菜豆R2R3-MYB基因家族鉴定及其在BCMV侵染后的表达分析.pdf
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1、山西农业科学 2023,51(9):1020-1033Journal of Shanxi Agricultural Sciences菜豆 R2R3-MYB基因家族鉴定及其在 BCMV侵染后的表达分析王古悦,唐慕宁,牛静雅,冯雪(山西农业大学 植物保护学院,山西 太谷 030801)摘要:为了明确菜豆 R2R3-MYB基因家族的成员及受到 BCMV 侵染后的表达情况,利用生物信息学方法对菜豆 R2R3-MYB 基因家族成员进行鉴定和系统分析,同时利用 BCMV 侵染菜豆后在显症期的转录组数据筛选可能与 BCMV 侵染调控相关的 R2R3-MYB 基因家族成员,并对这些基因在病毒侵染不同阶段的表达
2、模式进行实时荧光定量 PCR 分析。结果表明,菜豆 R2R3-MYB 基因家族共有 159 个成员,不均匀分布于菜豆 11 条染色体上,多含有 2 个内含子,编码 184554 个氨基酸,均为亲水性蛋白。系统进化关系将菜豆 R2R3-MYB 基因家族成员分为 32 个亚组(P1P32),同一亚组成员具有高度保守的基因结构和基序。菜豆基因组内共线性分析表明,片段复制事件和串联复制事件均进行了纯化选择。转录组数据显示,BCMV 侵染前后菜豆接种叶和系统叶分别有 20、33 个差异表达基因;qRT-PCR 分析表明,这些基因在病毒侵染后表达均有变化,其中,PvMYB18、PvMYB33、PvMYB9
3、2、PvMYB93 在侵染早期和显症期均呈现先升高后降低的趋势,而 PvMYB29、PvMYB97、PvMYB124、PvMYB128、PvMYB134仅在侵染早期剧烈响应,这些基因的表达特点揭示其可能参与了菜豆对 BCMV侵染不同阶段应答反应的调控。关键词:菜豆;R2R3-MYB基因家族;BCMV;表达分析中图分类号:S643.1 文献标识码:A 文章编号:10022481(2023)09102014Identification of R2R3-MYB Gene Family in Common Bean(Phaseolus vulgaris L.)and Expression Analys
4、is after BCMV InfectionWANG Guyue,TANG Muning,NIU Jingya,FENG Xue(College of Plant Protection,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)Abstract:The purpose of this study is to clarify the members of R2R3-MYB gene family in common bean and their expression after being infected by BCMV.Identi
5、fication and systematic analysis of R2R3-MYB gene family members in common bean was conducted by bioinformatics method.Meanwhile,R2R3-MYB gene family members that may be related to the regulation of BCMV infection were screened by transcriptome data obtained at symptomatic stage after BCMV infection
6、 of common bean,and the expression patterns of these genes at different stages of virus infection were analyzed by qRT-PCR.The results showed that total there were 159 members of R2R3-MYB gene family in common bean,they were unevenly distributed on 11 chromosomes of common bean,most of them containe
7、d 2 introns,and encoded 184-554 amino acids,all of them were hydrophilic proteins.R2R3-MYB gene family members in common bean were divided into 32 subgroups(P1-P32)according to the phylogenetic relationship,and the same subgroup members had highly conserved gene structures and motifs.The collinearit
8、y analysis in the genome of common bean showed that both segmental replication events and tandem replication events had evolved under purifying selection.Transcriptome data showed that there were 20 and 33 differentially expressed genes in the inoculated leaves and system leaves of common bean befor
9、e and after BCMV infection,respectively.qRT-PCR analysis showed that the expression of these genes changed after virus infection,among which PvMYB18,PvMYB33,PvMYB92,and PvMYB93 showed a trend of increasing first and then decreasing at the early and symptomatic stages of viral infection.However,PvMYB
10、29,PvMYB97,PvMYB124,PvMYB128,and PvMYB134 only responded strongly at the early stage of infection.The expression characteristics of these genes suggested that they might be involved in the regulation of common bean response to BCMV infection at different stages.Key words:common bean;R2R3-MYB gene fa
11、mily;BCMV;expression analysisdoidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.09.07收稿日期:2023-01-28基金项目:国家自然科学基金青年项目(32202247);山西省自然科学研究面上项目(20210302123367);山西省回国留学人员科研资助项目(2020-063)作者简介:王古悦(1997-),女,山西长治人,在读硕士,研究方向:植物病毒基因功能及寄主互作关系。通信作者:冯雪(1984-),女,黑龙江牡丹江人,教授,博士,主要从事植物病毒基因功能及寄主互作关系研究工作。1020王古悦等:菜豆 R2R3-MYB基因家族鉴定
12、及其在 BCMV侵染后的表达分析转录因子由 DNA 结合域、转录调控区、核定位信号和寡聚位点 4 个功能域组成1。根据 DNA 结合域的特异性,可将转录因子分为若干个不同的家族2。MYB 基因家族是植物最大的转录因子家族之一,根据结构数不同又可将 MYB划分为 4个亚 家 族:1R-MYB(MYB-related)、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB(3R-MYB)、4R-MYB3。其中,R2R3-MYB亚家族是 MYB转录因子中最丰富的一类,在植物生长发育、次生代谢和非生物/生物胁迫中起着 重 要 的 作 用3-5。目 前,在 拟 南 芥(Arabidopsis thaliana L.)
13、3、甜 樱 桃(Prunus avium L.)6、烟 草(Nicotiana tabacum L.)7等 多 种 植 物 中 鉴 定 出R2R3-MYB 基因家族成员。李彤等8用 VIGS 基因 沉 默 技 术 和 实 时 荧 光 定 量 PCR 发 现,番 茄SlMYB28 参与调控番茄黄叶卷曲病毒侵染;张亚丽等9在苹果愈伤组织中过表达 MdMYB30并结合实时荧光定量 PCR 发现,苹果 MdMYB30 可增强对病原菌的抗性;邱正坤等10利用 VIGS 基因沉默和过表达技术发现,茄子 SmMYB44可增强对青枯病的抗性等。然而,关于菜豆 R2R3-MYB 基因家族成员的数量和特点还未见报
14、道。菜豆(Phaseolus vulgaris L.)又称芸豆,是豆类食物来源之一,因其营养丰富、用途多样而备受关注11。菜 豆 普 通 花 叶 病 毒(Bean common mosaic virus,BCMV)是菜豆及其他豆类上最常见和危害最严重的病毒之一。BCMV 侵染菜豆后可引起花叶、矮 缩、畸 形、坏 死 等 症 状,严 重 时 可 造 成 绝收12-13。本研究通过对菜豆 R2R3-MYB 基因家族成员进行鉴定和综合分析,包括理化性质、基因结构、顺 式 作 用 元 件、染 色 体 定 位、共 线 性 分 析、BCMV 侵染后的基因表达模式等,旨在解析菜豆R2R3-MYB 基因家族成
15、员在 BCMV 侵染后的生物学功能。1 材料和方法1.1菜豆 R2R3-MYB 基因家族成员鉴定及特征分析从 Phytozome v13 数据库(https:/phytozome-next.jgi.doe.gov/)下载菜豆参考基因组序列和注释文件。从 TAIR 数据库(http:/plants.ensembl.org/index.html/)下载拟南芥参考基因组序列和注释文件,将 126 个拟南芥 R2R3-MYB 蛋白序列作为靶序列,通过TBtools、NCBI的Blast(http:/www.ncbi.nlm.nhi.gov/)、NCBI 的 Conserved Domain Searc
16、h(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/?term=)分析,剔除没有 MYB 结构域、MYB 结构域不完整或重复的序列,并利用 SoftBerry 网站(http:/ 全 剪 接 不 完 整 的 序 列。利 用ExPASy网站(https:/web.expasy.org/protparam/)预测菜豆 R2R3-MYB 基因家族成员的理化性质。利用 CELLO v.2.5 网站(http:/cello.life.nctu.edu.tw/)进行亚细胞定位预测。利用 MUSCLE对菜豆R2R3-MYB 进行多序列比对,后利用 TBtools软件进行可视化。1.2菜豆 R
17、2R3-MYB基因家族成员系统进化分析利 用 MEGA-X 软 件 采 用 邻 接 法,校 验 参 数Bootstrap设置为 1 000,其他参数保持默认值,构建系统进化树。利用 iTOL 网站(https:/itol.embl.de/)美化进化树。1.3菜豆 R2R3-MYB 基因家族成员保守基序、基因结构、顺式作用元件分析利 用 MEME 网 站(https:/meme-suite.org/meme/tools/meme)预测菜豆 R2R3-MYB 基因家族成员的保守基序序列,设置最大基序数为 20,其他参数保持默认值。利用 TBtools 软件提取菜豆R2R3-MYB 基因家族成员起始
18、密码子上游 2 kb序列 信 息,并 利 用 PlantCARE 网 站(http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)预测顺式作用元件。1.4菜豆 R2R3-MYB 基因家族成员染色体定位及共线性分析根据菜豆基因组注释文件,得到基因在染色体上的位置信息,并利用 TBtools 软件进行可视化。利用 TBtools软件分析菜豆基因组内和菜豆与拟南芥基因组间的共线性关系,并计算每对复制事件的非同义替代率(Ka)、同义替代率(Ks)和 Ka/Ks值。根据 Ks值和突变率=1.510-8,估计菜豆复制事件分化时间(T=Ks/2)
19、14。1.5菜豆 R2R3-MYB 基因家族成员在 BCMV侵染后的转录组分析以 菜 豆 Dubbele Witte(DW)为 试 验 材 料,于28 (光照 16 h)/25 (黑暗 8 h),相对湿度 50%的人工培养箱生长。在菜豆 DW 子叶完全展开时,BCMV分离物 C54摩擦接种菜豆 DW,PBS 溶液摩擦菜豆 DW 作为对照组,接毒 14 d后分别采集接种叶和系统叶,所有样品于液氮速冻后送至北京百迈客生物科技有限公司进行 RNA-Seq分析。FPKM值进行 Log2(FPKM+1)转换并利用 TBtools 软件1021山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期绘制表达热图,
20、以|FC|1.5 且 FDR0.05 作为筛选差异表达基因的标准,每个处理设置 3次生物学重复。1.6实时荧光定量 PCR分析分别采集 0、2、4、8、16 h和 1、3、5、7、14、21 d的叶片,利用Trizol(Biosharp,中国)提取叶片总RNA,使 用 Hiscript All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR反转录试剂盒(Vazyme,中国)合成cDNA。利用 IDT 网站(https:/ 1),以 Act11 为内参基因15,使用 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒(Vazyme,中国)在实
21、时荧光定量 PCR 仪上进行试验。反应体系为20 L:2ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 L,ddH2O 8.2 L,上下游引物各 0.4 L,cDNA 1 L。PCR 反应程序为:95 3 min;95 10 s 和 60 15 s 进行 40 个循环;95 15 s,60 1 min,95 15 s。设置 3次技术重复,采用 2-CT计 算 目 的 基 因 的 相 对 表 达 量,利 用GraphPad Prism 8作图。2 结果与分析2.1菜豆 R2R3-MYB基因家族成员染色体定位利用 TAIR、SoftBerry、NCBI、TBtool
22、s 等工具对菜豆 R2R3-MYB 基因家族成员进行筛选和鉴定,最终得到 159 个 R2R3-MYB 基因家族成员,其中 157个不均匀分布在 11条染色体上,依据在染色体的排列顺序分别命名为 PvMYB1PvMYB157;而 PvMYB158和 PvMYB159未定位到染色体。染色体定位结果显示,3号染色体分布的基因最多,有21个,而 6号染色体分布的基因最少,只有 8个。大多数基因聚集在染色体两端(图 1)。表 1 实时荧光定量 PCR引物序列Tab.1 The primer sequences used for qRT-PCR基因名称Gene namePvMYB18PvMYB29PvM
23、YB33PvMYB92PvMYB93PvMYB97PvMYB124PvMYB128PvMYB134Act11上游引物(5 3)Forward primer(5-3)TAACGCTCGCTGACAACTCCTTCGGCTTCGCTTCAGTTAGCAGGGACCTTGTATGAGTATGTCGAGTGAGACTACCACATACTGTCCTATCCACCCTCCTAAGTGAGTGGGAAGAGTTGCAGATTAGGAGGGTTGGAGTTCTTCTATGTTCCCTCTTCTCACCAAGTTTCGAACTATCTGAAGCCAACCATTTCTGCATACGTTGGTGATGAGG下游引物
24、(5 3)Reverse primer(5-3)CCTGTGGCGTGGAGTATTTCATCCTCAGTGCTGCTACTTCGATGCATGAACCACTGTTGTGGACCCTTCTTCAATCCCATCTTGACTCCATGGCCCTTTCTTTACGAGAGTGAAGGTCGAGAATTAGGAAGCAACAAGAGGAGGATACAGCCAGTAATGTTCCCATACCATTCACTGCGTCCTGGTAATCAGCCTTGGGGTTAAGAGGAG图 1菜豆 R2R3-MYB基因家族成员在染色体上的分布Fig.1Chromosome distribution of R2R3-M
25、YB gene family members in common bean1022王古悦等:菜豆 R2R3-MYB基因家族鉴定及其在 BCMV侵染后的表达分析2.2菜豆R2R3-MYB基因家族成员鉴定及特征分析理化性质分析可见,159 个菜豆 R2R3-MYBs编码蛋白的长度为 184554个氨基酸,分子质量为20 692.4561 028.67 u,等电点为 4.7910.34,所有蛋白亲水性值小于0,158个蛋白不稳定系数大于40,亚细胞定位预测显示,155个成员位于细胞核(表2)。表 2 菜豆 R2R3-MYB基因家族成员信息Tab.2 Information of R2R3-MYB g
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