病毒载体在神经科学研究中的应用进展.pdf
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1、Chinese Journal of Neuroanatomy志杂解经部神立2023,39(3):365369病毒载体在神经科学研究中的应用进展朱昌磊,刘刘慧,陈系羽,杨雁灵2*,王亚云1*(空军军医大学基础医学院:1,神经系统疾病线粒体可塑性实验室,国家级基础医学实验教学示范中心,西安7 10 0 32;2.损伤与修复军队重点实验室,第一附属医院肝胆胰脾外科暨,西安7 10 0 32)摘要病毒载体是当前神经科学研究的重要工具与手段。本综述重点介绍神经科学研究中较为常用的重组腺相关病毒、慢病毒、狂犬病病毒、伪狂犬病病毒、单纯疱疹病毒、犬腺病毒、水泡性口角炎病毒等7 种病毒载体的研究工作,通过举
2、例解析其在神经通路标记、目的基因过表达/敲低/敲除调控、光遗传与化学遗传操纵以及基因治疗等方面的应用策略及验证方法,旨在为神经科学研究者避选病毒载体提供思路与依据。关键词重组腺相关病毒;慢病毒;狂犬病病毒;神经示踪;神经标记D0I:10.16557/ki.1000-7547.2023.03.019病毒(virus)是由核酸分子和或蛋白质组成的非细胞形态生命体,必须感染宿主细胞才能够进行复制和组装。重组病毒是将原来的病毒结构通过改造使其携带外源性目的基因并侵染靶细胞,从而实现体内(invivo)或体外(in vitro)水平的基因操作。2 0 世纪7 0 年代,Cole等 改造SV40病毒做成第
3、一个病毒载体,从此以后,病毒载体就成为当前神经科学研究的重要工具与手段,在神经通路顺行、逆行、跨突触标记、目的基因过表达、敲低、敲除、敲人调控、特定神经元的光遗传学与化学遗传学激活或抑制、以及基因治疗等方面发挥出了令人瞩目的效果。本综述重点介绍神经科学研究中较为常用的病毒载体的研究工作,并通过举例解析其在神经通路标记、目的基因过表达/敲低/敲除调控、光遗传与化学遗传操纵以及基因治疗等方面的应用策略及验证方法,旨在为神经科学研究者在未来科研工作中述选病毒载体提供思路与依据。1.重组腺相关病毒载体在神经科学研究中的应用重组腺相关病毒载体(recombinant adeno-associatedvi
4、-rus,r A A V)在非致病野生型腺相关病毒(adeno-associatedvi-rus,A A V)结构基础上改造而成,因其免疫原性低且和安全性高2.3,已成为神经科学领域最常用病毒载体。rAAV基因组主要包括复制酶蛋白基因(replicaseproteingene,Re p)和衣壳蛋白基因(capsid proteingene,Ca p),两侧有反转末端重复序列(inverted terminal repeat,IT R)。其中,Cap编码三种病毒蛋白(virusproteins,VPs),分别是VP1、VP2 和VP3,它们的蛋白产物以1:1:10 比例组成病毒的衣壳结构4.5。
5、迄今为止,已从宿主中鉴定出13个血清型(rAAV1-13)和超过100个变异体,神经系统最常用血清型为rAAV2/1、r A A V 2/5、r A A V2/8 和rAAV2/96。利用rAAV可进行神经通路标记、目的基因过表达/敲除/敲低调控、光遗传与化学遗传性操纵以及基因治疗等研究。1.1神经通路标记rAAV最常使用的是神经通路顺行标记。一般rAAV携带荧光蛋白基因,通过局部注射,2 3周后即可实现神经元不跨突触的顺行标记。现在更常用的是rAAV基于Cre-Loxp系统的神经通路顺行标记。例如2 0 16年Zingg等7 设计携带Cre重组酶的AAV2/1-hSYN-CRE病毒,将其注射
6、人Ai14报告小鼠的初级视皮层V1区,4周后小鼠注射侧对侧的上丘和纹状体神经元表达明亮的红色荧光。该技术解析如下:Cre重组酶于198 1年从P1噬菌体中发现,能识别特异DNA序列,即loxP位点,使loxP位点间的基因序列被删除或重组;Ai14报告小鼠是Cre依赖小鼠,在其基因组内设计一个loxP侧翼的STOP盒,防止CAG启动子驱动的红色荧光蛋白变体(tdTomato)的转录;Ail4小鼠被携带Cre基因的病毒感染后,免疫荧光发现小鼠表达tdTomato红色荧光。携带retro的rAAV可进行神经通路的逆行标记。rAAV2-retro是在AAV2的VP1衣壳基因的N587和R588之间插人
7、外源性十肽构成的8 。2 0 16 年Tervo等9 将携带3种不同颜色荧光蛋白的rAAV2-retro分别注射人杏仁核(A A V-r e t r o-Ru b y 2)、丘脑(rAAV-retro-tdTomato)、边缘下区(r A A V-r e t r o-EG FP)2 周后取材,利用荧光共聚焦显微镜观基金项目:国家自然科学基金(8 18 7 0 415)*通信作者:杨雁灵电话:137 0 92 46 6 56,E-mail:y a n g y a n l f m m u.e d u.c n;王亚云电话:136 7 916 8 991,E-mail:3662023年5月第39 卷第
8、3期神经解学杂志,察,可见纹状体神经元同时显示Ruby2红宝石色荧光、tdTo-mato红色荧光、ECFP绿色荧光。以上结果证实,纹状体神经元接受来自以上三个部位的神经传递。rAAV携带PHP.eB或PHP.S可分别实现外周组织向中枢神经系统或外周神经系统的顺行性标记。2 0 16 年Chan等10 在AAV9基因组58 9位点处插人七聚体QAVRTSL,将其命名为PHP.S;或在58 7 位点处将AQ突变为DG,之后再在58 9位点处插人七聚体TLAVPFK,将其命名为PHP.eB。分别将rAAV-PHP.eB和rAAV-PHP.S进行静脉注射,结果显示,前者能够标记6 9%的大脑皮质神经元
9、和55%的纹状体神经元,后者能够标记8 2%的背根神经节及心神经节神经元。1.2目的基因过表达/敲除/敲低调控rAAV可直接携带外源基因进行目的基因的过表达调控。2 0 13 年 Chung 等1首先观察到抑郁症小鼠外侧缰核(lateral habenula,LH b)内型钙/钙调素依赖性蛋白激酶II(formof calcium/calmod-ulin-dependent protein kinase type II,CAMKII)表达显著上调,之后构建了重组病毒AAV2-CAMKII,并将其注射人正常小鼠双侧LHb,3周后利用基于CAMKII抗体的免疫荧光染色检测结合WesternBlot
10、检测,验证双侧LHb过表达BCAMKII,同时利用行为学方法检测发现小鼠出现明显抑郁样行为。2 0 19年Li等12 构建重组病毒AAV2-hTau-ECFP,将其注射人正常小鼠单侧海马CA3区,4周后利用基于hTau抗体的免疫荧光染色检测结合WestermBlot检测过表达,同时利用行为学方法检测发现小鼠出现明显学习和记忆受损。rAAV可携带针对目的基因的干扰RNA片段进行目的基因下调调控。2 0 2 0 年Wang等13 将编码神经元五聚体蛋白2(neuronal Pentraxin 2,NPTX2)小干扰 RNA(small inter-feringRNA,s i RNA)的DNA片段装
11、载人rAAV,然后将AAV-nPTX2-shRNA注人正常小鼠背侧海马CA1区,3周后利用RT-PCR法验证海马区nPTX2基因的mRNA表达水平下调。1.3大光遗传与化学遗传性操控光遗传学技术(optogenet-ics)是借助遗传学手段,将能够响应光照刺激的通道蛋白递送到特定细胞,然后通过光照对该神经元进行激活性调控或者抑制性调控。常用兴奋性调控光敏感通道蛋白及其激发光组合为:ChR2+470nm;常用抑制性调控光敏感通道蛋白及其激发光组合为:eNpH3.0+590nm。化学遗传学技术是利用只由特定药物激活的受体(designerreceptors exclusivelyactivated
12、 by designer drugs,D REA D D s),将Gq或Gi蛋白递送到特定细胞,然后通过特定激活药物N-氧化氯氮平(clozap-ine N-oxide,CNO)作用,实现对神经元的兴奋性激活或者抑制性调控。常用兴奋性激活的结构是hM3Dq+CNO,常用抑制性调控的结构是hM4Di+CNO。2017年Mu等14 将AAV-hSyn-eNpHR3.0-EYFP注射到正常小鼠双侧臂旁核(parabrachialnucleus,PBN),1周后对PBN部位进行593nm光照,电生理膜片钳技术验证了PBN神经元的兴奋性受到抑制;同时,研究者将AAV-EF1-ChR2(H 134R)-E
13、YFP注射到正常小鼠双侧PBN,1周后对PBN部位实施47 3nm光照,电生理膜片钳技术验证了PBN神经元的兴奋性受到激活。该研究小组进一步将AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine注射人正常小鼠双侧PBN,1周后以1mg/kg剂量腹腔注射CNO,CNO注射后30 45min进行行为学检测,结果显示化学遗传学沉默PBN神经元引起小鼠搔抓样行为的减少。1.4基因治疗AAV载体已经用于基因治疗。脂蛋白脂酶缺乏症(lipoprotein lipasedeficiency,LPLD)是一种遗传性疾病15,目前尚无有效的治疗药物。2 0 16 年Gaudet等16 选择AAV1载体
14、装载治疗基因LPLS447X变异体,然后将其设计成靶向肌肉细胞的药物,经肌肉注射给14名LPLD患者。注射后5年内所有患者随访显示无安全性问题,其中7 例患者在基因治疗后3 12 周内空腹总胆固醇下降40%,达到临床治愈。2 0 18 年Colella等17 报道了一种双AAV载体基因治疗技术,即使用双载体方法,用两种AAV携带目的基因的不同片段,表达时通过基因片段的自修复,在细胞内完成全长基因的表达。双AAV载体可以有效解决单个AAV载体携带基因片段长度有限的问题。利用该技术已经对临床耳蜗、视网膜等基因缺陷遗传病进行治疗。但是目前该技术在神经系统疾病中的应用尚未见报道。2.慢病毒载体在神经科
15、学研究中的应用慢病毒载体(lentivirus,LV)是基于人类免疫缺陷病毒1(h u ma n i mmu n o d e f i c i e n c y v i r u s 1,H IV-1)进行改造的产物,平均直径为8 0 10 0 nm,基因组带有gag、p o l 和 enw基因。其中,gag基因编码病毒衣壳的多蛋白组分,pol 基因编码病毒复制相关的逆转录酶、蛋白酶、整合酶,enu基因编码病毒包膜糖蛋白。LV具有高达9kb的包装容量,故而在神经科学研究中主要应用于过表达目的基因18 ,或者对表达目的基因的神经元进行特异性消融两方面,而一般不用于神经通路标记和光遗传学及化学遗传学操纵
16、。2.1目的基因过表达调控2 0 0 4年Azzouz等19 将血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEG F)装载人慢病毒中,再将LV-VEGF注射到肌萎缩侧索硬化症(amyo-trophic lateral sclerosis,A LS)模型小鼠的面肌和排肠肌中,1周后利用WesternBlot验证面肌和腓肠肌大量表达VECF,且面肌和腓肠肌中运动相关神经元的数量明显增加。2.2表达目的基因的神经元的特异性消融2 0 18 年Koba-yashi等2 0 合成两种LV,一个是高效逆行基因转移载体(highly efficient retr
17、ograde gene transfer,H i Re t),一个是神经元特异性逆行基因转移载体(neuron-specific retrograde genetransfer,Ne u Re t)。H i Re t 载体内含长链狂犬病毒糖蛋白基因和短链水泡性口角炎病毒糖蛋白基因;而NeuRet载体内含短链狂犬病毒糖蛋白基因和长链水泡性口角炎病毒糖蛋白。研究人员将IL-2R基因分别装载人HiRet载体和NeuRet载体,之后将LV-IL-2R-HiRet和LV-IL-2R-NeuRet注射人正常小鼠脑区,行为学证实小鼠的视觉辨别能力和运动反应能力均出现明显损伤,而这些结果是因为所有表达IL-2
18、R基因367朱昌磊:病毒载体在神经科学研究中的应用进展的神经元被消融(eliminate)所导致。3.狂犬病毒载体在神经科学研究中的应用狂犬病毒(rabiesvirus,RV)的基因组为单链RNA,具有高度的嗜神经性2 1。RV主要用于神经通路的逆行标记。RV携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescentpro-tein,EG FP)可以实现对神经元的精细标记。2 0 0 7 年Wicker-sham等2 2 用ECFP基因取代RV原有糖蛋白基因构建了新的病毒RV-SADG-ECFP,将其注射到正常小鼠脑中,6 d后在荧光共聚焦显微镜下可见感染该病毒的神经元显示出明
19、亮的树突和轴突结构。2 0 19年Sun等2 3 将敲除糖蛋白基因的狂犬病病毒RV-G 注射到正常小鼠的胭淋巴结中,16 d后在基底神经节和下丘脑可见荧光标记,由此说明RV-G可以从基底神经节和下丘脑神经元对胭淋巴结进行逆行标记。4.伪狂犬病病毒载体在神经科学研究中的应用伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)直径为2 0 0 250nm,球形双链DNA,带有包膜,可插人大的外源基因,而野生型PRV会引起致命感染2 4.2 5。常用毒株包括Becker和Bartha两种毒株,Bartha毒株因其毒性小和从外周神经系统传递到中枢神经系统速度快而受到青睐2 6 。PRV主要用于
20、神经通路跨突触顺行和逆行标记PRV结合CMV启动子可进行神经通路跨突触顺行标记。2 0 0 1 年DeFalco等2 7 报道将PRV-CMV-tdTomato注射到小鼠弓状核中,1周后在杏仁核中可见荧光标记神经元,以上结果说明PRV-CMV可用于神经通路跨突触顺行标记。PRV突变体IE180-null可用于神经通路跨突触逆行标记。2 0 14年Oyibo等2 8 通过删除PRV基因组中主要转录调节因子IE180得到突变病毒IE180-null,将其注射人小鼠听皮层中,3周后在膝状体发现表达荧光的神经元,以上结果说明PRV突变体IE180-null可用于神经通路跨突触逆行标记。PRV可对调控外
21、周组织的神经核团进行逆行标记。2018年Yao等2 9 将PRV-EGFP注射到小鼠膀胱壁中,3d后脑内排尿相关皮质神经元表达强烈荧光。2 0 2 2 年Papazoglou等30 设计了携带Cre的改造PRV病毒载体Ba2017,将其注射人小鼠胰腺中,2 4 48 h可在胰岛细胞表达Cre重组酶,此时脊髓和脑内无荧光表达,7 2 h后小鼠胰岛内荧光消失,转而在脊髓中间带外侧核(interomediolateralnucleus,IML)和下丘脑外侧区(lateralhypothalamic area,LH A)可见荧光标记神经元。以上结果说明PRV可对调控外周组织的神经核团进行逆行标记5.单
22、纯疱疹病毒载体在神经科学研究中的应用单纯疱疹病毒(herpes simplexvirus,H SV)最初分离自一例急性HSV脑炎患者脑中,HSV基因组为线性双链DNA,主要有HSV-1型和HSV-2型。H129株因其具有顺行跨突触特点而被用于神经通路标记,但是由于其在轴突末端被吸收而被淘汰31。现在常用HSV是H306和H8株,分别应用于跨突触逆行标记和顺行标记。2019年Su等32 设计并合成了胸苷激酶(thymidineki-nase,T K)和神经毒力因子(neurovirulencefactor,ICP34.5)双重缺失的H129重组体,命名为H306。研究者将H306注射人小鼠大脑皮
23、层,2 d后在下丘脑外侧区可见荧光标记神经元,以上结果说明H306可用于神经通路跨突触逆行标记。2020年Su等33 又利用特洛伊木马式策略设计合成HSV与AAV的嵌合体,命名为H8,将其注射人小鼠伏隔核中3d后可见丘脑室旁核表达荧光,以上结果说明H8可用于神经通路跨突触顺行标记。6.犬腺病毒载体在神经科学研究中的应用犬腺病毒(canineadenovirus,CA V)包括两种血清型CAV-1和CAV-2,其直径约为7 0 90 nm,基因组为双链线性DNA34。基于CAV构建的相关载体报道很少。2 0 2 0 年Lavoie等35 将CAV-GFP注射人小鼠蓝斑(locus coerule
24、us,LC),在中脑神经元发现绿色荧光的表达,以上结果说明CAV-CFP可用于神经通路跨突触逆行标记7.水泡性口角炎病毒载体在神经科学研究中的应用水泡性口角炎病毒(vesicular stomatitisvirus,VSV)包含编码核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)、磷蛋白(phosphoprotein,P)、基质(matrix,M)蛋白、G蛋白和大聚合酶(largepolymer-ase,L)基因。N蛋白紧紧包裹RNA基因组形成抗核酸酶的核衣壳,G蛋白使VSV能够感染大多数哺乳动物细胞类型36 2011 年Beier等37 将淋巴细胞性脊索脑膜炎病毒(lym-phocytic cho
25、riomeningitis virus,LCM V)的G蛋白基因装载人VSV,单侧注人小鼠眼球玻璃体中,4d后在小鼠外侧膝状体可见表达荧光的神经元,以上结果证明VSV-LCMV-G可以进行跨突触顺行标记。2 0 15 年Mundell 等38 将狂犬病病毒糖蛋白(rabiesvirusglycoprotein,RA BV-G)基因装载人VSV,单侧注射到小鼠大脑皮层,3d后在小鼠右侧顶盖前区及视网膜可见表达荧光的神经元,以上结果证明VSV-RABV-G可用于顺行跨多突触标记神经元。2 0 2 0 年Lin等39 将VSV改造为VSV-NR7A并将其注射到小鼠大脑前嗅核,1d后在小鼠伏隔核发现表
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