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MM微创医学2 0 2 3年第18 卷第4期Journal of Minimally Invasive Medicine,2023,18(4)435.3-甲基腺嘌呤对风湿性心脏病瓣膜纤维化的影响一朱晓莉谢晓勇*黄柳柳罗程黎玉贵温大帅贺洲（广西医科大学第一附属医院心胸外科，广西南宁市530021)【摘要】目的探讨3-甲基腺嘌呤(3-MA)对风湿性心脏病(RHD)瓣膜纤维化相关指标的影响。方法取30 只Lewis雌性大鼠,利用电脑随机数将大鼠分为正常组、模型组和实验组，每组10 只。模型组和实验组通过后足垫、腹部皮下注射抗原I、抗原I 造模，大鼠多处关节出现红肿,B超检查显示二尖瓣有不同程度反流，表明RHD模型建立成功。建模成功后,第8 9周,实验组大鼠于腹部皮下注射3-MA2.5mg/kg，1次/周，模型组大鼠腹部皮下注射等量生理盐水；第1024周，模型组、实验组大鼠腹部皮下注射0.5mL抗原I，1次/周，正常组大鼠在相同时间以同样方式注射等量生理盐水。采用免疫印迹（Westernblot）法检测3组大鼠二尖瓣组织中PI3K、Akt、-平滑肌肌动蛋白（-SMA）、LC3I及I型胶原蛋白的相对表达量；采用ELISA法检测肿瘤坏死因子-（T NF-）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）水平。结果正常组、实验组、模型组大鼠的二尖瓣组织中PI3K、A k t、LC3 I的相对表达量依次升高，组间差异均有统计学意义（均P0.05）；模型组-SMA、I 型胶原蛋白的相对表达量均高于正常组、实验组,差异均有统计学意义（均P0.05）。正常组、实验组、模型组大鼠的二尖瓣组织中TNF-、I L-6、I L-8 水平依次升高,组间差异均有统计学意义（均P0.05）。结论3-MA能够有效抑制RHD大鼠二尖瓣组织自噬，减轻心脏瓣膜纤维化；调控PI3K/Akt信号通路可能是3-MA起抑制纤维化的作用机制之一;自噬作用的调控可能与TNF-、IL-6 及IL-8水平具有一定的相关性。【关键词】风湿性心脏病;3-甲基腺嘌呤;PI3K/Akt;瓣膜纤维化【中图分类号】R541.2【文献标识码】A【文章编号】16 7 3-6 57 5（2 0 2 3)0 4-0 435-0 5D0I:10.11864/j.issn.1673.2023.04.05Effect of 3-methyladenine on valve fibrosis in rheumatic heart diseaseZHU Xiaoli,XIE Xiaoyong,HUANG Liuliu,LUO Cheng,LI Yugui,WEN Dashuai,HE Zhou(Department of Cardiothoracic Surgery,the First Affliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning530021,Guangxi,China)Abstract)Objective To investigate the effect of 3-methyladenine(3-MA)on related indexesof valve fibrosis in rheumatic heart disease(RHD).Methods Thirty female Lewis rats were dividedinto normal group,model group and experimental group by computer random number method,with10 rats in each group.The model group and experimental group were modeled by subcutaneous injectionof antigen I and antigen I into the hind foot pad and abdomen.Multiple joints of the rats showedredness and swelling,and two-dimensional ultrasonography showed different degrees of mitral valveregurgitation,indicating that the model was successfully established.After successful modeling,rats inthe experimental group were injected subcutaneously with 3-MA 2.5 mg/kg once a week in the abdomenat the 8th to 9th week,while rats in the model group were injected subcutaneously with the same amountof normal saline in the abdomen.From 10th to 24th week,rats in the model group and experimentalgroup were injected with 0.5 mL antigen II subcutaneously in the abdomen once a week,while rats inthe normal group were injected with the same amount of normal saline at the same time and in the same基金项目：广西自然科学基金（编号：2 0 19GXNSFAA185055）*通信作者436way.The relative expressions of PI3K,Akt,alpha-smooth muscle actin（-SMA,)LC3 I and typeI collagen in the mitral valve tissues of the three groups were detected by Western blot.The levels oftumor necrosis factor-（T NF-),interleukin-6（IL-6)a n d i n t e r l e u k i n-8 （IL-8)w e r e d e t e c t e d b yELISA.Results The relative expressions of PI3K,Akt and LC3 I in mitral valve tissue of normalgroup,experimental group and model group increased in turn,and the differences among the groupswere statistically significant(all P0.05).Compared with the normal group and the experimentalgroup,the relative expressions of-SMA,type I collagen were higher in the model group,withstatistically significant dfferences(all P0.05).The levels of TNF-,IL-6 and IL-8 in mitral valve tisue of normal group,experimental group and model group increased in turn,and the differences among the groups werestatistically significant(all P0.05).Conclusion 3-MA can effectively inhibit autophagy of mitralvalve tissue in RHD rats and reduce heart valve fibrosis.The regulation of PI3K/Akt signaling pathwaymay be one of the mechanisms of 3-MA inhibiting fibrosis.The regulation of autophagy may be relatedto the levels of TNF-,IL-6 and IL-8.Key words】Rh e u m a t i c h e a r t d i s e a s e;3-m e t h y l a d e n i n e;PI3K/A k t;Va l v e f i b r o s i s风湿性心脏病（rheumatic heart disease，RH D）是我国瓣膜性心脏病的主要构成部分，其中55.1%为风湿性瓣膜病变,2 1.3%为退行性瓣膜病变 。A 组乙型溶血性链球菌（group A streptococcus pyogens，GAS)侵犯心脏,可导致风湿性心瓣膜炎、心肌炎和心包炎,其中以风湿性心瓣膜炎最为常见。RHD的症状大多由瓣膜病变引起,但RHD的发病机制尚未明确,且缺乏有效的防治措施,需进一步研究其可能的发病机制，为临床预防和治疗提供更完善的理论依据。自噬是最热门的研究领域之一,是一种细胞内代谢降解的过程，包括自噬体吞噬细胞质、溶酶体降解、溶酶体回收等2 。本团队的前期研究3 发现,风湿性瓣膜病患者主动脉瓣膜的自噬水平明显高于正常瓣膜组织；而体外细胞实验41结果发现，LY294002自噬抑制剂在RHD的发病机制中发挥重要作用,可促进瓣膜间质细胞向肌成纤维细胞分化，同时对肌成纤维细胞的增殖有抑制作用。本研究通过动物在体实验，探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA)对RHD大鼠瓣膜增生、纤维化的作用及其可能的机制,以期为临床预防和治疗RHD提供理论依据。1材料与方法1.1实验动物30 只8 周龄无特定病原体（specificpathogen free，SPF）级Lewis 雌性大鼠，体重16 0 180g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司SCXK（京）2 0 2 1-0 0 0 6，大鼠购入后饲养于广西医Journal of Minimally Invasive Medicine,Aug.2023,Vol.18,No.4科大学实验动物中心SPF级实验动物房SYXK（桂）2020-0004,温度2 0 2 5,相对湿度40%7 0%。1.2主要试剂完全弗氏佐剂（complete Freundsadjuvant，CFA）为Sigma公司产品（生产批号：SLCF1289），3-M A 为美国Focus公司产品（生产批号：MA0318-Jul-10H），BCA 试剂购于武汉赛维尔生物科技有限公司（生产批号：G2026），抗-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，-SMA）抗体购于艾博抗（上海）贸易有限公司（生产批号：GR3447889-2），I型胶原蛋白抗体购于上海联迈生物工程有限公司（生产批号：LM-7158R），G A PD H 抗体（生产批号：AC220730007）、PI3K 抗体（生产批号：AC220830004）、Akt抗体（生产批号：AC220430017）、LC3抗体（生产批号：AC220330001）均购于武汉赛维尔生物科技有限公司,辣根酶标记山羊抗兔二抗购于北京博奥森生物科技有限公司（生产批号：AH11286402）。ELISA试剂盒（生产批号：SEKM-0325）、G A S菌株（生产批号：LA9420-1EA)均购于北京索莱宝科技有限公司。本实验方案遵循动物福利和伦理原则,并经广西医科大学动物伦理委员会审核批准（伦理审批号：202209100)。1.3方法GAS培养、配制抗原及动物处理参考李文婷等5 文献中的方法。1.3.1细菌培养复苏保存于-2 0 的GAS菌株，接种于已灭菌的1L脑心浸液（广东环凯微生物科技有限公司），置于37，110 r/min，2 4h 摇床震荡培养,2 4h后用50 mL离心管分装含有GAS的脑心浸MM微创医学2 0 2 3年第18 卷第4期Journal of Minimally Invasive Medicine,2023,18(4)液,40 0 0 r/min离心5min收取细菌,用灭菌生理盐水洗涤3次（每次40 0 0 r/min离心5min）。取2 mL细菌悬液储存于2 0，余下细菌悬液离心后于40g/L多聚甲醛溶液中灭活6 h后,用灭菌生理盐水洗涤5次（每次40 0 0 r/min离心5min）。收集已灭活细菌悬液,用于下一步配制抗原。1.3.2抗原配制应用酶标仪赛默飞世尔科技（中国）有限公司,型号：MultiskanGO测定细菌悬液光密度，根据公式Y=51.102X3.9 31（Y为细菌总数,X为光密度），配置浓度为110 菌落形成单位（c o l o n y f o r mi n g u n i t，CFU)/mL悬液。灭活细菌悬液与CFA按1：1比例混合,置于碎冰中,使用超声细胞破碎仪乳化混合物制备成抗原I，取浓度为110lCFU/mL灭活GAS悬液即为抗原。1.3.3云动物分组与处理利用电脑随机数将Lewis雌性大鼠分为对照组、模型组及实验组，每组10 只。第1周，模型组和实验组均在大鼠后足垫注射抗原I0.2mL,1次；第2 5周，于腹部皮下注射抗原I0.5mL,1次/周;第6 9周，于腹部皮下注射抗原0.5m L,1次/周;经灭活链球菌刺激后的大鼠多处关节出现红肿,B超检查显示二尖瓣有不同程度反流,表明RHD模型建立成功。第8 9周,实验组大鼠于腹部皮下注射3-MA2.5mg/kg，1次/周，模型组大鼠腹部皮下注射等量生理盐水；第10 2 4周,模型组、实验组腹部皮下注射抗原0.5m L，1次/周，正常组在相同时间以同样方式注射等量生理盐水。1.4Western blot法检测PI3K、A k t、LC 3I、-SMA与I型胶原蛋白水平于第2 5周用水合氯醛腹腔注射麻醉后解剖大鼠，切取二尖瓣组织,加人蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂进行研磨,12 0 0 0 r/min、4离心10min,取上清液，提取总蛋白；按照BCA试剂盒说明书测定蛋白质浓度；取适量上样缓冲液加入蛋白中加热使蛋白变性（10 0,5min）,冷却后取50 g总蛋白,每孔加人5L的上样蛋白和Marker于SDS聚丙烯酰胺凝胶（10 mL10%分离胶体积+10 mL5%浓缩胶体积）电泳分离蛋白（12 0 min），快速转膜液400mA恒流转膜30 min,转移至PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭1h，分别加入一抗内参GAPDH（1:2 0 0 0）、目的一抗 PI3K（1：10 0 0）、A k t(1:2 000)、LC 3 I(1:2 0 0 0)、-SMA（1:10 0)、I型胶原蛋白（1：2 0 0）和GAPDH（1：12 0 0）孵育，4摇床过夜,次日洗膜，（1TBST)漂洗5次后,加437.人辣根酶标记山羊抗兔二抗（1：2 0 0 0）在室温下孵育2 h,再次洗膜，TBST漂洗5次，在PVDF膜上滴加超敏发光液（ECL发光液），用发光液浸湿PVDF膜后放置于超高灵敏度化学发光成像仪器显影成像。并采用ImageJ软件分析各条带灰度值结果。1.5ELISA法检测肿瘤坏死因子-、白介素-6、白介素-8 水平二尖瓣组织置于冰冻研磨仪进行研磨，3000r/min,离心10 min,取上清液。用PBS洗涤二尖瓣组织细胞3次,每次1 0 0 0 r/min,离心5 min。二尖瓣组织细胞与含有细胞裂解液的PBS混合于4孵育10 min后，离心5min，12 0 0 0 r/m in，收集上清液。按照ELISA试剂盒说明测定样本中肿瘤坏死因子-（t u m o r n e c r o s i s f a c t o r-，T NF-）、白介素(interleukin,IL)-6、I L-8 水平。1.6统计学方法采用SPSS23.0统计软件处理数据,计量资料以均数标准差（xs)表示,组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD法，以P0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1PI3K、A k t、LC 3I I、-SMA及I型胶原蛋白相对表达量比较正常组、实验组、模型组大鼠的二尖瓣组织PI3K、A k t、LC3I I 的相对表达量依次升高，组间差异均有统计学意义（均P0.05）;模型组-SMA、I型胶原蛋白的相对表达量均高于正常组、实验组，差异均有统计学意义（均P0.05）。见图1、表1。PI3KAkt-SMAI型胶原蛋白LC3 IIGAPDH图13组大鼠二尖瓣组织 PI3K、A k t、-SMA、LC3I与I型胶原蛋白相对表达量110Ku60Ku42Ku190Ku16Ku36Ku438表13组PI3K、A k t、LC3II、-SMA与I型胶原蛋白相对表达量的比较（xs）组别n正常组10模型组10实验组10F值P值注：与正常组相比，*P0.05；与模型组相比，P0.05。2.2TNF-、I L-6、I L-8 水平比较正常组、实验组、模型组大鼠的二尖瓣组织 TNF-、I L-6、I L-8 水平依组别TNF-正常组10模型组10实验组10F值P值注：与正常组相比，*P0.05；与模型组相比，P0.05。3 讨 论RHD是因GAS感染导致风湿性瓣膜炎的发生，并经过长期的发展，瓣膜增厚及弹性减退、交界粘连、钙化,最终导致瓣膜狭窄或（和)关闭不全，瓣膜功能丧失,以二尖瓣受累最为常见,其次为主动脉瓣受累。RHD瓣膜组织发生增生及持续纤维化是其病情加重并恶化的重要因素之一，但目前其作用机制尚不明确。-SMA是胶原纤维沉积的关键蛋白，同时-SMA向肌成纤维母细胞分化时还会大量表达I型胶原蛋白,二者是反应瓣膜纤维化的重要指标6-。研究10 表明，当细胞处于应激或饥饿状态时，细胞为维持生存，会通过激活自噬来降解细胞内损伤或多余的物质提供给细胞重新利用，但过度的自噬、非选择地吞噬大量细胞，会导致自噬程序性死亡。哺乳动物蛋白微管相关蛋白1轻链3（microtubuleassociatedprotein 1 light chain 3,LC3)以 LC3 I 及 LC3 II 的形式存在,二者可相互转化。发生自噬时,经泛素化的LC3I会与自噬膜上的磷脂酰乙醇胺结合转化成LC3II,因而 LC3 II 是发生自噬的重要标记物11-13。本研究结果显示,模型组LC3I的相对表达量明显高于正常组,表明RHD瓣膜组织自噬明显增强，自噬可能是RHD发病的重要机制。自噬的调控与多条信号转导通路有关，且各通路间又可能相互联系，是一个非常复杂的网络。适当的自噬可以维持心肌细胞的功能，但过度自噬可能会导Journal of Minimally Invasive Medicine,Aug.2023,Vol.18,No.4PI3KAkt0.449 0.0530.448 0.0801.798 0.407*1.922 0.316*0.786 0.276*#1.276 0.180*#18.14037.2010.0010.001表2 3组二尖瓣组织TNF-、IL-6、IL-8 水平比较（s，p g/mL)nLC3 II0.449 0.0631.798 0.417*0.795 0.266*#16.6900.001次升高,组间差异均有统计学意义（均P0.05）。见表2。IL-649.140 1.90617.440 1.419128.339 26.382*51.945 2.863*79.229 9.836*#45.262 3.060*#18.062153.9010.001 0.001致细胞自噬性死亡14-15。现已证实多条信号通路参与自噬的调控16 。PI3K/Akt信号通路是调控自噬最典型的通路17 ,而PI3K抑制剂是目前常用的自噬调控剂，包括3-MA、渥曼青霉素和LY294002等。本研究中,模型组LC3I、-SMA及I型胶原蛋白相对表达量均高于正常组（均P0.05），而经3-MA干预后,实验组-SMA、I 型胶原蛋白及LC3相对表达量均明显下降（均P0.05），提示3-MA能明显减轻RHD大鼠瓣膜组织自噬,减轻瓣膜组织纤维化。本研究中,模型组PI3K、A k t 蛋白表达量均高于正常组（均P0.05），而经3-MA干预后,PI3K、A k t相对表达量均明显下降（均P0.05）,推测风湿性瓣膜病可能通过PI3K/Akt信号通路调节瓣膜的纤维化，但结果尚需要进行PI3K/Akt 的干预,以进一步证实。巨噬细胞是免疫系统的中心调节细胞，参与机体许多先天性免疫及适应性免疫功能18-2 0 1。巨噬细胞参与RHD的免疫过程,通过吞噬病变细胞和有害物质,可缓解疾病症状。TNF-主要通过细菌脂多糖激活的单核巨噬细胞产生；IL-6主要由活化的巨噬细胞、淋巴细胞及上皮细胞分泌;IL-8是趋化因子CXC类的代表因子,主要是由病变局部的单核巨噬细胞及内皮细胞分泌。本研究通过对 Lewis 雌性大鼠注射灭活GAS构建RHD模型,结果发现，模型组较正常组TNF-、I L-6、I L-8 水平高，提示RHD可诱导明显的二尖瓣炎症反应,经自噬抑制剂3-MA干预后,实验组较模型组TNF-、I L-6、I L-8 水平低,提示在RHD-SMA1.376 0.074#2.496 0.2681.261 0.588#10.8320.001211.959 19.515*105.539 7.238*#141.103 0.001I型胶原蛋白1.478 0.398#2.436 0.3571.138 0.453#11.9540.001IL-840.683 6.622MM微创医学2 0 2 3年第18 卷第4期Journal of Minimally Invasive Medicine,2023,18(4)的发病机制中，自噬水平可能与TNF-、I L-6 及 IL-8水平具有一定的相关性。综上所述,RHD瓣膜组织自噬明显增强，自噬可能是RHD发病的重要机制;3-MA能够有效地抑制RHD瓣膜自噬,能降低瓣膜的-SMA及I型胶原蛋白的表达，减轻心脏瓣膜纤维化；调控PI3K/Akt信号通路可能是其起重要作用的机制之一;在RHD的发病机制中,自噬水平可能与TNF-、I L-6 及IL-8 的水平具有一定的相关性。参考文献1中国心血管健康与疾病报告编写组.中国心血管健康与疾病报告2 0 2 1要点解读J.中国心血管杂志,2 0 2 2,2 7(4):30 5-318.2Wan P,Su W,Zhang Y,et al.LncRNA H19 initiatesmicroglial pyroptosis and neuronal death in retinalischemia/reperfusion injury J.Cell Death Differ,2020,27(1):176-191.3 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