EphB2调控claudin-6对子宫内膜癌侵袭和转移的影响.pdf
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1、 ,(,)(,),:;网络出版时间:网络出版地址:调控 对子宫内膜癌侵袭和转移的影响孙帅,夏青,李凡,闵锐,韩悦心,冯振中,李楠,摘要:目的探讨 和 的靶向关系,观察敲低和过表达 基因通过调控 对子宫内膜癌细胞生长、迁移及侵袭的影响。方法采用 数据库分析 在子宫内膜癌和癌旁组织中的差异表达及其与临床病理特征的关系;应用 法预测 可能相关的功能通路;应用 数据库分析 互作基因;利用体外培养子宫内膜癌细胞;采用脂质体转染法转染子宫内膜癌细胞敲低和过表达 基因;采用 法和 法检测敲低和过表达 各组细胞 和 表达水平;提取转染后细胞进行细胞增殖、迁移和侵袭实验;免疫组化检测 和 蛋白在子宫内膜样癌中的
2、表达。结果 数据库分析 例患者显示 在子宫内膜癌中高表达,可能是 最具相关性基因();数据库分析显示 表达可能与细胞黏附和细胞连接通路相关。法显示干扰后 表达:阴性对照组:、组:。划痕实验法检测不同分组中癌细胞的迁移能力,干扰后划痕愈合率显示:阴性对照组:、空白对照组:、组:;过表达后划痕愈合率显示:空白对照组:、空载体组:、过表达组:;敲低 后 表达显著下降,细胞增殖活力明显降低,细胞侵袭能力亦受到明显抑制,差异有统计学意义(均 );过表达 后 表达明显上升,细胞迁移和侵袭能力亦明显增强,差异有统计学意义(均 )。实验显示:和 在子宫内膜样癌(例)和癌旁组织(例)中的表达,差异有统计学意义(
3、)。结论 在子宫内膜癌中高表达,基因敲低和过表达影响子宫内膜癌细胞的生长及恶性生物学行为,其机制可能与调控 表达水平有关。关键词:子宫肿瘤;子宫内膜癌;生物学行为中图分类号:文献标志码:文章编号:():子宫内膜癌()是严重危害女性生 命 健 康 的 疾 病,研 究 显 示 年 全 球 约 例新发子宫内膜癌患者,子宫内膜癌相关死接受日期:基金项目:安徽高校自然科学研究项目()、蚌埠医学院研究生科研创新计划资助()、蚌埠医学院科技项目()作者单位:蚌埠医学院病理学教研室,蚌埠 蚌埠医学院第一附属医院病理科,蚌埠 安徽医科大学第二附属医院病理科,合肥 蚌埠医学院临床医学院,蚌埠 作者简介:孙帅,男,
4、硕士研究生。:李楠,女,博士,教授,通讯作者。:亡约 例 。子宫内膜癌发病率逐年上升,在发达国家其位居女性生殖道恶性肿瘤的首位,在我国部分发达地区也有类似的趋势 。子宫内膜癌患者 年生存率约为 ;但有远处转移的患者预后差,年生存率仅为 。积极研究子宫内膜癌侵袭、进展过程中的分子事件,寻找早期诊断标志物和潜在治疗靶点,具有重要的科学意义和潜在的临床价值。是 受体家族成员,受体家族是酪氨酸激酶受体超家族中最大的亚族。有研究发现,在多种肿瘤中异常表达,且与肿瘤转移呈明显正相关 。在胃癌、非小细胞肺癌等组织中高表达,下调 可显著抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭 。本实验在体外实验中敲临床与实验病理学杂志
5、;()低和过表达子宫内膜癌细胞 内 水平,检测 在 和蛋白水平的表达,探讨子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的改变,以进一步明确 基因在子宫内膜癌中的作用。材料与方法 材料收集 年蚌埠医学院第一附属医院子宫蜡块标本,包括子宫内膜癌 例,子宫内膜不典型增生 例,正常子宫内膜 例。细胞系与试剂本组子宫内膜癌细胞 为实验室留存。胎牛血清购自美国 公司。培养基、电泳液、转膜液、缓冲液,均购自武汉塞维尔公司。抗体()购自美国 公司;抗体()购自英国 公司;试剂盒、小室、多聚甲醛、凝胶快速配制试剂盒,均购自上海碧云天公司。基质胶购自美国 公司;逆转录试剂购自南京诺唯赞公司;试剂购自北京全式金公司;化学发光
6、试剂盒购自上海雅酶公司;购自美国 公司。方法 生物信息学分析 表达及靶向基因采用 数据库分析 在子宫内膜癌和癌旁组织中的表达及与子宫内膜癌临床分期的关系;通过 法在两个数据库 和 中 基因集合,按照 表达中位值进行基因富集分析;数据库寻找 相关基因。细胞培养、转染和分组用含 胎牛血清和 青霉素 链霉素抗生素的 培养基培养 细胞,置于 、培养箱中培养。待细胞长至 以上进行传代处理。细胞转染:消化后收集细胞,将细胞充分混匀后计数,接种于 孔板内,每孔约 细胞,后待细胞长至 汇合度进行转染实验,转染过程严格按 说明书进行操作,在荧光显微镜下观察转染情况,收集各组对数生长期 细胞进行后续实验。法检测
7、和 表达取转染后的 组细胞,按 个细胞接种在孔板中,待细胞生长至密度达 后,用冷 洗涤 次,加入 细胞裂解液后用细胞刮刮下。采用 法定量蛋白,将含有蛋白的细胞裂解液按 与 上样缓冲液混合,煮沸 ,然后进行电泳,转膜,封闭,一抗孵育过夜。将膜用 洗涤 次,每次 ,在室温下与合适的 标记的二抗孵育 。通过增强的化学发光检测系统检测蛋白条带。干扰后,设立空白对照组、阴性对照组和 组。过表达后,设立空白对照组、空载体组和过表达组。细胞增殖实验取转染后的 组细胞,将细胞以每孔 个密度均匀接种于 孔板中,并设置调零组(只含细胞培养基、不含细胞),培养于 的培养箱中培养 ,每孔加入 孵育,用酶标仪测量 处的
8、吸光度。细胞活力计算公式:细胞活力(实验组 调零组)(空白对照组 调零组),实验重复 次,取平均值。检测细胞中 、的表达 提取试剂盒提取转染后 组和阴性对照组子宫内膜癌细胞总 ,通过超微量分光光度计测定 浓度,采用反转录试剂盒合成 。配制 反应体系,以 为内参检测 和 的表达。上游引物:,下游引物:;上游引物:,下游引物:;上 游 引物:,下游引物:。划痕迁移实验将细胞按 个 孔数量接种于 孔板中,待细胞融合度达 时,使用 枪头沿直尺垂直划直线。划线后用不含血清的培养基洗涤 次,分别于培养 、时镜下拍照并测量划痕宽度;实验重复 次。侵袭实验将 胶与 培养基按 稀释,加 稀释的 胶至 小室上室。
9、将 小室放入 细胞培养箱中孵育 。待胶凝固后,取细胞用无血清 培养基调整细胞浓度至每毫升 个,取 加至 小室上室,将 小室置于 孔培养板中(预先加入 含 培养基);培养 后取出小室,用棉签擦去基质胶和小室内细胞,经 多聚甲醛固定 ,结晶紫溶液染色 ;洗脱残余染液,显微镜下观察,随机选取 个视野计数穿膜细胞;实验重复 次。免疫组化法标本均经 中性福尔马林固定,石蜡包埋,常规 厚连续切片,免疫组化临床与实验病理学杂志 ;()采用 两步法染色,并统计分析 和 在癌旁组织和各级子宫内膜样癌组织中的表达。统计学分析所有数据采用 软件进行统计学分析,实验数据以珋 表示,组间均数比较采用 检验或 分析。以
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