TGF-βRⅡ受体敲除的CLDN18.2 CAR T细胞对胃食管交界癌抑制作用的实验研究.pdf

3347MODERNONCOI31.No.182023年0 9 月第31卷第18 期现代肿瘤医学TGF-R受体敲除的CLDN18.2 CART细胞对胃食管交界癌抑制作用的实验研究李顺，樊华，杨永旭，蔡迎彬新疆医科大学附属肿瘤医院内镜诊治中心，新疆乌鲁木齐8 30 0 11【摘要】目的：构建敲除TGF-RI的靶向CLDN18.2的CART细胞，并探索其在胃食管交界癌中的治疗潜力；方法：通过CRISPR/Cas9敲除T细胞中的TCF-R,并使用慢病毒感染法构建CLDN18.2CART细胞；流式细胞术检测CART细胞的阳性率、食管腺癌细胞系中CLDN18.2的表达情况、CART细胞中Smad2/3的磷酸化水平以及PD-1的表达水平；免疫荧光法检测CART细胞中TCF-R的表达;LDH释放实验检测对靶细胞的细胞毒性;裸鼠移植瘤模型检测肿瘤抑制能力;ELISA实验检测肿瘤组织中细胞因子的释放水平；结果：成功构建敲除TGF-RI 的CLDN18.2CART细胞（18.2 BBZ/TGFBRKO）以及二代CLDN18.2CART细胞（CLDN18.2）;18.2 BBZ及18.2 BBZ/TCFBRKO在体外对CLDN18.2+的肿瘤细胞具有剂量依赖型细胞毒性;TGF-1不能使18.2 BBZ/TCFBRKO的Smad2/3发生磷酸化，在TCF-1存在时，18.2 BBZ/TCFBRK0与肿瘤细胞共孵育后PD-1的表达水平显著低于18.2 BBZ(P0.001）18.2 BBZ/TGFBRKO较18.2 BBZ对裸鼠移植瘤的抑制能力更强（P0.0001）,并且在肿瘤组织中保持更强的细胞因子分泌水平（P0.01）；结论：通过CRISPR/Cas9敲除CLDN18.2CART细胞中的TGF-BR可以有效降低T细胞耗竭,并在小鼠移植瘤模型中产生更强的抑制肿瘤活性,并增加促炎性细胞因子的分泌。【关键词】胃食管交界癌；嵌合抗原受体T细胞；CRISPR/Cas9;TGF-RI【中图分类号】R735.2【文献标识码】AD0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.18.003【文章编号】16 7 2-4992-（2 0 2 3)18-3347-0 6Experimental study on inhibitory effect of TGF-RII receptor knockout CLDN18.2 CART cells on gastroesophageal junction carcinomaLI Shun,FAN Hua,YANG Yongxu,CAI YingbinEndoscopic Diagnosis and Treatment Center,Cancer Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University,Xinjiang Urumqi 830011,China.Abstract】O b j e c t i v e:T o c o n s t r u c t k n o c k o u t T G F-R I targeting CLDN18.2 CAR T cells and explore its thera-peutic potential in gastroesophageal junction carcinoma(GEJ).Methods:TGF-R I in T cells was knocked out byCRISPR/Cas9 and CLDN18.2 CAR T cells were constructed by lentivirus infection.Flow cytometry was used to detectthe positive rate of CAR T cells,the expression of CLDN18.2 in esophageal adenocarcinoma cell lines,the phospho-rylation level of Smad2/3 in CAR T cells,and the expression level of PD-1.The expression of TGF-R I in CART cells was detected by immunofluorescence assay.LDH release assay was used to detect cytotoxicity of target cells.Tumor inhibition ability was detected by tumor transplantation in nude mice.ELISA assay was used to detect the re-lease of cytokines in tumor tissues.Results:CLDN18.2 CAR T cells with TGF-R I knockout(18.2BBZ/TGFBR-KO)and the second generation CLDN18.2 CAR T cells(18.2BBZ)were successfully constructed.18.2BBZ and18.2BBZ/TGFBRKO showed dose-dependent cytotoxicity to CLDN18.2+tumor cells in vitro.TGF-1 could notphosphorylate Smad2/3 of 18.2BBZ/TCFBRKO.In the presence of TCF-1,the expression level of PD-1 of18.2BBZ/TCFBRKO after co-incubation with tumor cells was significantly lower than that of 18.2BBZ(P0.001).18.2BBZ/TCFBRKO showed stronger inhibitory effect on transplanted tumor in nude mice than 18.2BBZ(P0.000 1)and maintained stronger cytokine secretion level in tumor tissues(P 0.01).Conclusion:CRISPR/Cas9 knockout of TGF-R II in CLDN18.2 CAR T cells can effectively reduce T cell exhaustion and produce stron-ger antitumor activity and increase the secretion of pro-inflammatory cytokines in mouse transplanted tumor models.【收稿日期】2023-03-08【修回日期】2023-04-06【基金项目】新疆维吾尔自治区自然科学基金项目（编号：2 0 2 2 D01C299）【作者简介】李顺（198 5一），男，新疆乌鲁木齐人，硕士，主治医师，主要从事消化道肿瘤诊治及相关研究。E-mail：a w a r q a 16 3.c o m【通信作者】蔡迎彬（198 0 一），男，新疆乌鲁木齐人，硕士，副主任医师，主要从事消化道肿瘤诊治及相关研究。E-mail：938 50 52 0 q q.c o m3348.顺，等TGF-RI受体敲除的CLDN18.2CART细胞对胃食管交界癌抑制作用的实验研究Key words gastroesophageal junction carcinoma,chimeric antigen receptor T cells,CRISPR/Cas9,TGF-R IModern Oncology 2023,31(18):3347-3352食管癌是全球癌症死亡的第六大因素，每年造成的死亡人数超过50 万人 。食管癌有两种主要的组织学亚型：鳞状细胞癌，主要发生在食道的上三分之一和中三分之一2 ；腺癌，通常发生在食道的下半部，可累及胃食管交界处3。胃食管交界区癌（gastroesophageal junction carcinoma,GEJ）是一种重要的临床疾病,过去,CEJ被归类为胃癌,而GEJ的临床和流行病学特征与食管癌更为相似。在2 0 10 年,国际癌症控制联盟将GEJ从胃癌的分期系统转移到食管癌的分期系统。现在的临床治疗指南也将CEJ归为食管癌4-5。尽管最近在手术、放疗和化疗方面取得了进步，GEJ所有阶段的5年生存率仍低于2 0%6 。在GEJ晚期条件下的全身治疗包括一线和二线条件下的化疗、一线的抗HER2肿瘤，以及二线的抗VEGFR抗体雷莫芦单抗7 。然而，这些治疗手段功效有限，且具有明显的毒性。CLDN18是一种高度特异性的膜蛋白,在胎儿和成人正常胃黏膜中表达。CLDN18有两个亚型：CLDN18.1和CLDN18.2,分别特异性存在于肺组织和胃组织8 。有研究发现,在受损的食管上皮中CLDN18.2的表达明显增加，提示CLDN18.2异常激活可能是食管癌的早期事件9。单克隆抗体zolbetuximab是首个临床开发中的CLDN18.2靶向治疗药物。作为单药治疗，zolbetuximab在CLDN18.2阳性复发或难治性晚期胃癌/胃食管交界处癌（GC/GEJ）患者中ORR为9%10 CART细胞是一种新兴的癌症治疗手段，靶向CLDN18.2的CART细胞已在胃癌的临床治疗中展现出良好的安全性,但其疾病响应率较低。TCF-是肿瘤微环境中最重要的调节因子之一，对抗肿瘤免疫有不良影响，显著抑制宿主肿瘤免疫监视12 在本研究中，我们构建了靶向CLDN18.2的CART细胞,并通过CRISPR/Cas9敲除CART细胞中的TGF-RI,并希望进一步探索这种改进型的CART细胞在GEJ中的治疗活性。1材料和方法1.1细胞系及主要试剂人食管腺癌细胞系SEG-1,SK-GT-5以及BIC-1购自中科院上海细胞库，并在添加10%FBS的高糖DMEM培养基中进行培养。PBMC细胞购自深圳立沃生物科技有限公司，并在添加10%FBS的RPMI-1640培养基中进行培养。CD3/CD28激活磁珠购自Invitrogen公司;Polybrane购自Sigma公司;P3原代细胞4D核转试剂盒购自LONZA公司；LDH细胞毒性检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；细胞固定/破膜试剂盒购自BD公司;HumanELISAKit检测试剂盒(IFN-,IL-2,TGF-1,TNF-,IL-6,IL-8)以及DAPI试剂购自上海爱必信生物科技有限公司；大鼠抗人EGFR-PE，小鼠抗人CLDN18.2-PE，小鼠抗人pSmad2/3-PE-Cy7以及小鼠抗人PD-1-FITC购自Biolegend公司；兔抗人TCF-RI购自Abcam公司；AF488-山羊抗免荧光二抗购自Invitrogen公司；人重组IL-2以及TGF1购自Peprotech公司。sgRNA以及Cas9蛋白均购自Invitro-gen公司。1.2构建18.2 BBZ及18.2 BBZ/TGFBRKOCLDN18.2CAR结构按CD8信号肽，CLDN18.2scFv，CD8铰链区，CD8跨膜区，4-1BB胞内区以及CD3的顺序依次连接，并加人T2A-ECFR胞外区序列作为检测标记。CLDN18.2scFv序列获取自专利（US10022444B2），其余序列均获取自NCBI数据库。将所有序列经过全基因合成后整合到Plvx-puro载体中，由上海和元生物有限公司包装慢病毒。将PBMC细胞密度调整为110/mL,按2 5L/10个细胞加人CD3/CD28激活磁珠。对于18.2 BBZ/TGFBRKO，激活2 4h后，8 0 g离心10 min收集细胞，按照P3原代细胞4D核转试剂盒的说明，使用电转液重悬细胞。与此同时,将TGF-RI sgRNA（序列为：UAUCAUGUCGUUAUUAACUG)和Cas9蛋白以1:1的比例混合，终浓度为50 pmol,室温孵育15min。将混合物加人细胞悬液，转移至电转杯后，使用LONZA4D-NucleofectorTMSystem，选择EH115程序进行电转,电转结束后将细胞转移至1mL预热的完全培养基中培养过夜。待PBMC激活48 h后，取110 个激活的T细胞置于2 4孔板中，以MOI值3加人CLDN18.2CAR慢病毒，并加入终浓度为6 g/mL的polybrane,在水平离心机中31条件下12 0 0 g离心6 0 min，置于培养箱中培养过夜。1.3流式细胞术检测CAR阳性率，CLDN18.2抗原表达，Smad2/3磷酸化以及PD-1表达待慢病毒感染PBMC5天后，取110 个细胞，PBS清洗3次后使用10 0 LFACS溶液重悬，加人5LEGFR-PE避光孵育30 min，PBS清洗3次后使用MACSQuant流式细胞仪（美天旅）进行分析；取110 个SEG-1,SK-GT-5或BIC-1细胞，PBS清洗3次后使用10 0 LFACS溶液重悬，加人5LCLDN18.2-PE避光孵育30 min，PBS清洗3次后使用MACSQuant流式细胞仪进行分析；分别取110 s个18.2 BBZ或18.2 BBZ/TCFBRKO置于9 6 孔板中，添加或者不添加TGF-1（10 n g/mL）培养6 h，收集细胞加人10 0L固定/破膜试剂,并加人5LpSmad2/3-PE-Cy7抗体，4避光孵育30 min，PBS清洗3次后使用MACSQuant流式细胞仪进行分析；以110 4个SEG-1细胞在96 孔板中进行铺板，加人310 4个UT，18.2 BBZ或18.2 BBZ/TGFBRK0进行共孵育,并且额外添加10 ng/mL的TGF-1,72h后收集孔中的悬浮细胞，PBS清洗3次后使用10 0 LFACS溶液重悬，加人5LPD-1-FITC避光孵育30 min,PBS清洗3次后使用MACSQuant流式细胞仪进行分析。1.4免疫荧光检测18.2 BBZ/TGFBRKO中TGF-R的表达取110 个UT,18.2BBZ或18.2 BBZ/TCFBRK0用PBS清洗3次，加入4%PFA室温固定10 min，加人5%山羊血清室温封闭2 h,加人兔抗人TGF-R抗体（1:10 0)4孵育过夜，次日经过清洗后加人AF488山羊抗兔荧光二抗（1:10 0 0）室温避光孵育1h，加人DAPI室温避光孵育5min，清洗后使用抗猝灭封片剂进行封片，使用激光共聚焦显微镜（LSM880）进行观测1.5LDH释放实验检测对肿瘤细胞的细胞毒性3349MODERNONCOI31,No.182023年0 9 月第31卷第18 期现代肿瘤医学以110 4个SEG-1、SK-G T-5或BIC-1细胞在9 6孔板中进行铺板，之后以1:1,3:1和9:1的效靶比分别加人UT18.2BBZ或18.2 BBZ/TGFBRKO进行共孵育，2 4h后离心取上清，按照LDH细胞毒性检测试剂盒的要求进行检测。细胞毒性计算公式为：细胞毒性（%）=（处理样品吸光度一样品对照孔吸光度）/（细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度）10 0%1.6裸鼠移植瘤模型检测肿瘤抑制能力30只4周龄大小的裸鼠购自新疆医科大学实验动物中心，饲养在SPF动物房中，所有动物实验均经我院伦理委员会批准。收集SEG-1细胞，PBS清洗3次后，以310 个/只在裸鼠皮下注射2 0 0 L细胞悬液，待肿瘤长至10 0 mm时，通过尾静脉注射PBS,510个18.2 BBZ或18.2 BBZ/TGFBRKO，每2 天测量一次瘤体积，瘤体积计算公式为：体积=瘤长瘤宽/2。在接瘤后第30 天对小鼠进行安乐处死，收集肿瘤，称量肿瘤质量，拍摄肿瘤照片。1.7ELISA检测肿瘤细子的释放水平取2 0 mg新鲜的肿瘤组织，加人2 0 0 LPBS后在冰上对组织进行匀浆，412 0 0 0 g离心10 min后收集上清液。按照制造商提供的说明书，使用HumanELISAKit检测试剂盒(IFN-,IL-2,TGF-1,TNF-,IL-6,IL-8)对上清液中的细胞因子含量进行检测1.8统计学方法所有数据采用SPSS18.0软件进行统计学处理。两组间比较采用非配对t检验，两组以上数据采用单因素方差分析进行检验。P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1118.2BBZ及18.2 BBZ/TGFBRKO的鉴定通过流式细胞术对18.2 BBZ及18.2 BBZ/TGFBRKO的阳性率进行检测，结果表明，18.2 BBZ及18.2 BBZ/TGFBRKO的阳性率均超过30%（图1A）。免疫荧光结果显示，未转导的UT以及18.2 BBZ表面显著表达TCF-R，而18.2BBZ/TCFBRKO表面未检测到TGF-RII（图1B）。体外细胞增殖结果显示，UT、18.2 BBZ及18.2 BBZ/TCFBRKO均可在体外正常扩增，增殖能力无显著差异（图1C）。AUT18.2BBZ18.2BBZ/TGFBRKO1.0K寸600-500-800J400-0.67%400-33.8%38.2%600-3004001200-200-200100-000-10010310410-103010310*10s-103010310*105EGFREGFREGFRBTGF-R IIDAPIMergeC100-UTUT-18.2BBZ80-A-18.2BBZ/TGFBRKO60-18.2BBZ40-Infection20-18.2BBZ/TGFBRKO0-24681012Days图118.2 BBZ和18.2 BBZ/TGFBRKO的特征A通过流式细胞术检测转导效率；B：通过免疫荧光检测TGF-RII的表达；C：感染后体外细胞扩增情况。Fig.1Characteristic of 18.2BBZ and 18.2BBZ/TCFBRKOA:Transduction efficiency were detected by flow cytometry.B:The expression of TGF-R II were detected by immunofluorescence.C:Cell expansion af-ter infection invitro.2.2218.2BBZ及18.2 BBZ/TGFBRKO对靶细胞的杀伤能力检测通过流式细胞术检测食管腺癌细胞中CLDN18.2的表达情况，结果显示，SEG-1及SK-GT-5高表达CLDN18.2,而BIC-1不表达CLDN18.2（图2 A）。通过LDH释放实验表征对靶细胞的细胞毒性，结果显示，18.2 BBZ及18.2BBZ/TGFBRKO对CLDN18.2阳性的肿瘤细胞具有剂量依赖细胞毒性，而对CLDN18.2阴性的细胞无细胞毒作用（图2 B）2.3TGFB信号对CAR细胞耗竭的影响在额外添加或不添加TCF-1时，通过流式细胞术检测T细胞中pSmad2/3信号的表达,结果表明,添加TCF-1显著提高18.2 BBZ中pSmad2/3的信号强度，而对18.2 BBZ/TCFBRKO中pSmad2/3的信号强度无影响（图3A，P0.001）。由于TCF-1的存在会通过上调PD-1加速CART细胞的耗竭13,在添加TCF-1的条件下进行效靶细胞共孵育，流式检测结果显示,18.2 BBZ中PD-1的表达较UT组显著升高，而18.2 BBZ/TGFBRKO中PD-1的表达未发生显著上调（图3B,P0.001）2.4118.2BBZ及18.2 BBZ/TGFBRKO对体内移植瘤的抑制作用建立SEG-1细胞系的裸鼠移植瘤模型，经过18.2 BBZ3350：李顺，等TCF-BR受体敲除的CLDN18.2CART细胞对胃食管交界癌抑制作用的实验研究及18.2 BBZ/TGFBRKO的治疗后，结果显示，18.2 BBZ组的肿瘤生长较PBS组被显著抑制（图4A,P0.0001），而18.2BBZ/TGFBRKO组较18.2 BBZ组的肿瘤抑制效果更强（图4A,P0.0001）。瘤重结果也表明，18.2 BBZ/TGFBR-KO组较18.2 BBZ组而言肿瘤质量更小（图4B-C,P0.05，*：P 0.0 1，*：P0.05,*:P0.01,*:P0.001.2.518.2BBZ及18.2 BBZ/TGFBRKO在体内的细胞因子分泌水平检测制备肿瘤组织的组织匀浆,ELISA检测上清中细胞因子的含量，结果表明，18.2 BBZ/TGFBRKO组中促炎性细胞因子IFN-(P0.01),IL-6(P0.01),TNF-(P0.05)以及IL-8（P 0.0 1）的含量显著高于18.2 BBZ组，而对于TCF-1的水平，各个治疗组间无显著差异（图5）3351MODERNONC31.No.182023年0 9 月第31卷第18 期现代肿瘤医学A2000BC15007-PBS1750-18.2BBZ*F18.2BBZ/TGFBRKO1500PBS125010001000*750*18.2BBZ*500-50025018.2BBZ/TGFBRKO05810121416182022242628300246PBS18.2BBZ18.2BBZ/DaysTGFBRKO图418.2 BBZ和18.2 BBZ/TGFBRKO在体内的抗肿瘤活性A：肿瘤体积数据;B：在老鼠安乐死后拍摄的肿瘤照片；C：肿瘤重量数据。*：P0.01，*：P 0.0 0 0 1。Fig.4Antitumor activity of 18.2BBZ and 18.2BBZ/TGFBRKO in vivoA:Tumor volume data.B:Tumor photos were taken after euthanasia of the mouse.C:Tumor weight data.*:P0.01,*:P0.05,*:P0.05,*:P0.01,*:P0.001.3讨论尽管越来越多的创新疗法正在兴起，但GEJ的治疗仍然困难重重。对于开发有效的免疫疗法而言，主要障碍是极其复杂的肿瘤微环境，例如分泌包括TGF-在内的免疫抑制细胞因子来削弱免疫反应14。TCF-与CEJ患者的不良预后、总生存期短、复发概率增加有关15。当回输的CART细胞进入肿瘤部位,局部的TGF-便会影响这些细胞的抗肿瘤功效。为了克服这些限制,本研究采用CRISPR/Cas9敲除靶向CLDN18.2CART细胞中的TCF-RI，我们证明了TGF-RI-的CLDN18.2特异性CART细胞在体外长期刺激时降低了CART细胞耗竭，并增强了体内抗肿瘤活性。在多项临床前或临床研究中,研究人员正在试图探索调节免疫细胞中TCF-信号的策略，包括干扰TCF-的合成，防止TCF-的激活，抑制配体-受体相互作用和细胞内信号转导16 。在CART细胞的相关研究中,有研究评估了一种共表达负性TGF-受体的策略，这最终导致其在小鼠异种移植模型中增强了PSMA特异性CART细胞的疗效17 。另一个典型的策略是TCF-阻断的单克隆抗体与CART细胞的结合,在晚期黑色素瘤患者中提供了抗肿瘤活性的初步证据，且没有剂量限制毒性18 。然而在上述两种策略中,CART细胞本身表达的TGF-RI仍然存在,并不能完全消除TCF-对T细胞的影响。而先前有研究人员在临床前研究中证实了通过基因编辑敲除TGF-RII可以显著增强MSLNCART细胞对胰腺癌小鼠模型的肿瘤清除能力19。因此在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9系统对CLDN18.2CART细胞中的TCF-RII进行敲除，在体外实验中证明在添加TGF-1时几乎可以完全阻断T细胞中pSmad2/3信号，证明这种策略对于消除TCF-1对CART细胞产生的负面影响具有重要意义。截至目前，CEJ的免疫治疗主要包括检查点抑制剂、溶瘤病毒治疗和过继性细胞回输,其中CAR T治疗被证明是一种十分有效的免疫治疗策略2 0 。靶向HER-2的CART细胞已经在治疗消化道肿瘤的临床试验中进行了测试2 1。此外，针对CLDN18.2的CART细胞也已经用于胃部肿瘤患者的临床实验中,并显示出良好的疗效和可接受的安全性2 靶向肿瘤相关抗原的限制性表达模式对CART细胞在CEJ中的安全和成功应用至关重要。在这方面，由于CLDN18.2是一种高度特异性的抗原，在正常成人胃黏膜和胃胎儿组织李3352TGF-RI受体敲除的 CLDN18.2 CAR T细胞对胃食管交界癌抑制作用的实验研究顺，等中表达，在GEJ中倾向于保守，因此它是靶向CEJ的一个有利靶抗原9先前的研究证明TGF-的免疫抑制功能可能是通过促进T细胞的耗竭表型实现的15。在本研究中，当效靶细胞共孵育并且添加TCF-1时，我们发现T细胞中PD-1的表达水平显著增高,而对于TCF-RI-的CART细胞，PD-1的表达水平未出现明显升高，证明阻断TCF-信号可以有效缓解CART细胞耗竭。此外,体内的细胞因子分析表明,TCF-RI的CART细胞治疗后可以使肿瘤局部促炎性细胞因子的表达水平明显升高，从而使肿瘤微环境保持更好的抗肿瘤状态,这也与TCF-RI-的CART细胞产生更强的肿瘤抑制功能相吻合。总之，本研究表明,TGF-会促进CART细胞的耗竭，而通过CRISPR/Cas9敲除靶向CLDN18.2CART细胞中的TGF-RI可以有效降低T细胞耗竭,并在小鼠移植瘤模型中产生更强的抑制肿瘤活性，并增加促炎性细胞因子的分泌。TGF-RI-的CLDN18.2CART细胞的应用在临床上是可行的，并有望改善GEJ患者的预后。【参考文献】1RICE TW,APPERSON-HANSEN C,DIPAOLA LM,et al.World-wide esophageal cancer collaboration:clinical staging data J.DisEsophagus,2016,29(7):707-714.2HAVERKAMP L,SEESING MF,RUURDA JP,et al.Worldwidetrends in surgical techniques in the treatment of esophageal andgastroesophageal junction cancer J.Dis Esophagus,2017,30(1):1-7.3TOKUNAGA M,OKIMOTO K,AKIZUE N,et al.Genetic profiles ofBarretts esophagus and esophageal adenocarcinoma in Japanese pa-tients J.Sci Rep,2021,11(1):17671.4KUBOTA Y,TANABE S,HARADA Y,et al.Barretts 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