P DH上 引 物:AA C G GAT T T G G C C G T AT T G G ;下 引 物:C AT T C T C G G C C T T GA C T G T G .反 应 条 件:s,s,m i n,共 个循环.采用 C t方法计算基因的相对表达水平.蛋白免疫印迹将细胞在R I P A裂解液中裂解,并用B C A法测定蛋白质浓度.将总蛋白样品加入预制的S D S P AG E凝胶,进行常规电泳后并转移到聚偏二氟乙烯(P V D F)上.用脱脂牛奶对膜进行封闭处理h,用T B S T清洗次,下孵育一抗过夜.用T B S
20、T清洗次,每次 m i n,然后在室温下孵育二抗h.用T B S T清洗次,每次 m i n,用化学发光试剂进行荧光显色,用成像系统拍照并分析目标蛋白的相对表达量.细胞转染取对数生长期的 O细胞,用胰酶消化后接种到新孔板中,当细胞生长至汇合度 时,遵循T r a n s I n t r oE L转染试剂说明书将m i n i cm i R p载体及空白对照载体转染至细胞中,分别标 记 为m i R p组 和m i R N C组.转 染 后h,更换为含 F B S的 新鲜培养基.转染 后 h,通过q R T P C R检测转染效率.采用 上 述 转 染 方 法,将 O细 胞 分 为s i E F
21、 组(转染s i R NA的表达载体,沉默E F 表达)、s i N C组(转染空载体,作为s i E F 组的阴性对照)、a n t i m i R p组(转染m i R p表达的干扰载体)、a n t i m i R N C组(转染空载体,作为a n t i m i R p组 的 阴 性 对 照)、m i R pp c D NA E F 组(m i n i cm i R p载 体 与E F 过表 达 载 体 共 转 染)和m i R pp c D NA组(m i n i cm i R p载体与p c D NA空载共转染,作为m i R p p c D NA E F 组的阴性对照).C C
22、K 细胞增殖实验以 个孔的密度将细胞接种于 孔板,每组设置个复孔,并置于、C O的无菌恒温培养箱中培养至细胞汇合度达;分别于生长、h时,在 不 同 的 孔 内 加 入 L的C C K 试剂,h后用酶标仪检测 n m波长处吸光值.流式细胞术检测细胞凋亡以 个孔的密度将细胞种植于孔板,每组设置个复孔,依照P I A P C试剂盒说明书处理细胞.用缓冲液重悬细胞,轻摇至均匀,孵育 m i n.加入适量P I A P C,避光孵育 m i n,上机检测.双荧光素酶报告实验T a r g e t S c a n生物信息学软件预测m i R p与E F 存在结合位点,E F 可能是m i R p的一个靶基
23、因.构建野生型E F(W i l d E F)和突变型E F(M u t a n t E F)的质粒,按照方法将空白对照载体和m i n i cm i R p载体分别与W i l d E F 和M u t a n t E F 共 转 染,并 置 于、C O无菌恒温培养箱中培养 h.收集各组细胞,按照荧光素酶基因报告试剂盒说明书进行检测.统计学方法采用S P S S 和G r a p h P a dP r i s m 软件进行数据分析.组间比较采用t检验.以P 为差异有统计学意义.结果K I R C细胞系和组织中m i R p和E F 的表达情况与肾小管上皮细胞系HK 相比,K I R C细胞系
24、 O、A CHN和O S R C 中m i R p表达水平均较低(P ,图 A),而E F 蛋白和mR NA表达水平均较高(P、P 和P ,图 AB).与癌旁组织相比,肾透明细胞癌组织中m i R p表达水平较低(P ),而E F mR NA表达水平较高(P).见图 C.实用临床医学 年第 卷第期P r a c t i c a lC l i n i c a lM e d i c i n e,V o l ,N o1.51.00.50.0HK2OS-RC-2ACHN786-O*miR-144-3p表达水平86420HK2OS-RC-2ACHN786-O*E2F8表达水平AHK2OS-RC-2ACH
25、N786-OE2F8GAPDH86420E2F8mRNA表达水平*1.51.00.50.0miR-144-3p表达水平癌旁组织癌组织癌旁组织癌组织COS-RC-2 ACHN786-O*1.21.00.80.60.40.20.0HK2*BE2F8/GAPDHA:m i R p和E F 在肾小管上皮细胞和肾癌细胞系中的表达;B:E F 蛋白在肾小管上皮细胞和肾癌细胞系中的表达;C:m i R p和E F 在肾透明癌细胞癌和癌旁组织中的表达.P,P,P .图K I R C细胞系和组织中m i R p和E F 的表达情况过表达m i R p抑制 O细胞的增殖m i R p组 O细胞中m i R p水平
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