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554研究论著新医学 2023 年8 月第 54 卷第 8 期microRNA-124 过表达对肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响朱键 陈天天 刘智勇 郑常龙【摘要】目的 研究过表达微 RNA-124（miR-124）对肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响及初步探索其可能机制。方法 使用野百合碱（MCT）经腹腔注射建立大鼠肺动脉高压模型，气管内滴注腺相关病毒（AAV）介导的 miR-124进行干预，记录大鼠心脏右室收缩压（RVSP）、平均动脉压和心率，实时荧光定量 PCR 法检测大鼠肺组织中 miR-124的表达，van Gieson 染色观察肺内小动脉的重构程度并计算血管外径在 2550 m 以及 51100 m 的肺小动脉的中膜/外径比值，蛋白免疫印迹法检测肺组织中 IL-6 与 p-STAT3 的蛋白水平。结果 miR-124 在肺动脉高压大鼠肺组织中呈低表达；过表达 miR-124 可导致肺动脉高压大鼠 RVSP 下降，肺内小动脉中膜/外径明显降低，肺组织中 IL-6 和p-STAT3 的表达下调。结论 AAV 介导的 miR-124 过表达可明显减轻肺动脉高压的大鼠的 RVSP 以及肺血管重构，其机制可能与下调 IL-6 和 p-STAT3 的表达有关。【关键词】微核糖核酸-124；肺血管重构；肺动脉高压Effect of overexpression of microRNA-124 on pulmonary vascular remodeling in rats with pulmonary arterial hypertension Zhu Jian，Chen Tiantian，Liu Zhiyong，Zheng Changlong.Department of Emergency，the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，ChinaCorresponding author，Zheng Changlong，E-mail:【Abstract】Objective To evaluate the effect of overexpression of microRNA-124（miR-124）on pulmonary vascular remodeling，and to unravel the potential mechanism in rats with pulmonary arterial hypertension（PAH）.Methods In the monocrotaline（MCT）-induced PAH rat models，intratracheal infusion of miR-124 carried by adeno-associated virus（AAV）was performed.The right ventricular systolic blood pressure（RVSP），mean systolic arterial pressure and heart rate were recorded.The expression level of miR-124 in lung tissues of rats was detected by real-time quantitative PCR.The histological morphology of pulmonary arterioles was observed by van Gieson staining.The ratios of medium to outside diameter of pulmonary arterioles with vessel diameters in 25-50 m and 51-100 m were calculated.The expression levels of IL-6 and p-STAT3 protein in lung tissues were detected by Western blot.Results The expression level of miR-124 was down-regulated in pulmonary tissues of rats with PAH.RVSP was significantly decreased，the ratios of medium to outside diameter of pulmonary arterioles were significantly attenuated，and the expression levels of IL-6 and p-STAT3 proteins were significantly down-regulated by overexpression of miR-124.Conclusion AAV-mediated overexpression of miR-124 can significantly reduce RVSP and pulmonary vascular remodeling in rats with PAH，probably by down-regulating the expression levels of IL-6 and p-STAT3.【Key words】MicroRNA-124；Pulmonary vascular remodeling；Pulmonary arterial hypertension肺动脉高压（PAH）是一种由肺血管重构引起的逐渐加重、病死率较高、预后较差的心血管疾病1。PAH 的一个重要特征是肺微血管床进行性减少、肺小动脉重构进行性增加，导致肺的血管阻力也进行性增加，气血交换减少，缺氧进行性加重，最终导致肺动脉压明显升高和右心衰竭，严重者可致死亡2。目前，临床上针对肺血管张力增加的药物，如磷酸二酯酶抑制剂和内皮素受体拮抗剂，可以缓解部分 PAH 患者的临床症状和改善血流动力学参数，但其作用靶点并不能逆转肺血管重塑，疗效有限，无法有效降低 PAH 患者的病死率3。因此，抑制或逆转肺血管重构的治疗策基金项目：国家自然科学基金（81500287）作者单位：510630 广州，中山大学附属第三医院急诊科（朱键，刘智勇，郑常龙），心胸外科（陈天天）通信作者，郑常龙，E-mail:DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2023.08.005欢迎扫码观看 文章视频简介2023 年8 月第 54 卷第 8 期555新医学 略可能是治疗 PAH 的新方法。微 RNA-124（miR-124）被发现在神经细胞中大量表达、在神经发育中具有重要作用4。既往研究结果表明，miR-124可抑制 PAH 患者的血管平滑肌细胞的增殖，并可降低肺血管成纤维细胞的增殖和迁移5-6。然而，通过腺相关病毒（AAV）介导 miR-124 持续过表达能否有效抑制外膜成纤维细胞和血管平滑肌细胞的异常增殖，从而进一步减轻肺血管重构、治疗 PAH 呢？miR-124 在 PAH 中的作用及其作用机制如何亦尚不明确。因此，本研究拟用 miR-124过表达的方法干预野百合碱（MCT）诱导的 PAH大鼠模型，观察其对 PAH 大鼠肺血管重构的变化，并初步探索其可能的分子机制，为临床治疗 PAH提供动物实验理论基础。材料与方法一、实验动物和试剂Sprague Dawley（SD）雄性大鼠 32 只，无特定病原体（SPF）级，体重 180200 g，购自中山大学动物实验中心，由该中心 SPF 级动物房负责饲养，自由饮水、进食。本研究经中山大学实验动物伦理委员会批准（批件号：IACUC-DB-16-1113），动物实验操作均按国家相关实验动物保护标准和动物使用指南进行。MCT 购自美国 Sigma 公司。磷酸化信号转导和转录激活因子 3（p-STAT3）、STAT3 及 GAPDH抗体购自美国 Cell Signaling Technology 公司，IL-6抗体购自英国 Abcam 公司。AAV-U6-ZsGreen 购自汉恒生物科技（上海）有限公司。二、实验方法1.实验分组与大鼠 PAH 模型的建立32 只大鼠按照随机数字表法分为正常对照（control）组、MCT+生理盐水（MCT）组、MCT+AAV-绿色荧光蛋白（MCT+AAV-GFP）组和 MCT+miR-124（MCT+AAV-miR-124）组，每组 8 只。MCT+NS 组、MCT+GFP 组和 MCT+miR-124 组大鼠经腹腔注射 2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，采用自制气管导管套管插管，分别抽取 100 L 生理盐水、AAV-GFP（滴 度 为 2.01015 vg/L）和 AAV-miR-124（滴度分别为 1.41015 vg/L）通过微量注射器缓慢滴入气管（vg 为病毒基因组）。1 d 后，MCT+NS 组、MCT+GFP 组和 MCT+miR-124 经腹腔注射 MCT（60 mg/kg）制作大鼠 PAH 模型。2.大鼠血流动力学和右心室肥厚指数的监测 MCT 给药后 35 d（实验终点），经腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠后，分离右侧颈内静脉，置入 PE-100 聚乙烯导管，连接换能器测量右心室收缩压（RVSP）以反映肺动脉收缩压。随后分离出右侧颈动脉，置入 PE-50 聚乙烯导管测量平均收缩动脉压（mSAP）和心率（HR）。血流动力学检测后处死大鼠，分离并取出大鼠心脏和肺，4 磷酸盐缓冲液冲洗干净，将左右心房剪去，分别分离出右心室（RV）、左心室及室间隔（LV+S）进行称重（本部分操作由不清楚实验分组的实验员完成以避免主观性偏倚），计算右心室与左心室加上室间隔之和的比值即为右心室肥厚指数（RVHI），RVHI=RV/（LV+S）。3.实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测肺组织中 miR-124 的表达将约 100 mg 大鼠右肺组织剪碎加入 1 mL 含RNA 降解酶的 TRIzol 液中，研磨裂解，随后加入氯仿提取肺组织总 RNA，经纯化后用紫外分光光度法测定 RNA 浓度及纯度。使用 RT-qPCR 试剂盒进行逆转录反应，引物序列见表 1，扩增条件为：50 2 min；95 2 min；95 15 s；60 32 s，40 个循环。PCR 扩增完成后，采用按 2-Ct相对定量计算 miR-124 及内参 U6 RNA 的表达。4.肺动脉组织 van Gieson 染色左肺组织经 4%多聚甲醛-PBS 液中固定，石蜡切片后行 van Gieson 染色，由 2 名研究人员在光镜下观察肺组织病理变化。在高倍镜（400 倍）下观察肺血管形态，对外径在 25100 m 的肺小动脉进行拍照（为避免偏倚，拍照者对实验分组情况不知情）。使用图片处理软件测量肺内小动脉的中膜以及血管外径的长度，计算二者的比值即为中膜/外径比值。每张切片随机选取 1015 个肺小表 1 引物序列 引物名称正向引物反向引物miR-1245-TGCGTGTTCACAGCGGACCT-35-TGGCATTCACCGCGTGCCTT-3U65-CTCGCTTCGGCAGCACA-35-AACGCTTCACGAATTTGCGT-32023 年8 月第 54 卷第 8 期556新医学 动脉，分别选取血管外径在2550 m、51100 m 肺内小动脉，对其中膜/外径比值进行统计分析，以了解不同大小的肺内小动脉重构严重程度。5.蛋白免疫印迹法检测取约 50 mg 大鼠右肺组织，剪碎后加入组织蛋白裂解液裂解，置于冰上反复充分研磨，离心后取上清液，考马斯亮蓝法测蛋白质浓度。按试剂盒说明书步骤操作，分别加入抗 IL-6、GAPDH、STAT3 及 p-STAT3 抗体（均为 1 1 000），4孵育过夜，洗膜后加入山羊抗兔 IgG（1 2 000）孵育，TBST 溶液再次洗膜后用 ECL 发光液进行发光显影。凝胶成像系统拍照后，使用 Image J 软件对各条带进行测量和分析。三、统计学处理使用 SPSS 23.0 分析数据。计量资料经检验呈正态分布，以表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较采用LSD-t法。P 0.05 为差异有统计学意义。结 果一、miR-124 在 4 组大鼠肺组织中的表达 4 组大鼠肺组织中 miR-124 表达水平比较差异有统计学意义（F=192.843，P 0.05）。相比于control 组，miR-124 在 MCT+NS 组和 MCT+GFP 组大鼠的肺组织中表达减少（P 均 0.05）；相比于MCT+GFP 组，miR-124 在 MCT+miR-124 组大鼠的肺组织中表达增加（P 0.05）。见图 1。二、miR-124 过 表 达 对 PAH 大 鼠 RVSP 和RVHI 的影响 MCT 注射 5 周后达到实验终点时，control 组大 鼠 均 存 活，MCT+NS 组、MCT+AAV-GFP 组 和MCT+AAV-miR-124组分别有2、2、1只大鼠死亡，死亡原因考虑为右心衰竭。各组大鼠血流动力学检测及 RVHI 结果提示，MCT+NS 组大鼠的 RVSP高于 control 组 （71.99.9）vs.（23.21.9）mmHg，P 0.01）；MCT+miR-124 组 RVSP 低于 MCT+GFP组 （49.37.7）vs.（75.117.9）mmHg，P 0.01）（图 2A）。MCT+NS 组大鼠右心肥厚指数（RVHI）高于control组（0.600.10 vs.0.240.02，P 0.01），MCT+miR-124 组 RVHI 低 于 MCT+GFP 组（0.45 0.08 vs.0.590.08，P 0.05）（图 2C、D）。三、miR-124 过表达对 PAH 大鼠肺血管重构的影响肺 组 织 切 片 行 van Gieson 染 色 结 果 提 示，control 组大鼠肺内血管外径在 2550 m（图 3A）和 51100 m（图 3C）的小肺动脉管壁结构清楚，厚度正常，中膜未见明显增厚，MCT+NS 组和MCT+AAV-GFP 组肺小动脉中膜明显增厚、管腔变窄，提示 MCT+NS 组和 MCT+AAV-GFP 组大鼠肺内小动脉发生肺血管重构，而 MCT+miR-124 组大鼠肺动脉中膜肥厚程度明显减轻。血管外径在 2550 m（图 3B）和 51100 m（图 3D）的肺内小动脉中膜/外径比值统计结果提示：MCT+NS 组和 MCT+GFP 组肺内小动脉中膜/外径比值高于 control 组，而 MCT+miR-124 肺内小动脉中膜/外径比值低于 MCT+GFP 组。4 组间比较差异有统计学意义（F 值分别为 33.170 和49.680，P 均 0.05）。四、miR-124 过表达对 PAH 大鼠肺组织中IL-6 和 p-STAT3 表达的影响蛋白免疫印迹检测结果提示，MCT+NS 组和MCT+AAV-GFP 组大鼠肺组织中 IL-6 和 p-STAT3蛋 白 的 相 对 表 达 量 高 于 control 组（P 0.05）；MCT+AAV-miR-124 组 IL-6 和 p-STAT3 蛋白的相对注：n=4；与control组比较，*P0.05；与MCT+AAV-GFP 比较，#P0.05。图 1 miR-124 在各组大鼠肺组织的表达2023 年8 月第 54 卷第 8 期557新医学 注：n=68；与 control 组比较，*P 0.05；与 MCT+AAV-GFP 组比较，#P 0.05。图 2 miR-124 过表达对 PAH 大鼠血流动力学和右心肥厚指数的影响表达量低于 MCT+NS 组和 MCT+AAV-GFP 组（P 0.05），IL-6 和 p-STAT3 蛋白在 4 组间比较差异有统计学意义（F 值分别为 21.94 和 31.88，P 均 0.05）。见图 4。讨 论本研究显示，MCT 经腹腔注射后可导致大鼠出现严重的 PAH 和肺血管重构，而采用 AAV 作为载体介导 miR-124 过表达可降低 MCT 诱导的大鼠右心室收缩压和肺血管重构程度。模型组 IL-6 和p-STAT3 的表达与正常对照组相比明显上调，而miR-124 的过表达可下调 MCT 诱导的 PAH 大鼠肺组织中 IL-6 和 p-STAT3 的表达，提示 AAV 介导的 miR-124 过表达降低 PAH 的机制可能与其下调IL-6 和 p-STAT3 的表达有关。miRNA 是一类长度 1823 nt 的非编码单链小分子 RNA，参与细胞的增殖、分化和凋亡、免疫反应、肿瘤发生等多种病理生理过程7。miRNA 在呼吸系统可通过不同的信号通路和靶点影响气道平滑肌细胞的增殖和迁移、上皮细胞的增殖和黏附、成纤维细胞增生、气道血管生成、杯状细胞的分泌和气道炎症的发生，从而影响气道重构8。miR-124 是在神经细胞中表达最丰富的微 RNA。但近年来人们发现 miR-124 在 PAH 中起着非常重要的作用9。多项研究发现：不管是在 PAH 患者还是 PAH 动物模型中，肺动脉外膜成纤维细胞和肺血管平滑肌细胞的 miR-124 表达均下调，而过表达 miR-124 能减轻肺血管成纤维细胞和血管平滑肌细胞的增殖和迁移10。本研究提示，AAV 介导的 miR-124 的过表达降低了 MCT 诱导的 PAH，减轻了肺内小动脉血管中膜/外径比，即改善了肺血管重构，其机制可能与 miR-124 的过表达抑制了肺动脉血管平滑肌细胞和成纤维细胞的异常增殖和迁移有关，其具体机制仍需更多研究明确。STAT3 是一种参与多种生物学功能的转录因2023 年8 月第 54 卷第 8 期558新医学 注：A 为血管外径 2550 m 的肺内小动脉 van Gieson 染色结果；B 为肺内小动脉中膜/外径比值定量分析结果；C为血管外径 51100 m 的肺内小动脉 van Gieson 染色结果；D 为肺内小动脉中膜/外径比值定量分析结果；n=68；与control 组比较，*P 0.05；与 MCT+AAV-GFP 组比较，#P 0.05。图 3 miR-124 过表达对 PAH 大鼠肺小动脉重构的影响注：A、C 为 IL-6 蛋白免疫印迹结果及定量分析；B、D 为 p-STAT3 蛋白免疫印迹结果及定量分析；n=68；与 control组比较，*P 0.05；与 MCT+AAV-GFP 组比较，#P 0.05。图 4 miR-124 过表达对 PAH 大鼠肺组织中 IL-6 和 p-STAT3 表达的影响2023 年8 月第 54 卷第 8 期559新医学 子，其能将细胞外信号转导至细胞核，将靶基因的转录激活，从而促进细胞增殖、存活、凋亡和炎症11。多项研究表明，促炎细胞因子 IL-6 在PAH 的发病机制中发挥重要作用12-13。IL-6 和受体结合后，可以使 STAT3 的酪氨酸 705 位点发生磷酸化，p-STAT3 可促进肺动脉平滑肌细胞的异常增殖并减少其凋亡14。Wang 等15的研究发现，过表达 miR-124 可以通过靶向调节 STAT3 降低促炎细胞因子 IL-6 的表达。另一项研究发现在口腔扁平苔藓间充质干细胞中，miR-124-3p 类似物过表达可降低 IL-6 和 STAT3 的表达，而 miR-124-3p 的低表达则会产生相反的结果16。本研究中，与 control组相比，加入 MCT 的肺组织中 p-STAT3 和 IL-6 的表达增加。与 MCT+GFP 组相比，MCT+miR-124组 IL-6 和 p-STAT3 蛋白的表达均下调。这提示miR-124 过表达改善 MCT 诱导的 PAH 的作用机制可能与其调节 IL-6/STAT3 信号通路分子的表达有关，未来仍需要更多的研究予以明确。综上所述，AAV 介导的 miR-124 过表达可减轻野百合碱诱导的肺动脉高压和肺血管重构，其机制可能是通过调控 IL-6/STAT3 信号通路实现的。本研究有望为肺动脉高压和肺血管重构的基因治疗提供实验基础。参 考 文 献1 Poch D，Mandel J.Pulmonary hypertension.Ann Intern Med，2021，174（4）：ITC49-ITC64.2 Mandras S A，Mehta H S，Vaidya A.Pulmonary hypertension：a brief guide for clinicians.Mayo Clin Proc，2020，95（9）：1978-1988.3 Ruopp N F，Cockrill B A.Diagnosis and treatment of pulmonary arterial hypertension：a review.JAMA，2022，327（14）：1379-1391.4 Ghafouri-Fard S，Shoorei H，Bahroudi Z，et al.An update on the role of miR-124 in the pathogenesis of human disorders.Biomedecine Pharmacother，2021，135：111198.5 Jiang Y，Liu H，Yu H，et al.Circular RNA Calm4 regulates hypoxia-induced pulmonary arterial smooth muscle cells pyroptosis via the circ-Calm4/miR-124-3p/PDCD6 axis.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2021，41（5）：1675-1693.6 Wang D，Zhang H，Li M，et al.MicroRNA-124 controls the proliferative，migratory，and inflammatory phenotype of pulmonary vascular fibroblasts.Circ Res，2014，114（1）：67-78.7 Diener C，Keller A，Meese E.Emerging concepts of miRNA therapeutics：from cells to clinic.Trends Genet，2022，38（6）：613-626.8 裘晨晖，陈晔.miRNA 在气道重构中的研究进展.新医学，2022，53（8）：546-550.9 Zhang H，Laux A，Stenmark K R，et al.Mechanisms contributing to the dysregulation of miRNA-124 in pulmonary hypertension.Int J Mol Sci，2021，22（8）：3852.10 Zhang H，Wang D，Li M，et al.Metabolic and proliferative state of vascular adventitial fibroblasts in pulmonary hypertension is regulated through a microRNA-124/PTBP1（polypyrimidine tract binding protein 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oral lichen planus.Biomed Pharmacother，2018，105：151-158.（收稿日期：2023-03-01）（本文编辑：林燕薇）