毕赤酵母发酵耦合多糖酶解一步法制备结冷胶寡糖.pdf

食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIESD0I:10.13995/ki.11-1802/ts.034316引用格式：李宏雨，施旭，詹晓北，等.毕赤酵母发酵耦合多糖酶解一步法制备结冷胶寡糖J.食品与发酵工业，2 0 2 3，49（17）：16-22.LI Hongyu,SHI Xu,ZHAN Xiaobei,et al.One-step production of gellan oligosaccharides by Pichia pastoris fermenta-tion coupled with polysaccharide degradation J.Food and Fermentation Industries,2023,49(17):16-22.毕赤酵母发酵耦合多糖酶解一步法制备结冷胶寡糖李宏雨,施旭,詹晓北，朱莉，蒋芸，高敏杰*（江南大学生物工程学院，江苏无锡，2 1412 2）摘要化学法与酶法是多糖降解制备低聚糖的常用手段，化学法制备的产物往往组分复杂难以获得单一聚合度的低聚糖，而酶法因其特异性高，能得到均一性高的目标产物，从而成为近年来研究热点。该研究首先优化了酸解生产结冷胶寡糖的工艺条件，优化得到的酸水解条件为底物质量浓度5.0 g/L、H C l浓度0.5mol/L、水解3h；进一步提出了发酵耦合酶解一步法制备结冷胶寡糖策略，结果表明，发酵初始酵母粉添加量2 0 g/L、甲醇添加量1%、发酵初始pH6.0为结冷胶裂解酶的最佳发酵条件；发酵初始添加2.0 g/L结冷胶，发酵水解9 6 h为最佳酶解条件。最后通过傅里叶变换红外光谱与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术对2 种降解方式的产物进行了对比分析。酸水解后得到了聚合度为5、8、12 的结冷胶寡糖，酶解后得到了聚合度为4的单一结冷胶寡糖，酶解产物中出现了C一C结构，酸解产物结构没有变化，该文为结冷胶寡糖制备及探究其功能活性提供了一个可行的途径。关键词结冷胶；酶降解；酸水解；结冷胶寡糖；聚合度结冷胶是鞘氨单胞菌产生的一种胞外多糖，它是由3)-D-葡萄糖-（14)-D-葡萄糖醛酸-(14)-D-葡萄糖-(14）-L-鼠李糖-(1为重复结构组成的线性阴离子杂多糖 。结冷胶具有良好的安全性、凝胶性、互溶性、稳定性等优越的性能，不仅在食品领域，还在生物医药、化工、环境等行业得到广泛的应用2-4。目前,低聚糖的功能活性已引起广泛关注。例如，已有研究报道了-1,3-葡寡糖和卡拉胶低聚糖具有抗肿瘤活性5-6 ,壳寡糖表现出了植物的抗病性7 。具有不同结构性质的寡糖可能具有不同的生物活性,其中聚合度被认为是对分子功能特性影响最大的参数之一。特定聚合度寡糖可能具有特定的功能活性，如麦芽七糖可以作为蛋白质和细胞的特异性识别标记 1。此外，一些寡糖的功能活性与聚合度大小呈现了相关性,如壳寡糖对超氧自由基的清除能力也与聚合度大小成正相关 。近年研究者发现利用酸水解结冷胶得到的低聚结冷胶具有植物的抗菌活性10 ,并且能够促进植物生长和改善植物叶片品质1,结冷胶寡糖也被发现是一种潜在的益生元2 。大多数关于结冷胶寡糖的应用和生物活性的研究主要是基于混合形式的，因此降解结冷胶制备特定聚合度结冷胶寡糖具有重要意义。传统的低聚糖第一作者：硕士研究生（高敏杰教授为通信作者，E-mail:）基金项目：国家重点研发计划“绿色生物制造”重点专项“重要氨基酸工业菌种系统改造与产业示范”项目（2 0 2 1YFC2100900收稿日期：2 0 2 2-11-16，改回日期：2 0 2 2-12-18162023 Vol.49 No.17(Total 485)生产方法多是对多糖进行化学降解和酶法降解。化学降解被认为是多糖降解的经典方法，化学降解具有操作简便、成本低等优点13,但化学降解对环境污染大且得到的产物组分往往比较复杂,阻碍了后续的分离纯化。酶法降解因为其特异性高而能得到均一的目标产物,且反应温和得到了越来越多的关注。酶法降解可以有效克服化学降解产物成分复杂的缺点，简化特定聚合度结冷胶寡糖生产的过程，提高结冷胶寡糖定向生产的实用性。本研究利用前期实验室构建的含有结冷胶裂解酶基因的重组毕赤酵母进行外源表达，得到结冷胶裂解酶,并开发了毕赤酵母发酵耦合多糖酶解一步法制备单一聚合度结冷胶寡糖的方法一一在结冷胶裂解酶发酵初始添加结冷胶，以达到生产结冷胶裂解酶并实时降解多糖,实现一步制备结冷胶寡糖的目的,并将酶解制备的结冷胶寡糖与酸解结冷胶寡糖加以对比，分别利用傅里叶变换红外光谱（Fourier transforminfrared spectrometer，FT I R）与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrixassisted laserdesorptionioni-zation time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)来解析2 种产物在结构与分子质量方面的差异。以期为制备单一聚合度寡糖,进一步研究特定聚合度结冷胶寡糖功能活性提供理论依据。研究报告积分数)对毕赤酵母生长、结冷胶裂解酶酶活力的影1材料与方法响，以寻求重组毕赤酵母的最佳发酵条件。1.1试剂与仪器1.5毕赤酵母发酵耦合多糖酶解一步法制备结冷胶低酰基结冷胶（食品级）购自江苏仟泊生物工程寡糖及条件优化有限公司；蛋白陈、酵母粉、甘油和无水甲醇等购自国称取适量结冷胶添加至BMMY液体培养基中，药集团化学试剂有限公司。收集按1.3节中所述方法获得的种子液中的菌体接RE-5205型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；种至添加了结冷胶的BMMY培养基中，30、3K15型高速冷冻离心机，德国Sigma公司；ultrafleX-200r/min培养至发酵结束。保持其他条件不变，调treme型质谱仪，美国BrukerDaltonics公司；MULTI-整发酵初始结冷胶添加量为0、0.5、1.0、1.5、2.0、SKANFC型酶标仪，美国ThermoFisher Scientific公2.5、3.0 g/L,研究发酵初始结冷胶添加量对结冷胶司；NEXUS型傅里叶变换红外光谱仪，美国Nicolet寡糖产量的影响。以初始结冷胶添加量2%，其他条公司。件不变,研究发酵时间对结冷胶寡糖产量的影响。1.2培养基1.6酸水解结冷胶条件优化酵母浸出粉陈葡萄糖培养基（yeast extract pep-1.6.1底物浓度优化tonedextrosemedium，YPD）（g/L）：酵母粉10，蛋白分别称取1、3、5、7 g/L的食品级低酰基结冷胶陈2 0，葡萄糖2 0（固体培养基加人琼脂粉2 0）。溶于适量蒸馏水中，9 0 水浴加热至结冷胶完全溶甘油缓冲复合培养基（bufferedglycerol-complex解,补加蒸馏水与浓盐酸至终溶液中HCI浓度为medium，BM G Y）（g/L）：酵母粉10,蛋白陈2 0，YNB0.5mol/L。将配制好的水解液置于7 0 水浴锅中13.4,生物素410-,甘油10,K,P04缓冲液浓度加热水解3h。水解结束后分别取样待后续薄层色谱100 mmol/L,pH 6.0。分析。诱导表达培养基（buffered methanol-complex me-1.6.2HC1浓度优化dium，BM M Y）（g/L）：酵母粉10，蛋白陈2 0,YNB称取4份5g/L的食品级低酰基结冷胶溶于适13.4,生物素410-5,甲醇10 mL/L,K,PO4缓冲液量蒸馏水中,9 0 水浴加热至结冷胶完全溶解，补加浓度 10 0 mmol/L,pH 6.0。蒸馏水与浓盐酸至终溶液中的HCI浓度分别为1.3摇瓶发酵方法0.25、0.5、0.7 5、1m o l/L。将配制好的水解液置于将前期实验室构建的含有结冷胶裂解酶基因的70水浴锅中加热水解3h。水解结束后分别取样重组毕赤酵母划线接种于YPD平板培养基上，在待后续薄层色谱分析。30恒温培养箱中倒置活化6 0 7 2 h。活化结束1.6.3水解时间优化后,挑取单菌落接种至BMGY液体培养基中（装液量称取5g/L的食品级低酰基结冷胶溶于适量蒸10%，体积分数）,30、2 0 0 r/min培养16 18 h至馏水中,90 水浴加热至结冷胶完全溶解，补加蒸馏OD6oo值达到4 6,得到种子液。4下无菌收集种水与浓盐酸至终溶液中的HCl浓度为0.5mol/L。将子液菌体接种至BMMY液体培养基（装液量2 0%，配制好的水解液置于7 0 水浴锅加热水解6 h，每小体积分数）中,30、2 0 0 r/min培养3 4d发酵结时取样1次待后续薄层色谱分析。束，每2 4h补加体积分数1.0%的甲醇。1.7结冷胶寡糖纯化方法1.4摇瓶发酵条件优化1.7.1酸解结冷胶寡糖纯化方法按1.3节中所述方法获得种子液。设置初始发酸水解结束后加人NaOH将水解液pH调至7，酵条件：酵母粉添加量2 0 g/L，甲醇添加量1%，pH然后离心除去未水解的悬浮物，上清液旋转蒸发浓6.0。保持其他条件不变，调整发酵初始酵母粉添加缩至水解液体积的1/10,得到浓缩液。在浓缩液中量为0、5、10、15、2 0、2 5、30、35、40 g/L研究发酵初始添加6 倍体积的无水乙醇进行醇沉，4冰箱过夜酵母粉添加量对毕赤酵母生长、结冷胶裂解酶酶活力后收集上清液继续添加4倍浓缩液体积的无水乙的影响。以同样的方法研究不同pH(3.5、4、4.5、5、醇4冰箱过夜后收集沉淀。用去离子水复溶沉5.5、6、6.5、7、7.5）、不同甲醇添加量（0、0.5%、淀，将复溶液体加人10 0 50 0 Da的透析袋进行透1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，体析除盐。2023年第49 卷第17 期（总第48 5期)17食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES1.7.2酶解结冷胶寡糖纯化方法发酵降解结束后的发酵液离心除去菌体，上清液旋转蒸发浓缩至发酵液体积的1/10，得到浓缩液后添加7 倍体积的无水乙醇进行醇沉，4冰箱过夜后收集上清液继续添加3倍浓缩液体积的无水乙醇，4冰箱过夜后收集沉淀。去离子水复溶沉淀后，通过SevageV（氯仿）：V（正丁醇）=4:1 法除蛋白V（发酵液）：V（Se v a g e 试剂）=4:1。除蛋白后通过C18固相萃取小柱进一步除蛋白及色素等其他杂质。最后，将除杂后的糖液加人10 0 50 0 Da的透析袋进行透析除盐。C18固相萃取小柱纯化方法14：用1 2 倍柱体积的乙腈对小柱进行活化；用12 倍体积的去离子水淋洗小柱；上样,并收集流出液体；用12 倍体积去离子水淋洗小柱，并收集水洗液。1.8分析检测方法1.8.1还原糖含量测定采用3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylicacid，D NS）比色法。取1mL稀释到适当浓度的发酵液,加入1.5mLDNS试剂,沸水浴加热5min,冷却至室温加蒸馏水至10 mL,550nm下测定吸光度。用蒸馏水代替发酵液做空白对照。根据标准曲线计算出吸光度。1.8.2酶活力测定方法取2 50 L酶液与2 50 L磷酸盐缓冲液（10 m m o l/L，p H 6.0）混合，加人50 0 L结冷胶水溶液（0.5g/L)45水浴2 0 min，煮沸10 min终止反应。用DNS比色法测定反应体系中的还原糖含量，方法如1.8.1节所述。酶活力定义：1min转化底物生成1mol还原糖所需的结冷胶裂解酶量为1个酶活力单位(U)。1.8.3薄层色谱分析将制备好的样品点于薄层板上，点样量2 L，晾底物质量浓度/g/L）aM1357bpM 0.25 0.50 0.75 1.00DPDP11一2233676788图1底物质量浓度（a）、H Cl 浓度(b）、水解时间(c)对酸的水解效果Fig.1 The effects of substrate concentrations(a),HCl concentrations(b),and hydrolysis time(c)on acid hydrolysis182023 Vol.49 No.17(Total 485)干后放人装有展开剂的层析缸中将产物进行分离。层析完晾干薄层板，均匀喷上显色剂于10 5烘箱显色5 min。酸解产物展开剂：V（乙酸乙酯）：V（乙酸）：V（水）=5:5:2；酶解产物展开剂：V（正丙醇）：V（乙酸）：V（水）=5:2:3；显色剂：90 0 mg地衣酚,2 5mL水,37 5mL乙醇,50 mL浓H,S04。1.8.4FTIR 分析称取制备好的冻干后的结冷胶寡糖5mg，使用傅里叶变换红外光谱仪在波数40 0 0 40 0 cm-区间内进行扫描。1.8.5MALDI-TOF-MS 分析配制1g/L的寡糖冻干样品溶液,取1L基质点于质谱预制靶上，再取1L样品与基质混合,真空泵中抽干液体水分待测量，在m/z4002000的质量范围内进行分析。2结果与分析2.1酉酸水解制备结冷胶寡糖及其条件优化酸水解多糖是无规则降解，所得产物往往组分复杂15。酸浓度、水解时间、底物浓度均能影响酸水解效果，控制几个重要的影响水解效果的因素对结冷胶进行酸水解以提高产物得率,并将制得的酸解产物与酶解产物进行对比分析。图1-a是不同底物质量浓度对酸水解效果影响的薄层色谱分析，根据斑点颜色深浅可大致判断样品浓度。各聚合度的寡糖含量随底物浓度增加而增加，但当底物质量浓度超过5g/L时变化不再明显，因此5g/L是一个较为合适的底物质量浓度。图1-b是不同HCl浓度对酸水解效果影响的薄层色谱分析，当HCI浓度为0.25mol/L时，主要产物为聚合度为5和8 的寡糖。随HCI浓度增加,聚合度 5的寡糖逐渐减少；当HCl浓度为0.7 5mol/LHCI浓度/(mol/L)水解时间/hM123456DP1236780研究报告时，聚合度为8 的寡糖在薄层色谱板上几乎消失。尽本研究是利用前期实验室构建的含有结冷胶裂解酶管聚合度 5的寡糖随HCI浓度增加而逐渐增加,但基因（来源于Bacillus sp.GL1）的重组毕赤酵母进行当HCl浓度超过0.5mol/L时，寡糖聚合度范围却在外源表达得到结冷胶裂解酶16 。酶活力对于寡糖产变小,逐渐出现一些单糖和二糖,这与得到更多低聚糖量至关重要，酶活力越高则产物产量越高，因此有必的目标不符。考虑目标产物特性,最终选取0.5mol/L要对发酵条件进行优化。重组结冷胶裂解酶是在毕HC1进行下一步实验。赤酵母中以AOX1为启动子进行表达,因此在发酵过图1-c是不同水解时间对酸水解效果影响的薄程中是以甲醇为唯一碳源诱导表达蛋白。发酵过程层色谱分析,随水解时间的增加,聚合度 5的寡糖逐渐减少；但从4h开素17 ,因此分别研究了发酵初始酵母粉添加量、甲醇始,聚合度 5的寡糖逐渐消失。并且水解时间越长添加量与发酵初始pH对酶活力的影响。由图2-a可产生的单糖和二糖越多,因此选择水解3h进行下一知,在酵母粉添加量为2 0 g/L时,重组结冷胶裂解酶步实验。最终酸水解选择底物质量浓度5g/L,HCl酶活力最大；如图2-b所示，甲醇添加量为1%时，重浓度0.5mol/L，水解3h作为适宜水解条件制备结组结冷胶裂解酶酶活力最大；从图2-c可知,pH为冷胶寡糖。6.0时,重组结冷胶裂解酶酶活力最大。综上，选择2.2结冷胶裂解酶发酵条件优化发酵初始酵母粉添加量2 0 g/L,甲醇添加量1%，pH酶解多糖制备寡糖具有产物专一且温和的特点，6.0是重组结冷胶裂解酶的适宜发酵条件。a800 rb800r600600(T/n)/星(T/0)/400400200200010酵母粉添加量/g/L)2.3酶解制备结冷胶寡糖及条件优化传统的酶降解法是先通过发酵生产目标酶，然后直接用粗酶液或是将酶分离纯化后对多糖进行降解。用粗酶液直接进行降解需要先将酶生产出来再降解多糖，而酶的分离纯化因蛋白质结构复杂、易失活等原因往往需要几种纯化技术联用才能够得到目标蛋白18 ,降解结束后还需要一系列的寡糖纯化步骤,这样极大地降低了酶法降解结冷胶生产结冷胶寡糖的效率。为了缩短酶法降解的时间，提高酶法降解效率，提出了毕赤酵母发酵耦合多糖水解一步法制备结冷胶寡糖的策略一一在结冷胶裂解酶发酵初始添加结冷胶，以达到生产结冷胶裂解酶并实时降解多糖，实现一步制备结冷胶寡糖的目的。为此分别对发酵初始结冷胶添加量与发酵时间进行优化，以确定结冷胶寡糖产量更高的降解条件。图3-a显示结冷胶寡糖随结冷胶添加量增加而逐渐增加，当结冷胶添加c800 r(T/0)/星60040020002030Fig.2Optimization of fermentation conditions for gellan lyase400a-酵母粉添加量；b-甲醇添加量；c-pH图2 结冷胶裂解酶发酵条件优化量 2.0 g/L时，结冷胶寡糖几乎不再增加。图3-b显示结果与薄层色谱分析结果大致相同，随结冷胶添加量的增加还原糖产量逐渐增加，但当结冷胶添加量 2.5g/L时,还原糖产量增加量变少。在优化过程中，观察到由于结冷胶在常温下溶解度不高的原因，当结冷胶添加量 2 g/L时,会造成发酵培养基凝结的问题,为了既能够生成较多的结冷胶寡糖又不影响结冷胶裂解酶的生产,综合考虑最终确定发酵初始添加2.0 g/L的结冷胶较为合适。为进一步提高酶法降解的效率,对发酵时间进行优化，图4-a显示，结冷胶寡糖随时间增加而逐渐增多。图4-b可知,还原糖产量随发酵时间增加而增多,但当发酵9 6 h后、还原糖产量增速变慢，可能是发酵后期一些细胞产生自噬现象19,限制了甲醇利用效率,导致发酵后期还原糖产量基本不再增加,最终确定发酵96 h为最佳发酵时间。2023 年第49 卷第17 期（总第48 5期)1甲醇添加量/%2343.544.04.5 5.05.56.06.57.07.5pH19食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES结冷胶添加量/g/L)aM00.51.01.52.0DP123678b1.2(/)/鲁尚亚1.00.80.60.40.20a一薄层色谱分析；b-还原糖产量图3不同结冷胶添加量对酶降解效果的影响Fig.3The effect of different gellan gum addition onenzymatic degradation发酵时间/haDP123678b1.61.4(7/)鲁早尚亚0.80.201224364860728496108120时间/ha-薄层色谱分析；b-还原糖产量图4发酵时间对酶降解效果的影响Fig.4The effect of fermentation time on enzymatic degradation2.4产物分析为了进一步解析2 种不同水解方式制备的结冷202023 Vol.49 No.17(Total 485)胶寡糖差异,将酸水解与酶水解后得到的寡糖进行纯2.53.0化。纯化后的样品分别进行FTIR与MALDI-TOF-MS分析。FTIR可以通过基团的特征吸收频率来对有机化合物的结构进行解析。32 8 8、2.932 cm分别代表一0 H和C一H的伸缩振动2 0 ，1414、1021cm=分别代表C0和C0C的伸缩振动峰2 1,16 0 0 cm代表C00H的伸缩振动峰2 2 ,1640cm代表C=C 的伸缩振动峰2 3-2 4。图5中曲线ac 分别是商品结冷胶、酸水解结冷胶寡糖、酶水解结冷胶寡糖的FTIR结果,酸水解后的寡糖与商品结冷胶的特征吸收峰位置基本保持一致，所以酸水解后得到的寡糖的结构并未被改变。来源于BacillusSp.GL1的结冷胶裂解酶能够作用于结冷胶中葡萄糖与葡萄糖醛酸之间的-1,4糖苷键,从而达到降解结冷胶的目的,产生由不饱和葡萄糖醛酸-葡萄糖-鼠李糖-葡萄糖构成的四糖2 5-2 6 。而酶水解后的产物在0.51.01.552.02.5结冷胶添加量/g/L)3.01640cm-处出现了一个新的特征吸收峰,因此酶水解后得到的结冷胶寡糖结构中出现了C=C结构,这一现象正是结冷胶裂解酶作用于结冷胶后生成了含有不饱和葡萄糖醛酸的结冷胶低聚糖的结果。(c)(b)(a)40003.5003000250020001500 1000波数/cm-la-商品结冷胶;b-酸水解结冷胶寡糖；c-酶水解结冷胶寡糖图5降解产物的FTIR谱Fig.5FTIR spectra of the degradation products进一步通过MALDI-TOF-MS来确定2 种水解方式得到的寡糖的分子质量。如图6-a所示,在M-Hm/z 8 45.12、13 0 9.45、19 55.6 7 处检测到3 个结冷胶寡糖成分，表明酸水解后得到了聚合度为5、8、12 的结冷胶寡糖。图6-b是酶解结冷胶寡糖的质谱分析图,在M+Na+m/z 6 6 9.34处检测到一个结冷胶寡糖成分,表明酶解后得到了聚合度为4的结冷胶寡糖,这一结果正是酶解产物的专一性导致的。因此，酶解法能够克服酸解法产物组分复杂的特点，成功制备出单一聚合度的结冷胶寡糖。3结论本研究成功利用毕赤酵母发酵耦合多糖酶解一88886S68620091一研究报告a61046YUAN H M,SONG J M,LI X G,et al.Immunomodulation and an-5104845.12410+3x10210+11040b 21041104810341030400500 600 7008009001000m/za-酸解产物MALDI-TOF-MS分析;b-酶解产物MALDI-TOF-MS分析图6 降解产物的MALDI-TOF-MS谱图Fig.6MALDI-TOF-MS spectrum of the degradation products步法制备出单一聚合度的结冷胶寡糖,并对比分析了其与酸解产物的差异。分别对酸解与酶解制备结冷胶寡糖工艺条件进行了优化，结果表明酸解的适宜条件为底物质量浓度5.0 g/L、H C l浓度0.5mol/L、水解3h；结冷胶裂解酶的最佳发酵条件为发酵初始酵母粉添加量2 0 g/L、甲醇添加量1%、发酵初始pH6.0；发酵初始添加2 g/L结冷胶,最佳酶解条件为发酵水解96 h。降解后得到的酸水解产物结构不变,酶解产物出现了C一C结构;并且酸解后得到了聚合度为5、8、12 的结冷胶寡糖，酶解后得到了聚合度为4的结冷胶寡糖。本文为制备单一聚合度结冷胶寡糖及探究其功能活性提供了一个可行的途径。参考文献1GIAVASIS I,HARVEY L M,MCNEIL B.Gellan gumJ.CriticalReviews in Biotechnology,2000,20(3):177-211.2FIALHO A M,MOREIRA L M,GRANJA A T,et al.Occurrence,production,and applications of gellan:Current state and perspectivesJ.Applied Microbiology and 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degradation are the common methods for the preparation of oligosaccharides by poly-saccharide degradation.The products prepared by chemical methods are often complicated and difficult to obtain oligosaccharides with asingle degree of polymerization.The enzymatic method has become an important issue in recent years because of its high specificity andhigh uniformity of target products.In this study,the technological conditions for producing gellan o