毕业设计(论文)大豆蛋白酶解物的氨基葡萄糖糖基化修饰及其性质研究.pdf
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1、何南冬Q之孽学术硕学位论文题目 大豆蛋白酶解物的氨基葡萄糖糖基化修饰及其性质研究_ 分类号密级河南农业大学学术硕士学位论文论文题目:大豆蛋白酶解物的氨基葡萄糖糖基化修饰 及其性质研究英文题目:Tran sglutamin ase-in duced glucosamin e con jugation in soybean protein h ydrolysates an d its psoDertiesstudy:_:_ 致谢白驹过隙,转眼间,三年的研究生生涯已经接近尾声。即将离开我的母校内 心有着万分的不舍,本硕七年的时光,母校不仅传授了我知识,还教会了如何做 人处事,在此向我的母校、老师、同
2、学表示衷心的感谢。首先要感谢我的导师宋莲军教授,宋老师学识渊博、作风严谨,这些优秀品 质让我受益匪浅,让我明白了“大事起于细,难事起于易”的道理。“千里之行 始于足下”,宋老师从研究课题的确立一直到论文的撰写都倾注了大量的心血,事无巨细,让我深深感受到宋老师严谨耐心的治学态度。除了学术上,在生活上 宋老师也给予我很大的帮助,帮助我指明人生的方向。在此我再次向宋老师表达 我内心最真诚的感谢。感谢同课题组的黄现青老师、张平安老师、赵秋艳老师、李宁老师、乔明武 老师、张西亚老师对我的帮助和指导,同时感谢同课题组的师弟师妹对我的帮助。在此我再次向同课题组的老师及同窗表达我内心最真诚的感谢。感谢我的家人
3、们余新社、袁东华、余瀛瀛、蒋明珠,你们是我最坚实的依靠,也是我不断进步的动力。目录摘要.1第一章文献综述.31.1 大豆蛋白的概述.31.2 大豆蛋白的应用.31.2.1 在食品工业中的应用.41.2.2 在材料工业中的应用.41.3 蛋白质改性.41.3J物 理改性.41.3.2 化学改性.41.3.3 酶法改性.51.4 蛋白质糖基化修饰研究进展.71.4.1 美拉德反应糖基化.71.4.2 TGase途径糖基化.71.5 大豆蛋白酶法糖基化的研究.91.6 研究目的与意义.91.7 研究的主要内容.111.8 研究的创新点.11第二章大豆蛋白酶解物的氨基葡萄糖糖基化修饰样品的制备.122
4、.1 试剂与仪器.122.1.1 主要材料.122.1.2 主要仪器.122.2 实验方法.122.2.1 蛋白酶种类及水解度的选择.122.2.2 大豆蛋白酶解物的糖基化修饰产物制备.132.2.3 数据处理.132.3 结果与分析.132.4 本章小结.15第三章 样品结构表征的测定.16I3.1 试剂与仪器.163.1.1 主要材料.163.1.2 主要仪器.163.2 实验方法.163.2.1 样品中的氨基葡萄糖含量的测定.163.2.2 聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分析.173.2.3 傅里叶红外光谱(FT-IR)分析.173.2.4 样品中游离氨基酸含量测定.173.2.5
5、样品中二硫键含量的测定.183.2.6 样品表面疏水性的测定.183.2.7 数据处理.183.3 结果与分析.183.3.1 样品中氨基葡萄糖的含量.19332样品分子量的变化.20333样品结构的变化.203.3.4 样品中游离氨基酸的含量.213.3.5 样品中二硫键的含量.223.3.6 样品的表面疏水性.223.4 本章小结.23第四章样品功能特性的测定.244.1 试剂与仪器.244.1.1 主要材料.244.1.2 主要仪器.244.2 实验方法.244.2.1 样品的溶解性测定.244.2.2 样品乳化能力的测定.24423样品起泡能力的测定.254.2.4 样品持水及持油能力
6、测定.254.2.5 样品凝胶质构的测定.25II426样品体外消化能力的测定.264.2.7 数据处理.264.3 结果与分析.264.3.1 样品的溶解性.26432样品的乳化能力.274.3.3 样品的起泡能力.274.3.4 样品的持水性及持油性性.284.3.5 样品的胶凝性.294.3.6 样品的体外消化能力.304.4 本章小结.31第五章样品稳定乳液体系的研究.315.1 试剂与仪器.325.1.1主要材料.325.L2主要仪器.325.2 实验方法.325.2.1 响应面优化制备高乳化性糖基化大豆蛋白.325.2.2 不同外界环境中乳化能力的变化.325.2.3 乳液体系稳定
7、性的研究.335.2.4 数据处理.335.3 结果与分析.345.3.1 响应面优化制备高乳化性大豆蛋白.345.3.2 不同环境下样品的乳化能力.365.3.3 长期储存过程中乳液体系稳定性.385.4 本章小结.39第六章讨论.40参考文献.43Abstract.53研究生期间发表的论文.55III摘要大豆蛋白营养价值丰富,同时大豆蛋白具有的一些功能特性(如乳化性、胶凝性等)使 其在食品工业上有着广泛地应用。但大豆蛋白对加工条件(温度、pH、离子强度等)敏感,限制了功能特性的发挥,因此需要对大豆蛋白进行改性。蛋白质的糖基化修饰能够有效地提高其功能特性,其中酶法糖基化具有反应迅速、条件 温
8、和、安全性高等优点。目前关于酶解结合酶法糖基化对大豆蛋白进行改性的研究鲜有报道。本实验利用木瓜蛋白酶酶解集合转谷氨酰胺酶(TGase)的催化糖基化对大豆蛋白进行改性,从而改善其结构和功能特性,旨在寻找一种有效的大豆蛋白改性方式。在原有实验的基础上,选择利用木瓜蛋白酶限制性水解(DHW2%)结合TGase催化氨基葡萄糖糖基化修饰对大豆 蛋白进行改性。制备水解度(DH%)为0、0.5、1.0、1.5、2.0的大豆蛋白酶解物在TGase 的作用下进行糖基化修饰,得到样品Mo、Mos.Mi o.乂门和乂。通过高效液相色谱(HPLC)测定样品中氨基葡萄糖的结合量;通过聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)测
9、定样品分子量的变化;通过傅里叶红外光谱(FT-IR)来测定产物的结构 变化,同时测定产物的游离氨基酸、二硫键及表面疏水性对产物进行结构表征;同时探究酶 解以及糖基的导入对大豆蛋白功能特性(溶解性、乳化性、起泡性、持水性、持油性、胶凝 性、体外消化能力等)的影响;最后制备了高乳化性大豆蛋白并对其进行了稳定乳液体系能 力的研究。研究结果如下:(DHPLC分析表明,Mo中氨基葡萄糖的结合量为19.3 g/kg,大豆蛋白酶解物在TGase 的作用下导入更多的氨基葡萄糖,Mo.5、M1,0 Ml5和M2.0中氨基葡萄糖的结合量分别达到 21.3、22.5、23.3、23.7g/kg;SDS-PAGE 分
10、析表明 Mo 有大分子聚合物生成,M0.5、M1.0、M”和M2。随着水解度的增加分子量分布则呈下降趋势;大豆蛋白中游离氨基酸的含量为 0.49 mol/kg,Mo中游离氨基酸的含量低于大豆蛋白为0.38 mol/kg,M0.5、Mi o、M”和M2.0 中游离氨基酸含量显著增加,分别为0.92、1.37、1.72、2.21 mol/kg;与大豆蛋白性比,Mo、M0.5、M1.0、Mi s 和 M2,o 中二硫键含量显著降低(由 0.62 降低至 0.49、0.43、0.38、0.29、0.27),表面疏水性也显著降低(由14.9降低至7.2、9.9、8.7、7.5、6.5);FT-IR分析再
11、次表明氨基 葡萄糖以共价键的形式导入到大豆蛋白酶解物中。(2)随着水解程度的增加,Mo、M0.5、Ml。、M1.5和M2。的溶解性的逐渐提高,其中 Mg和M2.0的溶解度在整个pH范围内均优于大豆蛋白;Mo、M0.5、M.o、M15和M2.0的乳 化活性与大豆蛋白相比均有不同程度的提高,Mo$的乳化活性最高为7.31m2/ge Mo、M0.5、M1.o、M1.5和M2.0的乳化稳定性与大豆蛋白相比也均有显著的提高(由61%增加至86、89、92、95、96%);Mo的起泡性低于大豆蛋白(由31.2%降低至25.3%),但起泡稳定性高于大 豆蛋白(由48.6增加至62.5%)。Mo,、Mlo、M
12、1.5和M2.0的起泡性高于大豆蛋白和Mo,分 1别达到95、125、135、155%,但泡沫稳定性低于大豆蛋白和Mo,分别降低至32.6、26、20.4、18.4%;与大豆蛋白相比,Mo、Mos、Mlo、M1.5和M2.0的持水持油能力均显著提高,其中M2.0的持水达到最大为12.7g/g,M1.0的持油能力达到最大为9.3 g/g;Mo、M0.5、M1.0、M1.5和M2.0所制备凝胶的凝胶强度要高于大豆蛋白,其中Mh o所制备凝胶具有最高的凝胶 强度;Mo的体外消化性低于大豆蛋白,经过酶解后Mo.5、Ml。、Mg和M2.0的体外消化能 力要优于大豆蛋白和Mo,且随着水解度的增加呈显著上升
13、趋势。(3)响应面优化制备高乳化性大豆蛋白(Mh),最优实验条件为糖与大豆蛋白的质量 比为0.96、水解度0.64%、反应时间3.29h oMH的乳化活性为16.97m2/g,乳化稳定性为95%;蛋白质稳定乳液体系能力的研究结果表明,与大豆蛋白相比,Mh和Mo制备的乳液在不同 pH、离子浓度、温度条件下应然能够保持良好的乳化活性和乳化稳定性;经过21天的贮藏,Mh和Mo的乳析指数依然保持在69.2%和73.6%,而大豆蛋白的乳析指数仅为13.6%;同时 Mh和Mo的出油率经过21天的贮藏仅升高了 1.23倍和1.11倍,而大豆蛋白的出油率增加 了 1.78倍;在21天的存储过程中,Mh和Mo制
14、备的乳液平均粒径依然保持在65.5叩和 69.6即,而大豆蛋白制备的乳液平均粒径达到124.8阿。关键词:大豆蛋白;氨基葡萄糖;木瓜蛋白酶;转谷氨酰胺酶;糖基化2第一章文献综述1.1 大豆蛋白的概述大豆作为重要的植物蛋白和油料来源,因其产量高、富含植物蛋白和油脂等优势,从而 成为重要的食物资源卜文大豆蛋白(Soybean Protein)是大豆中含量最高的成分,作为一种 优质植物蛋白,含有人体所必需的八种氨基酸,其含量接近联合国粮农组织(FAO)和世界 卫生组织(WHO)推荐的理想构成,能够满足人类的营养需要网。同时大豆蛋白具有的功 能特性(溶解性、乳化性、起泡性、胶凝性等)使其在食品工业上也
15、有着广泛的应用。大豆蛋白不是均一组分的蛋白质,组成非常复杂。大豆蛋白的等电点在pH4.5-4.8附近,在等电点附近沉淀的部分为大豆球蛋白,约占总量的90%,其余未沉淀的部分为大豆乳清 蛋白,大豆球蛋白根据离心分离系数(沉降系数)不同可分为2S、7S、US、15S四个组分,大豆蛋白中各级组分的化学组成及含量如下表。表1大豆蛋白质的分级组分Table 1 Grading components of soybean protein4组分主要化学组分分子量范围(Da)比例(%)2S胰蛋白酶抑制剂80 0 0-2150 08细胞色素C12000血球凝集素1100007S脂肪氧化酶10200035B-淀粉
16、酶6170007s球蛋白180 0 0 0-210 0 0 011S11S球蛋白320 0 0 0-360 0 0 05215S11S聚集体6000005大豆蛋白7s组分至少包括血球凝集素、脂肪氧化酶、田淀粉酶和7s球蛋白的四种不 同种类的蛋白质,其中7s球蛋白(又称为B-伴球蛋白)为主要成分,伴球蛋白含有a、a-和。三个亚基,分子量分别为57kDa、47kDa和42kDa,这三个亚基通过疏水相互作用可以 得到六种异构体,且均为不含有二硫键的糖蛋白。大豆蛋白1】S组分即11S球蛋白是一种六聚体,分为酸性亚基A(分子量约为35 kDa)和碱性亚基B(分子约为20 kDa),这两种亚基通过二硫键连
17、接,形成稳定的AB单位,AB 单位以静电相互作用和氢键连接形成空心圆柱体旧。11S球蛋白对温度和离子浓度都比较敏 感,11S球蛋白溶液在冷却至4C时,会在低温下沉淀,该特性可用于11S球蛋白的浓缩和 分离。1.2 大豆蛋白的应用31.2.1 在食品工业中的应用将大豆蛋白应用于肉制品中,除了可以提高肉制品中蛋白质含量,其良好的乳化性也可 以防止脂肪的析出,减少蒸煮损失,同时大豆蛋白的胶凝作用也可以增加肉制品的组织结构;将大豆蛋白应用于烘焙制品中,可以提高烘焙制品的风味,同时其良好的持水性和起泡 性,可以赋予面包柔软的口感和延缓面包老化,延长货架期网;另外大豆蛋白良好乳化性、发泡性等使其在乳制品、
18、冰淇淋、汤酱类食品中也有着广泛的应用。大豆蛋白富含人体必需氨基酸,且必需氨基酸组成也十分接近人体的氨基酸组成。另 外,大豆蛋白还具有一定的生理功能,以大豆蛋白代替饮食中的动物蛋白,可显著降低血液 胆固醇浓度。大豆蛋白中的大豆US球蛋白和7S球蛋白中含有3个可抑制血管紧张肽原 酶活性的短肽片段,其具有抗高血压的潜在功能【期。1.2.2 在材料工业中的应用随着科技的进步,大豆蛋白工业与现代加工技术结合,使大豆蛋白在非食品工业具有广 泛的应用。大豆蛋白中含有多种侧链基团,如氨基、竣基、羟基和疏基,能够与多种物质发 生化学反应,改性后的大豆蛋白具有更有意的功能特性,进一步进行加工成型,应用于材料 工业
19、领域(胶黏剂、塑料、纤维等)口7叽1.3 蛋白质改性天然蛋白由于其结构和功能性质的局限性,并不能满人们对食品加工技术、营养功能、感官特性的所有要求,因此就需要对蛋白质进行改性。蛋白质的改性就是通过改变蛋白质分 子分子量、空间结构、电荷分布、表面疏水性等,来改善蛋白质的功能特性,目前常用的蛋 白质改性技术包括物理改性、化学改性、酶法改性等【。13.1 物理改性物理改性是通过适度热处理、机械处理、挤压、冷冻、超声、脉冲等物理方式对蛋白质 分子的空间结构进行修饰,一般不涉及蛋白质的一级结构口叽热处理可有效地提高大豆蛋 白的溶解性和乳化性,蒸汽处理30 s后,其溶解度达到56%,乳化活性提高约4倍【的
20、:超 高压处理(20 0-60 0 MPa)大豆分离蛋白能提高其乳化活性【;利用高频电场使大豆蛋白产 生极化效应,使其空间结构发生改变,从而提高大豆蛋白的溶解度口叽 物理改性具有安全 性高的优点,但是能耗大、成本高、改性效果有限。1.3.2化学改性化学改性是指采用化学方法在蛋白质分子中引入各种功能基团,通过改变蛋白质的结构、静电荷和疏水基团等来改善蛋白质的功能特性口叽目前,常用的蛋白质化学改性方法包括 酰化、脱酰胺、磷酸化、糖基化、共价交联、水解及氧化等RS。化学改性具有成本低、操 作简单、效果显著等优点,但存在试剂残留等安全问题。常见的几种蛋白质化学改性方式及 其修饰效果如下表。表2常见的蛋
21、白质化学改性方式【如2”Table2 Common meth ods of protein ch emical modificationI21231反应基团改性方式功能特性琥珀酰化提高溶解性、抗凝聚性乙酰化改善乳化性及起泡性,提高溶解度,降低黏度-nh2磷酸化提高溶解性、乳化性、发泡性硫醇化提高韧性、黏弹性、组织感与-NCO反应生成接枝或接枝反应,提高耐水性、机械强度、韧性、胭键耐菌性,延长降解时间与醛基发生缩醛反改善力学性能,提高耐水性、耐菌性,延长降解时应间与环氧发生反应接枝或交联反应,与-NCO效果相似按甲基化提高水溶性。增加耐菌性、乳化性和保脂性-OH与-NCO反应生成接枝或交联反应,
22、提高耐水性、机械强度、韧性、氨酯键耐菌性,延长降解时间与环氧发生反应接枝或交联反应,与-NCO效果相似-s-s-磺酸化提高溶解性,增加抗凝聚性,增加黏稠度、乳化性-SH和保脂性1.3.3的法改性蛋白质酶法改性是通过蛋白酶对蛋白质进行水解、交联或共价接枝,主要包括蛋白质肽 链的断裂、分子内或分子间交联或对侧链基团进行修饰,进而影响蛋白质的功能特性Bl,与物理改性的效果不明显以及化学改性存在的安全问题相比,酶法改性反应步骤简单、条件 温和、专一性强、反应程度易控制、副反应少等优点。13.3.1蛋白质酶解改性蛋白酶酶解改性是指蛋白质在蛋白酶的作用下使肽键断裂,生成小分子的多肽及氨基酸 分子的过程【2
23、5。蛋白酶解的作用效果主要有以下三方面:分子量下降:离子基团的数 量增多;深埋在蛋白结构内部的疏水性基团的暴露【2叽随着分子量的减少、蛋白质折叠 5结构的打开以及疏水基团的暴露会对蛋白质的水合性质(溶解性、分散性)和界面性质(乳 化性、起泡性)产生重要的影响。几种常见蛋白酶的作用位点及改性效果如下表。表3常见蛋白酶的作用位点及改性效果Table3 Action sites an d modification effects of common proteases蛋白酶种类作用位点改性效果中性蛋白酶内切酶、酶切位点为Tyr、Tiy、Ph e等芳香族疏水性氨基酸酶解后提高了蛋白质的溶解性和乳化性,
24、并 获得具有抗氧化能力的多肽mi/碱性蛋白酶作用位点广泛,能水解所有 具有芳香族或疏水性氨基酸 的肽链能够提高蛋白质在等点附近的溶解度,同时 提高其抗氧化能力,但乳化能力和起泡能力 则显著下降【29J风味蛋白酶可水解肽链末端显苦味的疏 水性氨基酸提高蛋白质的乳化性及持油性,有助于肉制 品在加工过程中风味的形成四31J胰蛋白酶酶切位点为Lys、Arg的竣基提高蛋白质的溶解性、乳化性及起泡性,但 乳化稳定性及起泡稳定性有所下降因】木瓜蛋白酶酶切位点为Lys、Arg、Ph e 的股基显著提高溶解度、疏水性、乳化能力及疏水 能力,常用作嫩化剂号刃133.2蛋白质酶联改性TGase能够催化蛋白质分子中的
25、谷氨酰胺残基与赖氨酸残基中的氨基发生反应四】,如 图1所示的反应Ao同时赖氨酸残基可以被伯胺类物质取代,如上图所示的反应B,在TGase 的作用下,两种反应竞争发生【3叽图1 TGase催化作用反应机制Fig.1 TGase catalytic reaction mech an ism目前TGase在食品动植物蛋白的加工中有着广泛的应用。谷玩粉、养麦蛋白、大豆蛋 白、花生分离蛋白等经TGase促交联改性后,其凝胶性、乳化性等都得到显著的提高脓3刀;将TGase应用于肉制品中,催化蛋白质之间交联,形成致密的三维网状结构,增强肉制品6的胶凝性和持水性,提高产品得率囱)。牛乳中的酪蛋白经TGase处
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