比较代谢组学揭示不同生长期筇竹笋的代谢物差异.pdf
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1、成分分析 食品科学 2023,Vol.44,No.14 237比较代谢组学揭示不同生长期筇竹笋的 代谢物差异王卫华1,2,杨晓琴2,桑正林1,杨顺强1,赵 平2,刘 云2,朱国磊2,叶夏英1,*(1.昭通学院农学与生命科学学院,滇东北高原特色农业研究中心,云南 昭通 657000;2.西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室,云南 昆明 650224)摘 要:为探究筇竹笋在生长过程中代谢物的动态变化和阶段特异性,采用基于超高效液相色谱-串联质谱的广泛靶向代谢组学,对2 个不同生长期出土高度分别为10cm和25cm的筇竹鲜笋样本进行分析。结果表明,2 个生长期的筇竹笋样本共鉴定出
2、13 类875 个代谢物,其中糖及醇类、黄酮类等成分的相对含量在生长期为25cm样本中明显上升。多元统计分析结果显示,2 个不同生长期的筇竹笋代谢物存在明显阶段特异性,生长期10cm与25cm的筇竹笋共存在283 个显著差异代谢物,其中102 个代谢物被注释到82 条代谢通路中。通过综合分析得出,20 种竹笋主要营养成分在2 个不同生长期的笋中无显著差异,而与口感风味、活性功能有关的代谢物在生长期为25cm的样本中相对含量更高,且25cm筇竹笋样本中苦味因子相对含量更低。因此与生长期为10cm的筇竹笋相比,生长期为25cm的筇竹笋综合经济价值更高,可能是更加适合的采收规格。本研究结果可为筇竹资
3、源的综合开发和可持续利用提供理论参考。关键词:筇竹笋;不同生长期;比较代谢组学;差异代谢物;超高效液相色谱-质谱联用Comparative Metabolomics Revealed Metabolite Differences in Bamboo Shoots(Chimonobambusa tumidissinoda Hsueh&T.P.Yi ex Ohrnberger)at Different Growth StagesWANG Weihua1,2,YANG Xiaoqin2,SANG Zhenglin1,YANG Shunqiang1,ZHAO Ping2,LIU Yun2,ZHU Gu
4、olei2,YE Xiaying1,*(1.Research Center for Plateau Characteristic Agriculture in Northeast Yunnan,Department of Agronomy and Life Science,Zhaotong University,Zhaotong 657000,China;2.Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Utilization in the Southwest Mountains of China,Ministry of Educat
5、ion,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)Abstract:In order to explore the dynamic changes and stage specificity of metabolites in bamboo shoots during its growth,widely targeted metabolomics based on ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)was u
6、sed to analyze fresh bamboo shoots harvested at heights of 10 and 25 cm.The results showed that a total of 875 metabolites belonging to 13 categories were identified from bamboo shoots,including sugars,alcohols and flavonoids,whose relative contents significantly increased in 25 cm-high bamboo shoot
7、s.Moreover,the results of multivariate statistical analyses showed that the metabolites in bamboo shoots had an obvious stage specificity.Totally 283 significantly differential metabolites were identified between the two growth stages,of which 102 metabolites were annotated to 82 metabolic pathways.
8、The contents of 20 major nutrients did not significantly differ between the two growth stages;however,the contents of metabolites related to taste,flavor and bioactive function were higher,while the content of bitter compounds was lower in the 25 cm-high bamboo shoots.Therefore,compared with the 10
9、cm-high bamboo shoots,the 25 cm-high bamboo shoots have a higher comprehensive economic value and are more suitable for harvesting.The 收稿日期:2022-09-26基金项目:国家自然科学基金地区科学基金项目(32260307);云南省应用基础研究计划青年项目(2019FD059);昭通市凤凰计划项目第一作者简介:王卫华(1989)(ORCID:0000-0002-6503-2164),男,主管药师,硕士,研究方向为天然产物化学。E-mail:*通信作者简介:叶
10、夏英(1990)(ORCID:0000-0003-2066-945X),女,副教授,博士,研究方向为竹类系统生物学。E-mail: 238 2023,Vol.44,No.14 食品科学 成分分析results of this study can provide a theoretical reference for the comprehensive development and sustainable utilization of Chimonobambusa tumidissinoda.Keywords:bamboo shoots;different growth stages;comp
11、arative metabolomics;differential metabolites;ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220926-278中图分类号:S644.2 文献标志码:A文章编号:1002-6630(2023)14-0237-08引文格式:王卫华,杨晓琴,桑正林,等.比较代谢组学揭示不同生长期筇竹笋的代谢物差异J.食品科学,2023,44(14):237-244.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220926-
12、278.http:/WANG Weihua,YANG Xiaoqin,SANG Zhenglin,et al.Comparative metabolomics revealed metabolite differences in bamboo shoots(Chimonobambusa tumidissinoda Hsueh&T.P.Yi ex Ohrnberger)at different growth stagesJ.Food Science,2023,44(14):237-244.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002
13、-6630-20220926-278.http:/筇竹(Chimonobambusa tumidissinodaHsueh&T.P.YiexOhrnberger)为地下茎复轴混生中小型竹类,隶属禾本科(Poaceae),竹亚科(Bambusoideae)、方竹属(ChimonobambusaMakino)1,是收录于中国珍稀濒危保护植物目录的保护竹种,也是我国特有种质资源2。筇竹自然分布于我国西南金沙江下游地区,是云南昭通重要的生物资源,昭通天然筇竹林面积占全国天然筇竹林面积的70%以上3。筇竹笋具有肉厚、质脆、味美之特性,是深受消费者青睐的食品。果蔬的口感风味与其代谢物的种类、含量及这些代谢
14、物在发育成熟过程中的动态变化等密切相关,例如番茄的口感风味与番茄中的有机酸、可溶性糖类等代谢物有关,其中的33 种代谢物与消费者的喜好存在明显关联4-5。WangRuochen等6对生长成熟过程中猕猴桃的风味物质变化进行了研究,结果显示,猕猴桃风味相关代谢物在其成熟过程中具有明显的阶段特异性。GaoQuan等7研究发现了新鲜竹笋中的苦涩味主要来源于竹笋的代谢产物L-苯丙氨酸。植物次生代谢产物是植物体内合成的一类与生长发育不相关的小分子物质,它们通常在植物适应环境和应对胁迫的过程中起到关键作用8,植物来源的食品也具有种类丰富的次生代谢产物(如酚酸类、黄酮类、生物碱类等),而这些代谢物与食品发挥抗
15、氧化、抗炎、和改善代谢综合征的生物活性与功能有关9-12。目前,对筇竹笋营养成分的研究结果表明,筇竹鲜笋富含蛋白质、氨基酸、可溶性糖和粗脂肪等营养物质,必需氨基酸比例在34%以上13。杨奕等14通过分析测定3 个不同出土高度筇竹笋主要营养成分,认为出土高度为1020cm的筇竹笋营养品质和经济价值最高。然而现有的研究仅局限于笋中的营养物质,对筇竹笋在生长过程中相关代谢产物的动态变化和阶段特异性,以及与筇竹笋口感风味相关的其他物质和次生代谢产物等的研究尚不够深入。广泛靶向代谢组学是一种基于高通量检测和多元数据处理,能够全面、快速对样品中小分子代谢物进行定性、定量分析,从而系统分析样品代谢物差异水平
16、和种类变化的新兴技术15-18。因此,本研究利用基于超高效液相色谱-串联质谱(ultra-highperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry,UPLC-MS/MS)的广泛靶向代谢组学方法对2 个不同生长期(出土高度为10cm和25cm)筇竹鲜笋进行分析,进一步探究筇竹笋代谢物以及其在笋生长过程中的动态变化和阶段特异性,为筇竹资源的综合开发和可持续利用提供参考。1 材料与方法1.1 材料与试剂筇竹笋样品于2021年5月在云南昭通市大关县三江口采集,经昭通学院农学与生命科学学院生物科学教研室鉴定确认为禾本科植物筇竹(C.tumidi
17、ssinodaHsueh&T.P.YiexOhrnberger)的嫩苗。分别量取出土高度为10cm和25cm的无虫害竹笋,脱壳后在顶部、中部和基部各取5 g,混合后放置于冻存管中用液氮速冻后放置于80 冰箱待测。水、甲醇、乙腈、甲酸(均为色谱纯)美国Merck公司;标准品二甲基亚砜(色谱纯)云南西力生物技术股份有限公司。1.2 仪器与设备NexeraX2UPLC仪 岛津(中国)有限公司;4500QTRAP串联质谱仪 美国AppliedBiosystems公司;SB-C18色谱柱(2.1mm100mm,1.8m)美国安捷伦公司;Scientz-100F普通型冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公
18、司;MM400冷冻混合研磨仪 德国莱驰公司;PTX-FA210S电子天平 华志(福建)电子科技有限公司;XH-D型旋涡振荡器 美国赛默飞世尔科技公司;JIDI-16D台式高速离心机 广州吉迪仪器有限 公司。成分分析 食品科学 2023,Vol.44,No.14 2391.3 方法1.3.1 样品提取样品放置于冻干机中真空冷冻干燥后利用研磨仪研磨(30 Hz,1.5min)至粉末状,称取100mg的粉末,溶解于1.2mL70%甲醇提取液中,后置于旋涡振荡器,每30min涡旋一次,每次持续30s,共涡旋6 次,样本置于4 冰箱过夜,离心(12 000 r/min,10min)后,吸取上清,用微孔滤
19、膜(0.22m)过滤样品,并保存于进样瓶中,2 个不同生长期的筇竹笋样本,分别重复取样3 次,用于UPLC-MS/MS分析。质控样本由不同组的筇竹笋样本提取物等量混合制备而成,与分析样本采用相同处理和检测方法,重复测定3 次。仪器分析过程中,每10 个检测分析样本中插入一个质控样本,以监测分析过程的重复性。1.3.2 UPLC-MS/MS采集条件UPLC条件:柱温40,流速0.35mL/min,进样量4L;流动相:A相为超纯水(加入0.1%甲酸),B相为乙腈(加入0.1%甲酸);洗脱梯度:0.00min,95%A,5%B;0.009.00min,95%5%A,5%95%B,保持1min;10.
20、0011.10min,5%95%A,95%5%B,并以5%B平衡至14min。MS条件:电喷雾离子源;离子源温度550;离子喷雾电压5 500 V(正离子模式)/4 500 V(负离子模式)。三重四极杆扫描使用多反应监测模式,根据每个时期内洗脱的代谢物,在每个时期监测一组特定的多反应监测模式离子对。1.4 数据处理利用软件Analyst1.6.3处理质谱数据,用MultiaQuant软件,基于自建数据库(metwaredatabase,MWDB),对样本的代谢物进行质谱定性定量分析,对所有代谢物质谱峰进行积分,并对同一物质质谱峰进行积分校正19。多元统计包括无监督模式识别的主成分分析(prin
21、cipalcomponentanalysis,PCA)和有监督模式识别的正交偏最小二乘判别分析(orthogonalpartialleastsquares-discriminantanalysis,OPLS-DA)。OPLS-DA在原始数据进行log2转换后,再进行中心化处理,然后利用R软件进行分析。差异代谢物筛选采取将OPLS-DA模型的变量重要性投影(variableimportanceinprojection,VIP)值、差异倍数(fold change,FC)值相结合的方法。显著差异代谢物基于2个筛选标准:1)FC2和FC0.5的代谢物;2)VIP1的代谢物。2 结果与分析2.1 总代
22、谢物分析经过代谢组分析,2 个生长时期的筇竹笋样本中共检测鉴定出875 种代谢物(图1),按代谢物类型将代谢物分为13 类(图2)。利用面积归一法获得各类物质的相对含量(表1),25cm筇竹笋较10cm样本相比,糖及醇类、黄酮类、生物碱类相对含量上浮明显,脂质、氨基酸及衍生物占比有所下降。0.010.841.0923456789 10 11 12 13 140.41.2A1.00.80.60.2?107?/min0.014.1323456789 10 11 12 13 140.41.2B1.00.80.60.2?107?/minA.正离子模式;B.负离子模式。图 1 筇竹笋样本代谢物多反应监测
23、多峰图Fig.1 MRM chromatograms of bamboo shoot samples 160140120100806040200?1561471019794776756231917417?图 2 筇竹笋样本中检测到的代谢物分类Fig.2 Classification of metabolites detected in bamboo shoot samples根据代谢组分析结果发现,在875 种代谢物中,筇竹笋样品中的脂质成分种类最多,相对丰度最高,鉴定出脂质156 种,包括74 种游离脂肪酸,18 种甘油酯及94 种其他脂类等。其中亚油酸和-亚麻酸在875 个鉴定代谢物的相对
24、含量分别达3.94%和2.90%。亚油酸和-亚麻酸是人体必需的不饱和脂肪酸,具有降脂和保护心脑血管等作用20-22。本研究表明筇竹笋中不饱和脂肪酸占脂肪酸的主导地位,这与其他竹笋研究结论23基本一致。另有研究显示,竹笋膳食纤维能够降低人体低240 2023,Vol.44,No.14 食品科学 成分分析血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和动脉粥样硬化 指数24-25。根据本研究结果推测,筇竹笋中丰富的不饱和脂肪酸等脂质成分可能是筇竹笋具备改善代谢综合征(血脂异常)作用的重要物质基础。表 1 2 个不同生长期筇竹笋样本各类代谢物相对含量Table 1 Relative contents of met
25、abolites in bamboo shoots at two different growth stages物质类别相对含量/%10cm样本25cm样本脂质38.1532.68酚酸类5.986.40黄酮类1.843.18氨基酸及其衍生物10.638.10生物碱13.1916.80有机酸9.608.98糖和醇类4.7910.13核苷酸及其衍生物12.4410.62萜类1.140.65维生素类1.211.27木脂素和香豆素0.150.16醌类0.080.07其他类0.790.95从筇竹笋中鉴定出氨基酸及其衍生物共97 种,其中包含蛋白氨基酸17 种,必需氨基酸8 种。利用测出的17 种蛋白氨基
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