ACE2在结肠癌中表达的临床意义及结肠癌细胞对以ACE2为受体的三种人冠状病毒的易感性分析.pdf
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1、2023 年8 月 第 44 卷 第 4 期 首 都 医 科 大 学 学 报Journal of Capital Medical University Aug.2023Vol.44 No.4基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(82100592)。This study was supported by the Young Scientists Fund of the National Natural Science Foundation of China(82100592).Corresponding author,E-mail:zhushengtao 网络出版时间:2023-07-19 1
2、719 网络出版地址:https:/ ACE2 为受体的三种人冠状病毒的易感性分析宁婷婷1 王照情2 张 楠1 朱圣韬1(1.首都医科大学附属北京友谊医院消化分中心 国家消化系统疾病临床医学研究中心 消化疾病癌前病变北京市重点实验室,北京 100050;2.首都医科大学附属北京友谊医院病理科,北京 100050)【摘要】目的 分析血管紧张素转化酶 2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)在结肠癌中的表达及与结肠癌患者预后的关系,探讨结肠癌细胞对以 ACE2 为受体的三种人冠状病毒的易感性。方法利用实时荧光定量聚合酶链式反应、免疫组织化学和蛋白质免疫印迹,探
3、究结肠癌组织和细胞中 ACE2 的表达,并结合数据库分析 ACE2 的表达与结肠癌患者预后的关系。借助人冠状病毒假病毒分析结肠癌细胞对人冠状病毒假病毒的易感性。结果结肠癌组织和细胞中 ACE2 的表达水平明显升高。且ACE2 的表达水平与结肠癌患者预后无关。与结肠上皮细胞 CCC-HIE-2 相比,结肠癌细胞 Caco2 对重症急性呼吸综合征冠状病毒假病毒的易感性显著升高。除 HCT-15 细胞外,所有结肠癌细胞对新型冠状病毒假病毒的易感性明显升高。所有结肠癌细胞对人冠状病毒 NL63 假病毒的易感性明显升高。结论 ACE2 在结肠癌组织和结肠癌细胞中表达增加且其表达与结肠癌患者预后无关,大部
4、分结肠癌细胞对三种人冠状病毒的易感性增加。【关键词】结肠癌;血管紧张素转化酶 2;人冠状病毒;易感性【中图分类号】R735 【文献标识码】AClinical importance of ACE2 expression in colon cancer and susceptibility of colon cancer cells to three human coronaviruses using ACE2 as their receptorNing Tingting1,Wang Zhaoqing2,Zhang Nan1,Zhu Shengtao1(1.Department of Gastro
5、enterology,Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University;National Clinical Research Center for Digestive Disease;Beijing Digestive Disease Center;Beijing Key Laboratory for Precancerous Lesion of Digestive Disease,Beijing 100050,China;2.Department of Pathology,Beijing Friendship Hospital,Ca
6、pital Medical University,Beijing 100050,China)【Abstract】Objective To investigate the expression of angiotensin-converting enzyme 2(ACE2)in colon cancer and the relationship with prognosis as well as the susceptibility of colon cancer cells to three human coronaviruses who use ACE2 as their receptors
7、.MethodsQuantitative real-time Polymerase Chain Reaction,immunohistochemistry and Western blotting were used to explore the expression of ACE2.Databases were used to analyze the relationship between ACE2 expression and the prognosis of colon cancer patients.The susceptibility of colon cancer cells t
8、o three human coronaviruses who use ACE2 as receptors was analyzed based on pseudovirions.Results The expression levels of ACE2 in colon cancer were higher and the expression level was not correlated with prognosis.The susceptibility of Caco2 to severe acute respiratory syndrome coronavirus(SARS-CoV
9、)pseudovirions was higher than that in CCC-HIE-2.Compared with CCC-HIE-2,the susceptibility of colon cancer cells to SARS-CoV-2 was higher,except for that in HCT-15.The susceptibility of all colon cancer cells to human coronaviruses NL63(HCOV-NL63)was higher than that in CCC-HIE-2.ConclusionsThe exp
10、ression level of ACE2 was increased in colon cancer and its expression was not correlated with prognosis.And the susceptibility of most colon cancer cells to three human coronaviruses was increased.【Key words】colon cancer;angiotensin-converting enzyme 2;human coronavirus;susceptibility 重症急性呼吸综合征冠状病毒
11、(severe acute re-spiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)和人冠状病毒 NL63(human coronavirus-首 都 医 科 大 学 学 报第 44 卷es NL63,HCoV-NL63)主要通过血管紧张素转化酶 2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)作为受体进入宿主细胞1,而 ACE2 不仅在呼吸道高表达,在结肠也高表达2-3,提示结肠可能是 SARS-Co
12、V、SARS-CoV-2 和 HCoV-NL63 的感染靶器官。结肠癌是常见消化道恶性肿瘤,其病死率高4。结肠癌患者感染 SARS-CoV-2 后更容易发展成重症新冠肺炎,且病死率升高(5%vs.20%)5。因此研究结肠癌患者对人冠状病毒的易感性对于判断结肠癌患者的预后至关重要。靶细胞表面受体的表达是影响细胞对病毒易感性的重要因素,因此本文旨在研究ACE2 在结肠癌中是否显著高表达,进而研究结肠癌细胞系对以 ACE2 为受体的三种人冠状病毒是否更易感。1 材料与方法1.1 细胞与组织标本结肠癌细胞(Caco2、HT-29、HCT-8 和 HCT-15)和人胚胎肠黏膜组织来源细胞 CCC-HIE
13、-2 为首都医科大学附属北京友谊医院消化科保存细胞。选取 2019 年 8 月至 2019 年 12 月在首都医科大学附属北京友谊医院手术切除的 15 例结肠癌组织及相应癌旁组织。纳入标准:初次确诊为结肠癌,治疗前未进行化学药物治疗、放射治疗及免疫治疗等其他治疗。本研究方案经首都医科大学附属北京友谊医院伦理委员会审批通过(2018-P2-058-05),均取得患者知情同意。1.2 实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)组织和细胞总核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)提取按照
14、Trizol 说明书进行。qRT-PCR 引物如下(上海生工生物公司合成):ACE2:CGAGTGGCTAATTT-GAAACCAAGAA,ATTGATACGGCTCCGGGACA。1.3 免疫组织化学染色法临床收集的结肠癌组织和癌旁组织经历石蜡包埋、组织切片、脱蜡、水化、抗原修复和阻断内源性过氧化物酶后,使用抗 ACE2 抗体和二抗对组织进行免疫组织化学染色,随后将组织切片用二氨基联苯胺显色并用苏木精复染以检测 ACE2 基因的蛋白表达。1.4 蛋白质印迹实验(Western blotting)取结肠癌细胞(Caco2、HT-29、HCT-8 和 HCT-15)和人胚胎肠黏膜组织来源细胞 C
15、CC-HIE-2 细胞,用细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)提取总蛋白,采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid assay,BCA)检测蛋白浓度后煮沸变性 10 min。每孔加样蛋白约 30 g 左右,凝胶成像分析仪采集图像并分析 ACE2 蛋白。1.5基于 GEPIA(GeneExpression profiling inter-active analysis)数据库在线分析 ACE2 基因的预后价值采用 Kaplan-Meier 生存曲线评估 ACE2 基因在患者中的预后价值。主要终点为总体生存率和无病生存率,使用风险比和 95%置信区间作为效应量。1.6 结肠癌细胞对人冠状病毒的
16、易感性测定人 冠 状 病 毒 SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-NL63 假病毒由中国食品药品检定研究院艾滋病与性病病毒疫苗室提供。将结肠癌细胞(Caco2、HT-29、HCT-8 和 HCT-15)和人胚胎肠黏膜组织来源细胞CCC-HIE-2 预先 12 h 铺于 96 孔细胞培养板中。细胞融合度接近 70%时,吸弃孔内培养基。用完全培养基将假病毒稀释至 1106半数组织培养感染剂量(tissue culture infective dose 50%,TCID50)/mL,每孔加入 100 L,培养 24 h 后,通过测量生物发光值来确定结肠癌细胞对人冠状病毒假病毒的易感性。
17、1.7 统计学方法所有数据均采用 GraphPad Prism 7.0 软件进行分析。计量数据采用均数标准差(xs)表示,两组均数比较使用独立样本 t 检验,多组间比较使用单因素方差分析,两两比较采用 LSD 检验。采用 Kaplan-Meier 法绘制生存曲线,生存分析采用 Log-rank 检验。以 P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 ACE2 在结肠癌组织中的表达基于 qRT-PCR 实验结果,分析结肠癌组织和正常结肠组织中 ACE2 的信使 RNA(massager RNA,mRNA)表达水平。结果显示,结肠癌组织中 ACE2 mRNA 水平显著高于正常结肠组织,差异具有统
18、计学意义(P 0.01,图 1A)。本研究进一步在临床样本中验证了 ACE2 基因的蛋白表达水平,免疫组织化学染色结果显示,与正常结肠组织相比,ACE2 基因在结肠癌组织中的蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P 0.01,图 1B、图 1C)。466第 4 期 宁婷婷等:ACE2 在结肠癌中表达的临床意义及结肠癌细胞对以 ACE2 为受体的三种人冠状病毒的易感性分析2.2 ACE2 在结肠癌细胞中的表达基于 qRT-PCR 实验结果,分析首都医科大学附属 北 京 友 谊 医 院 消 化 科 自 存 的 结 肠 癌 细 胞 系(Caco2、HT-29、HCT-8 和 HCT-15)和人胚
19、胎肠黏膜组织来源细胞系 CCC-HIE-2 中 ACE2 的 mRNA 表达水平。结果显示,与 CCC-HIE-2 细胞相比,ACE2 在Caco2、HT-29、HCT-8 和 HCT-15 等结肠癌细胞中的mRNA 水平升高(图 2A),但只有 Caco2 细胞中 ACE2的 mRNA 表达水平差异有统计学意义(P0.05)。本研究进一步利用 Western blotting 检测上述结肠癌细胞系和人胚胎肠黏膜组织来源细胞系 CCC-HIE-2 中 ACE2 蛋白表达情况。结果显示,ACE2 在Caco2、HT-29、HCT-8 和 HCT-15 等结肠癌细胞中的蛋白表达上调(图 2B、图
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