毕赤酵母表达系统发展现状及其优化策略.pdf
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1、未来食品科学D O I /f f s ,V o l ,N o /毕赤酵母表达系统发展现状及其优化策略艾聪聪,龚国利,项炜,田露,盖中朝,缑敬轩(陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西 西安 ;通化安睿特生物制药股份有限公司,吉林 通化 )收稿日期:基金项目:陕西省重点研发计划项目(NY )第一作者简介:艾聪聪()(O R C I D:),男,硕士,研究方向为生物技术制药.E m a i l;q q c o m通信作者简介:龚国利()(O R C I D:),男,教授,博士,研究方向为生物制药与合成生物学技术.E m a i l:g u o l i g o n g s u s t e d u c
2、n摘要:毕赤酵母(P i c h i ap a s t o r i s)表达系统是目前生物工程中最流行和最标准的一种重组蛋白生产工具.毕赤酵母系统产蛋白质的优势主要在于重组蛋白在内质网中的适当折叠和胞外分泌功能.此外,由于毕赤酵母本身几乎不产生分泌蛋白,因此重组蛋白的纯化过程相对于其它系统而言较简便.虽然毕氏酵母表达系统的优势较突出,并适用于生产实践,但由于其目标蛋白产量不高,因此需要对构建好的表达菌株进行一定程度的过程优化.本文综述了毕赤酵母近些年的发展现状和提高其外源蛋白表达量的相关策略及产业化研究进展,并展望了此系统的产业化发展前景,为进一步的研究提供理论依据.关键词:表达系统;毕赤酵母
3、;优化;重组蛋白;生物制药D e v e l o p m e n t S t a t u sa n dO p t i m i z a t i o nS t r a t e g yo fP i c h i ap a s t o r i sE x p r e s s i o nS y s t e mA IC o n g c o n g,G ONGG u o l i,X I ANG W e i,T I ANL u,G A IZ h o n g c h a o,G OUJ i n g x u a n(S c h o o l o fF o o da n dB i o e n g i n e e r i
4、n g,S h a n x iU n i v e r s i t yo fS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,X ia n ,C h i n a;T o n g h u aA n r a t eB i o p h a r m a c e u t i c a lC o,L t d,T o n g h u a ,C h i n a)A b s t r a c t:P i c h i ap a s t o r i se x p r e s s i o ns y s t e mi so n eo ft h e m o s tp o p u l a ra n ds
5、 t a n d a r dr e c o m b i n a n tp r o t e i np r o d u c t i o nt o o l si nb i o e n g i n e e r i n g T h ea d v a n t a g e so ft h eP i c h i ap a s t o r i ss y s t e mf o rp r o t e i np r o d u c t i o na r em a i n l yd u et ot h ep r o p e rf o l d i n go fr e c o m b i n a n tp r o t e
6、i n s i nt h ee n d o p l a s m i cr e t i c u l u ma n dt h e i re x o c y t o s i sf u n c t i o n I na d d i t i o n,b e c a u s eP i c h i ap a s t o r i sp r o d u c e sa l m o s tn os e c r e t o r yp r o t e i n i t s e l f,t h ep u r i f i c a t i o np r o c e s so f r e c o m b i n a n tp r
7、 o t e i n i s r e l a t i v e l ys i m p l ec o m p a r e dw i t ho t h e r s y s t e m s A l t h o u g ht h eP i c h i ap a s t o r i se x p r e s s i o ns y s t e mh a so u t s t a n d i n ga d v a n t a g e sa n d i ss u i t a b l ef o rp r o d u c t i o np r a c t i c e,t h ep r o d u c t i o n
8、o f t a r g e tp r o t e i ni sn o th i g h,s ot h ec o n s t r u c t e de x p r e s s i o ns t r a i nn e e d st ob eo p t i m i z e dt oac e r t a i ne x t e n t I nt h i sp a p e r,t h ed e v e l o p m e n t s t a t u so fP i c h i ap a s t o r i si nr e c e n t y e a r s,t h e r e l a t e ds t r
9、 a t e g i e s t o i m p r o v e t h e e x p r e s s i o no f e x o g e n o u sp r o t e i n s a n d t h er e s e a r c hp r o g r e s so f i n d u s t r i a l i z a t i o na r er e v i e w e d,a n dt h ei n d u s t r i a ld e v e l o p m e n tp r o s p e c to ft h i ss y s t e mi si n d i c a t e d
10、,s oa st op r o v i d e t h e o r e t i c a lb a s i s f o r f u r t h e r r e s e a r c hK e y w o r d s:e x p r e s s i o ns y s t e m;P i c h i ap a s t o r i s;o p t i m i z a t i o n;r e c o m b i n a n tp r o t e i n;b i o p h a r m i n g中图分类号:R 文献标志码:A文章编号:(),V o l ,N o 未 来 食 品 科 学 引文格式 艾聪聪 龚
11、国利 项炜 等敭毕赤酵母表达系统发展现状及其优化策略 J 敭未来食品科学 敭 D O I 敭 f f s 敭 h t t p f f s 敭 g z h u 敭 e d u 敭 c n A IC o n g c o n g G ONG G u o l i X I ANG W e i e ta l 敭D e v e l o p m e n ts t a t u sa n do p t i m i z a t i o ns t r a t e g yo fP i c h i ap a s t o r i se x p r e s s i o ns y s t e m J 敭F u t u r eF
12、 o o dS c i e n c e 敭D O I 敭 f f s 敭 h t t p f f s 敭 g z h u 敭 e d u 敭 c n 目前,生物表达系统主要被用于工业和医疗领域中重组蛋白的生产,重组蛋白质在重组疫苗、医药和农产品等领域都有应用.同时重组蛋白难以大量生产也成为这些领域的主要障碍.研究人员主要利用原核细胞和真核细胞来克服生产重组蛋白的困难.细菌、酵母、霉菌、哺乳动物、植物和昆虫等生物表达系统已被广泛应用.革兰氏阴性菌等原核细胞生物是基因工程技术最早使用的一类生物表 达 系 统.在 细 菌 表 达 系 统 中 大 肠 杆 菌(E s c h e r i c h i a
13、 c o l i)最具代表性,已被广泛用于克隆重组D NA和生产异源蛋白.细菌表达系统具有繁殖速率快、营养需求低、表达水平高、转化过程快速等优点.然而这个细胞工厂也存在一些不足,如异源蛋白的胞内聚集和错误折叠、脂多糖的产生、缺乏翻译后的 修饰以及 蛋白酶引 起 的 蛋 白 质 降解.另一类广泛应用的细菌表达系统则是芽孢杆菌(B a c i l l u s),其蛋白分泌能力较强,但是实际外源蛋白的表达量较少,这可能是由于菌体本身会产生胞外蛋白酶.真核细胞表达系统包括丝状真菌、哺乳动物细胞和酵母细胞.丝状真菌的分泌能力较强,但在内质网和高尔基体无法进行适当的折叠,因此不利于外源蛋白的表达.中国仓鼠
14、卵巢细胞(C h i n e s eh a m s t e ro v a r yc e l l s,简称CHO)是一种最常见的哺乳动物细胞系.目前,CHO细胞主要用于生产生物制药化合物、单克隆抗体和F c融合蛋白等领域.此外,小仓鼠肾脏、人类胚胎肾脏 和N S、S P/(小鼠源性骨髓瘤)细胞系的使用也已获得法律许可.该系统的显著优势包括蛋白质的适当的折叠、翻译后修饰和重组蛋白在正确位点的糖基化,这对蛋白质的稳定性来说至关重要.然而,哺乳动物表 达系统生 长 缓 慢,营 养 需 求 较高.此外,一些病毒对培养基的潜在污染导致其难以大规模生产,也会限制哺乳动物表达系统的应用.酵母主要应用于疫苗和制
15、药领域,其蛋白表达机制与哺乳动物细胞相似.与细菌相比,酵母细胞具有生长速率快、翻译后修饰等显著优势.此外,线性化外源D NA可以通过交叉重组现象高效插入染色体中,进而产生稳定的细胞系.在酵母细胞中,酿酒酵母被用于生产乙型肝炎和人类乳头瘤病毒疫苗,这两种疫苗均能产生针对野生型病毒的保护性免疫反应.酿酒酵母中通常是N、O高糖基化蛋白的表达,这可能会影响蛋白的免疫原性.近年来,为了解决蛋白质表达问 题,科 研 工 作 者 开 始 使 用 多 形 汉 逊 酵 母(H a n s e n u l l ap o l y m o r p h a)和毕赤酵母(Pp a s t o r i s).其中,毕赤酵母
16、可以生产出与哺乳动物细胞糖基化高度相似的重组蛋白,因此成为最受欢迎的宿主细胞.总之,利用毕赤酵母系统生产蛋白质有利于蛋白质在内质网中发生适当的折叠以及将重组蛋白分泌到细胞外部环境中.由于Pp a s t o r i s具有分泌系统,原宿主细胞能将产生的蛋白质被分泌出细胞外,因此适合于重组蛋白的生产.表总结了不同宿主系统表达重组蛋白的基本特征.未 来 食 品 科 学 ,V o l ,N o 表不同宿主系统表达重组蛋白的基本特征T a b l eB a s i cc h a r a c t e r i s t i c so f r e c o m b i n a n tp r o t e i n
17、s e x p r e s s e d i nd i f f e r e n th o s t s y s t e m s特征E s c h e r i c h i a c o l iPp a s t o r i sCHO细胞倍增时间 m i n m i n h生长培养基成本低低高生长培养基复杂程度最低最低复杂表达水平高低到高低到中细胞外表达分泌到周围分泌到中间分泌到中间蛋白折叠通常需要再折叠通常需要再折叠适当的折叠N糖基化否高甘露糖复杂O糖基化否是是磷酸化和乙酰化否是是不足脂多糖的积累密码子偏好动物病毒感染注:CHO表示中国仓鼠卵巢细胞.毕赤酵母表达系统发展现状 毕赤酵母表达系统的发展历史上
18、最初的毕赤酵母是从法国一棵栗树的分泌物中分离出来的,G u i l e r m o n d等将其命名为Z y g o s a c c h a r o m y c e sp a s t o r i s.Y a m a d a等 随后将毕赤酵母归为一个新属,即K o m a g a t a e l l a或P i c h i a.研究表明,作为工程甲基营养微生物的毕赤酵母可以将甲醇作为其碳和能源的唯一来源.其中Pp a s t o r i sG S 是较受欢迎的菌株之一,尤其是在工业和医学领域.通过对甲醇代谢途径相关基因的鉴定,结果发现Pp a s t o r i sG S 菌株具有两 个 醇 氧
19、 化 酶 编 码 基 因(A O X 和A O X)(a l c o h o lo x i d a s e,AO X),甲醇的存在可以诱导这些基因的转录,最终产生大量的AO X酶.这两个基因均可以用于生产AO X酶,但基因A O X 产生的酶更多.因此,通过敲除基因A O X,可以大幅度降低Pp a s t o r i sG S 在甲醇上的生长速率,被称为甲醇利用慢表型(M u tS).当敲除A O X 基因时,Pp a s t o r i sG S 在甲醇上的生长速率不会降低,其效果与甲醇利用型(M u t)表型(野生型)相当.然而,敲除这两个基因,菌株则无法在甲醇上生长(甲醇利用负型M u
20、 t).作为G S 衍生物,KM 菌株因缺失A O X 基因而被称为M u tS菌株.在菌株KM 、MC 和MC 等早期的菌株中并未检测到A O X基因,因此它们均不能在甲醇存在的情况下生长.甲醇会先诱导过氧化物酶体大量增殖,而后通过细胞膜进入过氧化物酶体.甲醇在醇氧化酶的作用下生成甲醛和过氧化氢.过氧化氢在过氧化氢酶的催化下分解为水和氧气,而甲醛则通过同化和异化途径继续进行代谢,继而与谷胱甘肽反应并在甲醛脱氢酶(f o r m a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e,F L D)作用 下 与 烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸(n i c o t
21、 i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e,NA D)反应生成甲酸.甲酸进一步与NA D反应再次脱氢,生成二氧化碳和烟酰胺腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 磷 酸 氢(n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d eh y d r o g e n,NA DH).在同化途径中,剩余的甲醛在二羟基丙酮合成酶的作用下与 磷酸木酮糖反应生成 磷酸甘油醛和二羟基丙酮,并以 磷酸果糖的形式转运至细胞质参与磷酸戊糖途径.然而利用甲醇作为唯一碳源存在较多不足之处,研究人员尝试敲除部分甲醇代
22、谢途径相关基因,调节毕赤酵母代谢途径,最终形成非甲醇型毕赤酵母.使用启动子PG A P则将甘油作为碳源来高效表达蛋白,甘油进入细胞后会参与甘油激酶磷酸化和甘油脱氢酶氧化途径,两种途径下产生的 磷酸甘油醛均会参与糖酵解和三羧酸循环.DHA:二 羟 基 丙 酮DHA P:磷 酸 二 氢 丙 酮X u P:磷酸木酮糖D AK:二羟基丙酮激酶GA P:磷酸甘油醛F P:磷酸果糖G l y P:磷酸甘油DHA R:G C Y:GUT:甘油激酶GUT:磷酸甘油脱氢酶G C Y:甘油脱氢酶DHA R:二羟基丙酮还原酶P Y R:丙酮酸.毕赤酵母也被构建为一个多功能细胞工厂,在实验室和工业规模上生产成千上万的
23、生物分子.表列出了一些在毕氏酵母系统中表达的生物分子.,V o l ,N o 未 来 食 品 科 学 图甲基营养型甘油代谢途径 F i g M e t h y l t r o p h i cg l y c e r o lm e t a b o l i s mp a t h w a y 表以毕赤酵母为宿主生产的生物大分子T a b l eR e c o m b i n a n tb i o m a c r o m o l e c u l e sp r o d u c e db yP i c h i ap a s t o r i sa sh o s t产品菌株载体应用参考文献P I MP V 和P
24、 I MP V KM p P I C Z A疟疾的治疗 P C DP i c h i a P i n kp P i n k HC手足口病的治疗 D E NV EKM p P I C Z A登革热的治疗 CH I KV C E E K E G S p P I C K基孔肯雅热的治疗 G p G S p P I C Z A爱泼斯坦 巴尔二氏病毒感染的治疗 R B D N X p P I C Z A非典的治疗 V P V P F cG S p P I C K传染性法氏囊的治疗 F蛋白G S p P I C Z A新城病的治疗 Om p AG S p P I C K奇异变形杆菌感染的治疗 B o N
25、T H cX p P I C Z A肉毒菌的治疗 T c G S p P I C Z A恰加斯病的治疗 A p aG S p P I C K肺结核的治疗 HB HAG S p P I C K肺结核的治疗 C F P F c aG S p P I C Z A肺结核的治疗 E S A T C F P F c aG S p P I C Z A肺结核的治疗 E S A T F c aG S p P I C Z A肺结核的治疗 C F P H s p X F c aG S p P I C Z A肺结核的治疗 E S A T H s p X F c aG S p P I C Z A肺结核的治疗 糖蛋白DG
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- 酵母 表达 系统 发展 现状 及其 优化 策略
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