乙肝血清标志物检测的临床意义.doc

乙型肝炎病毒血清五项标志物（“两对半”）的空军总医院感染内科周平
临床意义

1. 乙型肝炎表面抗原(HBsAg)
　　HBsAg是机体感染HBV的标志，也是在机体血清中首先出现的病毒标志物。HBsAg出现的时间，与机体感染HBV的途径和感染的剂量有关。如果系输用 HBsAg 阳性血，2周后即可检测到HBsAg，如用RIA法检测，于接种后6天，血清中即可出现HBsAg阳性；如感染剂量少，HBsAg出现阳性的时间可达3～4个月，甚至6个月；一般在感染HBV后4～6周可出现HBsAg阳性。HBsAg出现阳性后1～7周(平均约4周)才出现肝炎症状和肝功能异常。经血感染者，其潜伏期约为2个月；经口感染者，其潜伏期大约为3个月。
　　急性乙肝病程一般持续１－３个月，80%～90%的患者可以临床治愈［1］。HBsAg阳性在血中一般持续１－６周，长者可达２０周（14－148天）；在肝炎症状出现后1～4周或血清转氨酶达高峰后1～12周消失，如果HBsAg阳性持续超过6个月仍不转阴则称为持续阳性或慢性携带状态; 如系急性乙肝，HBsAg持续阳性超过6个月则提示慢性化。我国HBV感染(急性和慢性)的人群中每年大约有4%～10%的HBsAg阳性者转阴，同时每年又有约4%～10%的人群由易感人群成为受感染者，因而，人群HBV感染状态在不断变化［2］。HBsAg阳性持续的时间和急性乙肝慢性化的比例与感染者的年龄有关，年龄愈小，形成持续感染或病情慢性化的概率愈大；围产期感染的婴儿80%将成为HBsAg的携带者；幼儿期感染者约30%将成为持续HBsAg携带者，正常成年人感染HBV后形成持续性感染的比例可能在5%以下；社会普通人群中约35%～50%的HBsAg阳性携带者是在母婴围产期感染的［3］。
   临床上，HBsAg阳性可见于急性乙肝患者的潜伏期、急性期；慢性乙肝，无症状携带者；部分肝硬化和肝癌患者的血清中和受HBV感染的肝细胞浆中。
HBsAg阳性一般来说表明机体内存在HBV感染，但阴性也不能完全排除HBV感染。原因是：①可能由于HBV和HBsAg含量极少，检测方法不够灵敏而漏检，或因试剂质量和操作问题而出现假阴性；②S基因变异引起HBsAg的表达和分泌发生障碍，体内虽存在HBV，但血清中测不到HBsAg或很少[5,6]；③S基因变异后所表达的HBsAg 不能被现在广泛使用的一些试剂所测出[7,8]。后两者虽HBsAg阴性，但往往伴有HBeAg、抗-HBe和抗-HBc等其他HBV感染标志物的阳性。即使真正阴性，也不能完全排除HBV感染，因为有8%的乙肝患者，症状开始之前HBsAg已转阴；如抗-HBs或抗-HBe于发病后2～9个月出现阳性者，仍可诊断为急性乙肝［9］。在暴发性乙肝中，常常抗-HBs提前出现，而HBsAg阴性；输用HBsAg阴性而抗-HBc阳性的血液后，可发生急性乙型肝炎。采用PCR技术可以进一步证实，某些HBsAg阴性的肝炎患者及献血人员中的血清中存在HBVDNA［10］。
在分析HBsAg阳性结果时，有几点应注意：①不能以HBsAg滴度的高低来判断肝炎或感染者病情的轻重。因为HBV感染者血清中HBsAg的滴度经常在波动，其滴度高低和病情之间并无直接关系，HBsAg滴度上升并不表明病情就严重，下降也不表明病情在好转；有人甚至认为HBsAg滴度和病情呈反比。②不能以HBsAg的滴度来判断肝炎的类型。③HBsAg的滴度高低，也不能用来判断传染性的有无。HBsAg本身不含病毒核酸，不具传染性，但HBsAg阳性血清，不论其滴度高低都可能含有具有传染性剂量的病毒颗粒。如果HBVDNA整合至宿主肝细胞DNA中，血清中无游离病毒颗粒，此时HBsAg阳性血液则无传染性。④HBsAg滴度不能作为评价或判断某药物临床治疗效果的指标。前面讲过，HBsAg既不反映病情的严重程度，又不含病毒的核酸成份，本身还经常波动，以HBsAg滴度的升降说明某种药物的效果，是没有科学根据的［11］。

2. 乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)
　　抗-HBs是一种中和抗体，对HBV具有保护性免疫，可中和HBV感染、抵御再次感染。多数自限性HBV感染的患者，其抗-HBs出现在急性感染的恢复期，80%的患者于HBsAg消失、临床症状消退数周至数月内出现抗-HBs。抗-HBs出现的早晚和滴度的高低，与重复感染有关。首次感染者，多在4～5个月出现，滴度不高，持续6个月～3年；再次感染者，2周后即可检出高滴度的抗-HBs。抗-HBs阳性率在急性乙肝恢复期最高，其他各型乙肝检出率均低。一般说来，抗-HBs阳性血清HBsAg/抗-HBs-IgM阴性，ALT正常。
抗-HBs阳性可见于：(1)乙型肝炎的恢复期；(2)HBV既往感染者；(3)乙肝疫苗接种后；(4)部分暴发性乙型肝炎；自然感染康复后的患者血清抗-HBs和抗-HBc呈双阳性，由于抗-HBc持续存在的时间较长(＞8～10年)，抗-HBs持续存在的时间较短(6个月～3年)，故单项抗-HBs阳性少见(接种乙肝疫苗除外)，单项抗-HBs阳性且为低滴度时多为非特异性反应所致假阳性［2］。

3. 乙型肝炎e抗原(HBeAg)
HBeAg是乙型肝炎核心抗原的可溶性成份，常常与血清HBVDNA、DNA-P及Dane颗粒同时存在，为HBV复制和具有传染性的标志。通常HBeAg迟于HBsAg 1周出现，先于HBsAg 2周消失；若HBeAg持续阳性超过10周，表明病情可能趋向慢性。血清中HBeAg阳性，仅见于：HBsAg阳性的急性肝炎、慢性肝炎、无症状HBsAg携带者和部分肝硬化、肝癌患者。慢性感染者，随着年龄增长，HBeAg阳性率下降；慢性乙肝患者HBeAg每年自然阴转率为25.6%。无症状携带者为9.3%［14］。

4. 乙型肝炎e抗体(抗-HBe)
　　抗-HBe出现于HBeAg阴转后，抗-HBe的出现表明传染性下降。过去认为抗-HBe是HBV感染恢复或无传染性的指标。近年来研究发现，抗-HBe阳性的血清仍可能有传染性，只是远较HBeAg阳性的血清传染性为小而已。
一般来说，抗-HBe阳性患者血清中HBV复制水平较低，病情趋向稳定和恢复，但临床上仍可见到相当一部分抗-HBe阳性患者的病情仍波动，或在发展。其主要原因是HBV并没有因抗-HBe阳性而消除，HBV在机体内仍存在和复制。有研究表明：在抗-HBe阳性的慢性活动性肝炎中，采用PCR技术检测，87%的患者血清中可检出HBVDNA［10］。肝内HBsAg、HBcAg检测和HBVDNA原位杂交研究发现：抗-HBe阳性慢性肝炎患者中，26.7%HBV复制活跃，53.3%为不完全复制与表达，仅20%为非复制状态。慢性乙肝HBeAg向抗-HBe的血清学转换可伴有ALT水平升高，随之HBV复制水平降低，但并不意味着HBV的彻底清除［2, 10］，肝组织学正常的HBV携带者血清中可检出HBeAg，而组织学证实有慢性活动型肝炎存在的患者，其血清中抗-HBe可以阳性，说明HBeAg不一定是慢性乙肝活动的标志，抗-HBe亦不能作为健康携带的指标。
5. 乙型肝炎核心抗体(抗-HBc)
抗-HBc是HBV抗体系统中出现较早的抗体，急性HBV感染，HBsAg出现后3～5周，临床症状出现之前即可检出，且在肝炎恢复期呈高滴度；HBsAg阳性的时间越长，抗-HBc的滴度越高［2, 9］。临床上，多以竞争抑制法检测抗-HBc，为总抗体，包括IgG、IgM、IgA和IgE型抗-HBc，早期以抗-HBcIgM为主，持续6～18周，以后以抗-HBcIgG为主，该抗体可在体内持续数年甚至数十年［11］。通常，高效价的抗-HBc，见于急、慢性肝炎和HBsAg携带者，并表明HBV复制可能仍活跃，血清具有传染性；低效价的抗-HBc则表示既往感染过HBV，一般无传染性。
抗-HBc单项阳性是临床中一种常见的模式，对于这种单项抗-HBc阳性的解释：①急性感染的恢复早期(窗口期)。HBsAg减少或消失，而抗-HBs尚未产生，抗-HBc是唯一能检出的特异性HBV指标。②被动获得的抗-HBc。HBsAg携带者母亲所生婴儿，母亲体内IgG型抗-HBc可经胎盘转移给婴儿，此种母传抗-HBc在婴儿体内可存在一年以上；输用抗-HBc阳性的血液或血制品。③远期感染伴抗-HBs消失。因抗-HBc可持续存在8～10年以上，而抗-HBs在机体内只持续存在6个月～3年。④远期感染伴低水平HBsAg。 

1．HBsAg（乙肝表面抗原）：HBsAg在HBV感染的检测中一直是最为重要的标志物。HBsAg有一个特异的共同抗原决定簇“a”和至少两个亚型决定簇“d／y”和“w／r”，最常见的血清型为adw、adr和ayw。我国绝大多数地区以adr为主，adw次之(于长江以南诸省与adr混存)；新疆、西藏、内蒙古自治区的本地民族几乎全为ayw。目前国内最常用的HBsAg免疫测定方法为酶联免疫吸附试验(ELISA)，使用针对HBsAg的a决定簇的单克隆和多克隆抗体，为双抗体夹心测定模式。ELISA简单、方便、快速，测定下限进口试剂盒可达0．15ng／na，国产试剂盒目前也能达到0．5 ng／m~以下，接近或好于某些进口试剂。血清中检出HBsAg是乙型肝炎的早期诊断指标之一。HBV感染后，除急性外，大部分人没有临床表现，绝大多数人病毒会被清除，但有部分人会转为慢性或携带者，携带者在血中可检出HBsAg，但没有临床症状。血清HBsAg仅为HBV感染的标志，由于其在血液多为不含病毒颗粒的空壳，故而不反映病毒有无复制、复制程度、传染性强弱及预后。
    HBsAg的测定敏感性与HBV基因型或亚型有关，以单抗为基础建立的HBsAg免疫测定方法，当用于生产单抗的病毒株与流行人群的亚型／基因型或变异株不同时，可能得不到可靠的结果。编码HBsAg的S基因发生突变可导致HBsAg的a决定簇发生改变。如核苷酸587位发生G到A的点突变，可导致原来145位的甘氨酸残基由精氨酸残基取代，即G145R突变。已报道影响HBsAg氨基酸位点120、123、124、126、129、131、133、141和144的HBV S基因突变株，最相关的突变显然是G145R、K141E和T131I以及在122与123位残基之间3个氨基酸的插入，这种突变明显影响HBsAg的抗原结构。a决定簇的氨基酸替换可导致其构型改变，这种改变可影响相应抗体的结合，从而出现HBsAg假阴性结果。目前的商品试剂盒对HBsAg突变株的测定能力可归为三类：(1)突变HBsAg和野生型均可检出。(2)不能检出突变HBsAg。(3)与野生型抗原相比，突变HBsAg的检出能力明显降低。使用酶标多克隆抗体的商品试剂，大多数可归为第一和第三类。下述不常见的HBV感染血清学标志物模式或不一致的结果可能是由于HBsAg的变异所致：(1)单独抗HBc阳性。(2)HBsAg阴性但HBeAg阳性。(3)血清HBsAg阴性但抗HBc和抗HBs阳性。(4)HBsAg(HBeAg)和抗HBs(大多为<100 IU／ml的低滴度)同时存在。(5)使用不同厂家的HBsAg试剂盒得到的结果不一致。
    HBV S基因变异所致HBsAg假阴性的最大的问题是输血安全性，尤其是逃逸突变株流行较广的地区。在使用单克隆捕获和标记抗体的HBsAg测定试剂中，突变可能会给出阴性结果，但在使用多克隆捕获抗体的方法中，则可以检出发生突变的HBsAg。在HBV高流行区域，突变株的流行率也高，因此，在这些地区应采用多抗或针对a决定簇及亚型的多个抗原表位混合单抗的HBsAg检测试剂进行血液筛查。
另一个要引起注意的问题是HBsAg突变株的存在导致疫苗免疫的失败。要在进行人群HBV分子流行病学研究的基础上，考虑研制针对主要流行HBsAg变异株的乙肝疫苗，保证免疫的有效性。
2．抗HBs：急性乙肝患者处于恢复期后，随着HBsAg的逐步消失，血清中出现抗HBs，抗HBs是一种中和抗体，其能在体内存在相当长的时间。以HBsAg作为疫苗免疫机体产生的抗HBs，对HBV的感染具有保护性免疫作用。抗HBs检测的参考范围为0～10 IU／L，低于10IU/L说明免疫失败。低浓度的抗体保护作用非常有限，我院一般以时间分辨荧光定量检测值大于100IU/L才有保护价值。ELISA检测HBs抗体是半定量，与阴性孔的OD值密切相关，而阴性对照的OD值重复性较差，因此不建议根据ELISA的值评价抗体的保护作用。接受乙肝疫苗接种者，体内血循环中除了抗HBs外，不应出现其他乙肝病毒感染血清免疫学标志物，如抗HBe、抗HBc等，一旦出现则应视为既往HBV感染。
    一般情况下，血清中抗HBs和HBsAg不同时存在，若同时检出，可能为抗HBs产生的早期，或属于不同亚型的HBV感染，或由HBV的S基因变异所致。
自然发生的逃逸变异株可使某些慢性携带者同时存在HBsAg和抗HBs，产生的抗体直接针对血循环中HB Ag抗原所没有的表位，因而不具保护作用。但HBsAg和抗HBs同时存在的最常见的原因是所产生的抗HBs针对的是亚型，而非HBsAg的a决定簇。
    WHO抗HBs标准品针对的抗原主要是adw，相对来说，对ayw和adr的结合能力降低，可使得抗HBs定量测定结果偏低。但基因型影响不大。一个可靠的抗HBs测定方法应能检测针对HBsAg的各种抗体。如只识别针对a决定簇的抗体，则很难判断疫苗免疫后的效果。
对不同抗HB 检测试剂的比较研究表明，从不同试剂得到的抗HBs浓度有很大不同。较大比例的既往感染者抗HBs滴度低于100 IU／L，在10和100 IU／L之间的浓度范围，试剂盒间的测定结果差异尤其大，试剂生产厂家使用一致的抗原或表位来制备抗HBs检测试剂盒，可改善抗HBs测定的标准化，进而改善不同试剂和不同实验室间结果的可比性。
3．HBeAg：HBeAg为HBcAg的可溶性成分，一般血清HBeAg阳性者，HBsAg亦为阳性。当HBV前核心区发生点突变时，可使得HBeAg无法表达，表现为血清HBeAg或抗HBe测定持续为阴性，但血清HBsAg或HBV DNA可表现为阳性。HBeAg与病毒Dane颗粒、HBV DNA具有伴随关系，是HBV复制活跃的血清学指标，血清HBeAg阳性说明传染性强，急性乙肝患者血清HBeAg持续阳性3个月以上，则有疾病慢性化倾向。有时临床实验室可见到HBsAg(一)、抗HBs(+)、HBeAg(+)的模式，则很有可能在病毒编码HBsAg的基因区发生了突变。
4．抗HBe：当血清HBeAg转阴后，可出现抗HBe，两者同时阳性较少见。抗HBe阳性说明病毒复制减少，传染性弱，但并非没有传染性。抗HBe不是保护性抗体，这一点与抗HBs不同。
5．总抗HBc：在HBV感染中，最早出现的特异抗体是抗HBc。总抗HBc包括抗HBc IgM、IgA、IgG和IgE等。抗HBc不是保护性抗体。抗HBc在血中呈低滴度且与抗HBs同时存在，是既往感染的标志。在HBV高流行人群中，抗HBc常作为疫苗免疫前的筛检方法。在欧洲和美国，抗HBc还是血液筛查的一个指标。在我国，抗HBc没有作为血液筛查指标，其主要原因是抗HBc检测的假阳性导致血液废弃过多。
    单项抗HBc真阳性反应性常为HBV DNA 阳性。单项抗HBc反应性常见于吸毒者、HIV感染者和HBV／HCV重叠感染者，在吸毒者中最高(>40％)，在妊娠妇女中单独抗HBc反应性的检出率为1．2％。在临床实际检测工作中，当出现单项抗HBc阳性时，首先要确认测定结果的特异性，排除假阳性。第二步如果单项抗HBc反应为真阳性，则应确定HBV感染阶段。单项抗HBc阳性一般见于HBV感染恢复期后(抗HBs消失或抗HBs浓度低)或在HBsAg清除期(携带末期)，此时HBsAg浓度处于最敏感HBsAg测定方法的测定下限之下(<0．15 g／L)。小部分单项抗HBc阳性患者推测为自限性急性HBV感染的窗口期，此时，HBsAg消失，几周后，抗HBs出现。
6．抗HBcIgM：抗HBc IgM可以说是机体感染HBV后在血液中最早出现的特异抗体，在肝炎的急性期呈高滴度，是判断急性乙型肝炎的重要指标，随着急性乙肝的恢复，抗HBc IgM滴度(以及抗HBc IgA)降低乃至消失，如持续呈高滴度，则常表明患者乙肝有慢性化倾向。研究表明在慢性活动性乙型肝炎患者血循环中，抗HBc IgM检出率及滴度亦较高，说明HBV在体内复制活跃，是传染性强的指标之一。
    抗HBc IgM的定量测定对急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎的急性发作的临床诊断有重要价值。急性乙型肝炎，抗HBc IgM值高于500 PEIU／ml。如果为亚临床感染，或标本采集时间在急性发作前或急性HBV感染中晚期，则抗HBc IgM值较低。在慢性活动性肝炎，可见有中等程度(10～500 PEIU／m1)抗HBc IgM浓度出现。在目前国内的临床抗HBc IgM测定中，使用原倍血清标本进行检测，一则容易受到标本的非特异干扰物质的干扰，出现假阳性结果。二则对急性乙肝的诊断价值很小。因此，应选用定量测定试剂或要求稀释标本的试剂盒用于急性乙肝的检测。此外，定量测定抗HBc IgM还可监测慢性HBV感染活动性。高灵敏的定性测定对不常见的乙肝标志物血清学模式，如单项抗HBc阳性和HBsAg阴性的急性乙肝等的确定也有应用价值，其可与抗HBe和敏感的定性HBV DNA核酸扩增检测一起使用，以证实不常见模式结果的正确性，提供患者潜在的HBV相关的肝病信息，尤其是HBV DNA测定阴性的患者。以10 PEIU／ml为阳性判断值，在8．5％证实为单独抗HBc反应性的患者中检出了特异的IgM抗体。抗HBc IgM作为疾病活动性的待选标志物，尚需标准化及进一步的临床评价，标准化的第一步就是诊断试剂的生产厂家使用一个共同的国际标准。
7．HBV DNA：HBV DNA检测是乙肝病毒抗病毒治疗惟一有效的疗效直接监测指标。目前国内用于HBV DNA定量测定的方法基本上为聚合酶链反应(PCR)，并以外标准作为定量依据。PCR用于HBV DNA定量检测，如是使用外部标准进行定量，再加上HBV DNA定量数值大，通常不同测定次间差异会较通常的检验项目大，一般量值变化在0．5个对数数量级内均可视为没有变化。乙肝病毒的抗病毒治疗效果的判断可以采用PCR方法动态检测患者血循环中HBV DNA，当患者经抗病毒药物治疗后，HBV DNA含量持续下降，然后维持在低水平，或低至方法能检出的含量(测定下限)以下，则说明治疗有效。观察抗病毒药物治疗效果不能凭两三次检测结果来判断，必须多次动态观察，每次检测的间隔天数不宜太短，一般为两周以上。可采用以检测次数为横坐标、HBV DNA量为纵坐标作图的方法来判断血清HBV DNA量的变化趋势，进而判断抗病毒治疗是否有效。
    血循环中HBV DNA与HBeAg和HBsAg有一定的相关，但其浓度间并不呈正线性相关。HBeAg阳性的标本，HBV DNA通常有较高的浓度(>10 拷贝／m1)，HBeAg阴性、抗HBe阳性的标本，HBV DNA浓度通常较低(<10 拷贝／m1)。当HBV基因组前C区发生突变时，则可出现HBeAg阴性而HBV DNA仍保持在较高的浓度。单独抗HBc阳性的血液HBV DNA浓度通常很低。
    关于血循环中HBV DNA浓度与患者传染性之间的关系，通常如血清(浆)HBV DNA浓度大于10^4拷贝／ml，则在日常生活密切接触中即具有较强的传染性。10 ～10^4拷贝／ml，则在日常生活密切接触中的传染性较小。小于10 拷贝／ml，则日常生活密切接触中几乎没有什么传染危险性。但不管HBV DNA的浓度为多少，哪怕是低于相应PCR方法的测定下限，也均会引起输血后的感染 。

8.HBV preS1抗原检测：1979年国外学者首次完成了乙肝病毒基因组的克隆化研究，并将基因组分成4个开放读码框架。乙肝病毒蛋白的编码区分：S区、C区、P区、x区。其中S基因编码S抗原、前S1抗原和前S2抗原。最重要的介导部位是前S1蛋白的氨基酸(AA)21—47片段，变异的病毒只要这一区段完好就有传染性。前S1抗原主要存在于血清中HBV表面,机体内含有HBV就有前s1抗原,前s1抗原与HBV-DNA密切相关，能直接反映病毒活动性复制，可以作为HBV复制的标志之一。
9.乙肝两对半的常见模式及解释：