PCR与G-四链体联用可视化鉴别人参与西洋参.pdf

PCR与G-四链体联用可视化鉴别人参与西洋参研究报告D0I:10.13995/ki.11-1802/ts.035709引用格式：刘墨祎，汪香君，汪洺卉，等.PCR与G-四链体联用可视化鉴别人参与西洋参J.食品与发酵工业，2 0 2 3，49（17）：6 9-74.LIU Moyi,WANG Xiangjun,WANG Minghui,et al.Visual discrimination of Panax ginseng and Panax quinquefolium byPCR and G-quadruplex J.Food and Fermentation Industries,2023,49(17):69-74.刘墨祎，汪香君，汪洺卉，李迎,刘丽梅*（北华大学医学技术学院，吉林吉林，132 0 13）摘要人参和西洋参作为我国常用名贵中药，其价值很高，由于它们为人参属近缘物种，因此二者在形态和化学成分方面较为相似。然而人参和西洋参的药性和药效有较大区别，二者在临床上不可混用，所以对二者进行鉴定就尤为重要。该研究基于人参与西洋参基因组DNA上的特异性snp位点，设计了5 端含有G-四链体互补序列的上下游引物，通过PCR扩增出大量含G-四链体的双链DNA，与氯高铁血红素（Hemin）结合形成具有过氧化物酶活性的DNA酶（DNAzyme），并在H,O，存在的情况下催化ABTS发生颜色变化。通过对PCR体系以及显色体系的优化，达到快速、简便地鉴别人参与西洋参，灵敏度可达到0.1ng/uL。研究建立了针对人参和西洋参的PCR与G-四链体联用的可视化鉴别方法，为人参与西洋参的鉴别提供了新的途径。关键词PCR；G-四链体；人参；西洋参；可视化鉴别人参和西洋参均为五加科人参属的草本植物,其根、茎等部位均可入药，药用价值极高1-2 。由于人参和西洋参为人参属近缘物种，两者形态和化学成分较为相似,因此市场上将两者掺杂混用现象时有发生3。但人参与西洋参在药性和药效上存在较大差异：人参性温，补气助阳，适合体质为寒性的人服用；而西洋参性?，易于补气养阴，适合阴虚体质或者燥热的人服用4-6 ,两者在临床上不可混用。目前国内外对人参和西洋参的检测方法包括形态学、化学分析法和分子生物法7-8 ，但都易受到外部环境条件、加工过程和人为主观因素的影响。因此，急需建立一种简单高效的人参和西洋参鉴别方法。G-四链体（G-quadruplex)是由富含鸟嘌呤（G）的DNA或RNA序列形成的一类独特的核酸结构9-10 G-四链体有3种不同的拓扑结构，分别为平行式、反平式和混合式。CHENG等12 研究发现，不同的结构下G-四链体的稳定性不同，且与氯高铁血红素结合能力也不同13。稳定的G-四链体结构可在K*作用下与氯高铁血红素（Hemin)结合,形成具有类似辣根过氧化物酶活性的模拟酶（DNAzyme）,在H,O,存在的条件下催化ABTS由无色变为绿色4。根据这一原理已实现对金属离子15-17 、核酸及蛋白等小分子物质18-19 的检测。G-四链体形成的具有氧化酶活性的模拟酶（DNAzyme）与酶相比,具有热稳第一作者：硕士研究生（刘丽梅副教授为通信作者，E-mail：l i u l m 7 4 16 3.c o m）基金项目：吉林省科技发展计划项目（2 0 19 0 30 410 8 YY）；吉林省科技发展计划项目（YDZJ202201ZYTS515）收稿日期：2 0 2 3-0 4-0 3，改回日期：2 0 2 3-0 5-0 3定性、高催化效率、易于制备和修饰等特点2 0 。本实验将PCR技术与G-四链体功能特点结合，以人参与西洋参基因组DNA上的特异性 snp位点,设计了5 端含有G-四链体互补序列的上下游引物，通过PCR扩增目标序列，获得大量含G-四链体的双链DNA,并形成G-四链体结构的DNAzyme,建立了针对人参和西洋参的PCR与G-四链体联用的可视化鉴别方法。1材料与方法1.1材料与试剂本研究中的人参和西洋参样品均由国家参茸检验检测中心提供；引物，生工生物工程（上海）股份有限公司合成;PremixTaqTM，宝生物工程（大连）有限公司；ABTS、氯高铁血红素（Hemin），上海源叶生物科技有限公司；植物基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司;PCR产物纯化回收试剂盒，北京博迈德基因技术有限公司。1.2仪器与设备LX-100手掌型离心机，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司;ETC811型基因扩增仪,苏州东胜兴业科学仪器有限公司；梯度电泳分析仪、酶标仪，Bio-Rad公司；凝胶成像分析仪，德国耶拿公司;DNA/蛋白质分析仪，Quawell公司。2023 年第49 卷第17 期(总第48 5期)69食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES1.3实验方法1.3.1基因组 DNA的提取用植物基因组DNA提取试剂盒提取样品基因组DNA,DNA浓度通过DNA分析仪检测获得。1.3.2引物设计在NCBI上查找人参和西洋参的基因组序列,利用DNAMAN进行多序列比对。发现人参和西洋参在18S基因上存在snp位点，依据snp位点设计出用于特异性识别和扩增人参基因组序列的上下游引物。上游引物序列为：5-ATAACAATACCGGGCTGATAC-3；下游引物序列为：5-GCCAGTTAAGGACAGGAG-3,并在引物的5 端加上一段G-四链体的反向互补序列，修饰后的上游引物序列为：5-CCCACCCAC-CCACCCATAACAATACCGGGCTGATAC-3;修饰后的下游引物序列为：5-CCCACCCACCCACCCGCCAGT-TAAGGACAGGAG-3,其中 5-CCCACCCACCCACCC-3为G-四链体序列（G3T)3G3的反向互补,在K+的存在下可形成平行的G-四链体结构，且稳定性好，可视化反应结果明显2 1。1.3.3PCR反应体系和条件的优化以人参和西洋参的基因组DNA为模版进行PCR反应体系和条件的优化。首先在无模版的体系下进行PCR,检测1、2、3、4、5、6、8、10 mol/L引物浓度下引物二聚体的形成对G-四链体显色反应的影响；然后进行引物浓度与模版浓度之间的优化，引物浓度梯度设置为2、4.6、10 mol/L，模版浓度梯度为0.0 0 1、0.01、0.1、1、10 n g/L;最后确定最适的PCR退火温度，退火温度梯度设置为54、58、6 2、6 6、7 0。最终对比PCR和显色结果确定反应体系：10 LPremix Taq.DNA聚合酶,4 L DNA(10 ng/L)模版,1L上下游引物（10 mol/L），加双蒸水至20L。PC R 扩增条件:9 5预变性5min,95变性2 5s,54退火2 5s,72延伸2 5s,72延伸5min,30个循环。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳（12 0 V,40min）进行鉴定,利用凝胶成像系统对结果进行观察分析。1.3.4可视化反应体系的优化将用DNA纯化回收试剂盒回收得到的PCR产物加人2 0 L结合缓冲液（2 5mmol/LHEPESpH7.4、2 0 m m o l/L K C l、2 0 0 m m o l/L Na C l、质量分数0.05%TritonX-100、体积分数1%的DMSO与2 L不同终点浓度Hemin溶液充分混匀，终浓度梯度为0.005、0.0 1、0.1、0.5、1m m o l/L。9 5孵育5min完702023 Vol.49 No.17(Total 485)成G-四链体的折叠。之后4孵育8 min,使G-四链体与Hemin充分结合。加人2 0 L不同终点浓度的ABTS,终浓度梯度为3、10、30、45、6 0 mmol/L，以及2LH,0,（3%）室温避光反应至变色，酶标仪测定420nm处的吸光度值，选择最优的可视化结果进行后续的实验。1.3.5特异性检测为验证特异性，分别对4组人参样品和4组西洋参样品的基因组DNA进行提取。按照优化后的反应条件和最适体系进行PCR扩增与G-四链体联用可视化检测，测定42 0 nm处的吸光值，验证本实验方法的特异性。1.3.6灵敏度检测将提取的人参基因组DNA进行稀释,浓度梯度为：0.0 0 1、0.0 1、0.1、1、10 ng/uL，根据已优化好的反应条件和最适体系进行PCR扩增与G-四链体联用可视化检测，测定42 0 nm处的吸光值，以检测本实验方法的灵敏度。1.4数据处理数据处理采用Excel,柱状图和折线图的绘制采用GraphPad Prism8,并采用Adobe Photoshop软件对图片进行组合排列。每组实验数据进行3次重复。2结果与分析2.1PCR反应体系以及条件的优化2.1.1无模版情况下引物浓度对可视化显色效果的影响和普通PCR引物不同，本实验在PCR上下游引物的5 端加人了G-四链体反向互补序列进行修饰，这样可能会导致引物二聚体更易形成，并干扰实验结果。为了排除这一干扰因素,将引物稀释为1、2、3、4、5、6、8、10 mol/L的梯度浓度,对其进行G-四链体与PCR联用可视化检测。由图1-a可知,在不同引物浓度下,无模版的PCR体系在扩增后未产生目的条带，且引物浓度与引物二聚体的增加成正比；由图1-b可知，引物浓度对显色反应无明显影响，且在420nm下吸光度值之间无明显差异。因此，无模版情况下引物浓度对G-四链体与PCR联用可视化显色效果没有明显影响。2.1.2PCR体系中引物浓度对模版DNA浓度的优化根据PCR扩增的原理，在模版浓度不变时，引物浓度增加会导致PCR产物的增加,反之亦然。所以找到最适的引物浓度与其相对应的最适模版浓度对PCR反应的优化尤为重要。从图2 可以看出，当引物浓度研究报告abpM123456782000180038250100b0.15-0.10o0.05-0a-PCR产物凝胶电泳图;b-G-四链体可视化检测显色效果和42 0 nm处吸光值图1无模版PCR体系里引物浓度对G-四链体显色反应的影响Fig.1 Effect of primer concentrations in a PCR reactionsystem without templates on the G-quadruplex注：M-Marker DL2000;1 8分别为1、2.3、4、5.6、8、10 mol/L。为10 mol/L时，可检测出最低浓度为0.1ng/L的模版，因此选择引物浓度为10 mol/L作为后续实验的引物浓度。且在此引物浓度下，模版浓度为10ng/L时,电泳图的目的条带最为明显,所以选择模版浓度为10 ng/L进行后续的实验。bpM1 2345 6M1 2345 62000588250100aM123456M 123456Cda-2mol/L;b-4mol/L;c-6 mol/L;d-10 mol/L图2 PCR反应体系中引物浓度与模版浓度之间的优化Fig.2 Optimization of the ratio of primer totemplate in a PCR reaction system注：M-MarkerDL2000;1-阴性对照;2 6 为0.0 0 1、0.0 1、0.1、1、10 ng/L2.1.3PCR反应退火温度的优化退火温度也是PCR反应中重要的影响因素,退火温度的高低会影响PCR产物的产生，找到最适合反应体系的退火温度至关重要。在以上优化条件的基础上将退火温度梯度设置为54、58、6 2、6 6、7 0，观察反应结果。图3为退火温度为54、58、6 2、6 6、70下PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，可见退火温度为54时，条带最明显，因此选择退火温度为54进行后续实验。bpM12345678910112.00010007505003456812colorings reaction10引物浓度/(mol/L)b250100Fig.3Optimization of PCR reaction annealing temperature注：M-MarkerDL2000;1-阴性对照；2-54人参PCR产物；3-54西洋参PCR产物;4-58 人参PCR产物；5-58 西洋参PCR产物;6-6 2 人参PCR产物；7-6 2 西洋参PCR产物；8-66人参PCR产物;9-6 6 西洋参PCR产物;10-7 0 人参PCR产物;11-7 0 西洋参PCR产物2.2可视化反应体系的优化2.2.1Hemin终浓度的优化将反应体系中的Hemin终浓度设置为0.0 0 5、0.01、0.1.0.5、1m m o l/L 进行反应，对比显色结果得到最适的Hemin浓度。如图4-a可见，在42 0 nm处随着Hemin浓度的增高，人参PCR产物吸光度值不断增加，当浓度 0.5mmol/L时增加较少,说明G-四链体产生的量趋于饱和。且观察对比图4-a中人参组与西洋参组的显色变化，在Hemin浓度为0.5mmol/L时有明显差异，所以Hemin终浓度定为0.5 mmol/L。2.2.2ABTS终浓度的优化将反应体系中的ABTS终浓度设置为3、10、30、45、6 0 m m o l/L 进行反应，对比显色结果得到最适的ABTS浓度。如图4-b可见随着ABTS浓度的增加，在42 0 nm处人参PCR产物的吸光度值先是上升，到达30 mmol/L浓度时开始下降，且观察对比图4-b中人参组与西洋参组的显色变化，在ABTS浓度为30mmol/L时显色有明显差异,所以ABTS终浓度选择为30 mmol/L。2023 年第49 卷第17 期(总第48 5期)图3PCR反应退火温度的优化71食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIESab0.570.4-80.30.20.1-00.0052.3特异性检测按照已优化好的反应体系，将4组人参样品和4组西洋参样品的基因组DNA作为模板,进行PCR反应,再对PCR反应产物进行G-四链体显色反应。如图5可见4组含有人参基因组DNA的反应体系均有明显的颜色变化,且4组含有西洋参基因组DNA的反应体系无明显颜色变化；在42 0 nm处的吸光度值对比,人参组和西洋参组也有明显差异。因此表明本实验的PCR与G-四链体联用可视化鉴别人参与西洋参的方法具有很高特异性。0.570.480.30.20.1-空白12345678图5特异性检测Fig.5Detection of specificity注：1 4为人参样品；5 8 为西洋参样品2.4灵敏度检测根据已优化好的体系，分别将浓度为0.1、0.5、1、5、10 n g/L的人参基因组DNA作为模板，进行PCR反应,对PCR反应产物进行G-四链体显色。如图6 可知，含有1、5、10 ng/L浓度人参基因组DNA的反应体系显色反应有变化,且在42 0 nm处的吸光度722023 Vol.49 No.17(Total 485)0.57西洋参PCR产物西洋参PCR产物+人参PCR产物0.4-+人参PCR产物80.30.2-0.1-00.010.1Hemin浓度/(mmol/L)图4Hemin浓度、ABTS浓度的优化Fig.4Optimization of Hemin and ABTS concentration0.870.6-20.4-0.2-0空白0.1模板浓度/ng/L)图6 灵敏度的检测Fig.6SSensitivitydetection3讨论近年来随着科学技术的发展，人参与西洋参的鉴别方法也在逐渐进步，越来越多的现代生物技术被应用到其中2】，包括DNA条形码鉴定2 3、DNA分子遗传标记技术2 4、蛋白质指纹图谱分子鉴定技术等2 。但都存在着不同的缺点，无法做到简便快速地鉴别人参与西洋参。G-四链体作为一种具有氧化酶活性的模拟酶,具有热稳定性、催化效率高，易于制备和修饰等优势2 0 ,已被广泛用于核酸、蛋白或小分子的检测中,且检测效率高、特异性强,适用于现场的0.5a-Hemin浓度;b-ABTS浓度一3值与空白对照有明显差异；而含有0.1、0.5ng/L人参基因组DNA的反应体系显色反应没有明显变化,在420nm处吸光度值与空白对照无明显差异。所以当样品中含有1 ng/L的人参基因组DNA时,即可通过本实验的G-四链体与PCR联用可视化方法鉴别检测。10ABTS浓度/(mmol/L)30456010参考文献研究报告快速检测2 6-2 7 。但目前G-四链体的研究和应用还（G,T),G,可形成平行的G-四链体结构,且稳定存在一定的局限性,例如,在金属离子的检测中,所能性好,具有较高的过氧化物酶活性。检测的金属离子种类过少；比色传感器中，可用显色本实验针对人参与西洋参基因组DNA,将PCR底物只有几种；缺乏对优化传感系统和消除基质效应技术与G-四链体功能特点结合，建立了鉴别人参和的研究等。在以后研究中如能更好地优化和发挥G-西洋参的PCR与G-四链体联用的可视化鉴别方法，四链体的作用,可将其应用到更广泛的领域中去。灵敏度可达0.1ng/L。且该方法具有稳定性好、操PCR作为一种核酸扩增技术,可通过变性、退作简便、便于观察等优点，为中药材鉴定提供了新的火、延伸组成的多个循环反应使模版序列以指数倍扩思路。增,在核酸检测领域中得到广泛应用。传统的PCR结果分析一般采用琼脂凝胶电泳技术，但存在操作复杂、结果无法直接观察等缺点。本实验将G-四链体与PCR技术的优势相结合，设计了5 端含有G-四链体反向互补序列的PCR引物，通过对目的序列的扩增产生大量的G-四链体序列，最后G-四链体催化底物显色使PCR结果可在肉眼下直接观察。综上所述，通过将G-四链体与核酸扩增技术相结合，我们建立了一种可视化鉴别人参与西洋参的方法，相较于目前已有的人参和西洋参的鉴别方法，耗时更短、灵敏度更高、成本更加低廉。且PCR的引物设计简单，使该方法更易于普及。但对于参类产品的鉴定中，相比于实验样品DNA的提取效率可能会更低，显色结果颜色更浅，肉眼比色鉴定时灵敏度可能会变低；显色反应时ABTS变色的时间没有明确的标准,需要时刻进行观察;G-四链体在反应中生成的效率也会受到结合缓冲液pH、阳离子、温度等因素的影响，对实验的操作环境要求较高。4结论目前,利用G-四链体与PCR联用鉴别人参与西洋参的相关研究尚未报道。本实验所建立的针对人参与西洋参的PCR与G-四链体联用的可视化鉴别方法，相比于其他生物技术鉴别方法，无需测序和电泳，在室温下便可用肉眼直接观察结果。含有人参基因组DNA的样品，在引物作用下通过PCR扩增，获得大量含G-四链体的双链DNA，并形成G-四链体结构的模拟酶，催化ABTS显色。在本实验中G-四链体的形成是最后达到可视化鉴别的关键，所以如何设计适合的引物使G-四链体更好地形成是本实验的重点。G-四链体具有多种拓扑结构，包括平行结构、反平行结构和杂合结构等2 6 。不同序列的C-四链体其结构和DNAzyme 活性都不同，根据现有的对G-四链体结构与DNAzyme活性的研究结果2 1,本实验选择的G-四链体序列为1董晓强，董文天，洪霞，等.三七、人参和西洋参化学成分与药效学之间的关系J.承德医学院学报，2 0 11，2 8（3）：30 7-30 9.DONG X Q,DONG W T,HONG X,et al.Relationship betweenchemical constituents and pharmacodynamics of Panax notoginseng,Panax ginseng and Panax quinquefolium J.Journal of ChengdeMedical College,2011,28(3):307-309.2胡敏，李毓群，项雪燕.人参、西洋参和三七的药效比较J.海峡药学，2 0 11,2 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132013,China)ABSTRACT Panax ginseng and Panax quinquefolium are commonly used as precious traditional Chinese medicines in China.Becausethey are related species of Panax ginseng,they are similar in morphology and chemical composition.However,the medicinal propertiesand efficacy of Panax ginseng and Panax quinquefolium are quite different,and they cannot be mixed in clinical practice,so it is particu-larly important to identify them.In this study,a large number of G-quadruplex-containing double-stranded DNA was amplified by PCR(polymerase chain reaction)with primers at the 5 end of the specific snp site on the genomic DNA of Panax ginseng and Panax quinque-folium,which was denatured and combined with hemin to form a DNA enzyme with peroxidase activity(DNAzyme),catalyzed H,O,and2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6sulfonic acid)diamine（A BT S)c h a n g e s i n c o l o r.T h r o u g h t h e o p t i mi z a t i o n o f t h e PCR s y s t e mand color development system,this study could quickly and simply identify Panax ginseng from Panax quinquefolium with a sensitivity of0.1 ng/L.A visual discrimination method of PCR and G-quadruplex for the identification of Panax ginseng and Panax quinquefoliumwas established,which provided a new way for human participation in the identification of Panax ginseng and Panax quinquefolium.Key words polymerase chain reaction(PCR);G-quadruplet;Panax ginseng;Panax quinquefolium;visual discriminationing application J.Advances in Biochemical Engineering/Biotech-nology,2020,170:85-106.21卢宇，关一夫.不同的G四链体结构对DNAzyme活性的影响J.中国生物化学与分子生物学报，2 0 16，32（7：8 2 3-8 2 9.LU Y,GUAN Y F.Effects of different G-quadruplex structures onthe DNAzyme activity J.Chinese Journal of Biochemistry and Mo-lecular Biology,2016,32(7):823-829.22查琳，王影，杨怀雷，等.现代生物技术鉴定人参属药材的研究进展J.人参研究，2 0 19，31（6）：6 1-6 4.ZHA L,WANG Y,YANG H L,et al.Research progress of DNABarcoding in medicinal plants J.Ginseng Research,2019,31(6):61 64.23 YAO H,SONG J Y,LIU C,et al.Use of ITS2 region as the uni-versal DNA barcode for plants and animalsJ.PLoS One,2010,5(10):e13102.24王戎博，田惠丽，王洪涛，等.开发indel分子标记对人参与西洋参的鉴别研究J.中国中药杂志，2 0 18，43（7）：1441-1445.WANG R B,TIAN H L,WANG H T,et al.Development of indelmarkers for molecular authentication of Panax ginseng and P.quin-quefolius J.China Journal of Chinese Materia Medica,2018,43(7):1441-1445.25赵皓.生物技术及近红外光谱技术在中药鉴别及分析中的应用观察J】.中国实用医药，2 0 15，10（2 4）：2 9 1-2 9 2.ZHAO H.Application of biotechnology and near infrared spectros-copy in identification and analysis of traditional Chinese medicineJ.China Practical Medicine,2015,10(24):291-292.26刘健慧，孙炜，封龙宽，等.G-四链体特性及其基于核酸辅助检测方法的研究进展J.食品安全质量检测学报，2 0 2 1，12(2):415-422.LIU JH,SUN W,FENG L K,et al.Review of characteristics ofG-quadruplex and development of its nucleic acid assisted detectionmethodJ.Journal of Food Saf