离子液体介质双酶串联L肉碱及其酰化物制备技术研究.pdf

摘要L-肉鞋和酰基-L-肉碱广泛应用食品、功能食品、化妆品及药品等领域.巴豆甜菜 碱在肉减脱水酶催化下合成L-肉做是国内生物催化法生产L-肉碱所采用的方法.但该 方法存左前体转化率低和产物分离纯化过程中底物巴迂甜菜碱不能i可收利用的问题.国 内酰基-L-肉臧种类较少,其脂肪酶催化合成中乙腾作为反应介质产品得率较低、梅活损 失严重,针对以上问题.本论文提出以离子液体为介质的双懒串联催化工艺.建立一 T巴豆甜菜碱水合反应体系中的肉碱脱水酯和L-肉碱酯化体系中的酰基-L-肉 碱的检测方怯.采用紫外法测定的以巴豆甜荚碱消耗让衣示的肉碱脱水醐活力经拟合方 程校正国与DTNB法测定的以L-肉被生成量代示的肉碱脱水酶活力两纽数据之间无显 着差异.拟合方程为：）二7286-545/l+x-8746）/2318.x为紫外法测定的L-肉碱脱水 的酶活力,】，为DTNB法测定的L-肉械脱水酿酶活力,该方法检测限为1 87 U.采用比 色法测定河基-L-肉H,两相显色体系的酰基-L-肉碱含量也20-130岬。1范圉内同显色反 应吸光度成名性关系（R2 0991加标回收率为99 53-103.33%.相时标准偏差低于 4.30%,检测限为1.S5 u mo l.4方法不受L：肉碱的干扰.对肉碱脱水能催化巴亚甜斐碱合成L-肉碱的反应条件进行了优化.适宜的反应条件 为：温度404CpH7 0.巴甜菜碱浓度20%,能添加量2 0g/100ml（湖币：）富勺酸 游加俄02%，反应时间5-8 k Mg”降低肉碱脱水植活力.Zn2+K Cu t Li Ba*、Fe）均能提高酶活力,乂中以Fe*对醐活力的提高最为叨显.对脂肪酶催化的L-臧酰化反应条件进行了优化异戊酰-L-肉碱辛酸-L-肉碱和 棕榴酰-L-肉曰的BmimPF6离注液体中的酶催化酯合成,体系痴肉碱含鼠均为0.4 mmo l.BmimRFs均为 2 0ml,均以 No v o zyme 43510000 PLU/g）作为催化剂.初始 水分活度均为0 22,反应温度依次为60,60和65 c.脂肪酸和L-肉碱摩尔比为4:1、5:1和5:1,脂肪醐用量为50、40和40 mg,转速为150、200和200 5mm.反应时5 为60.48和48h以上条件下三种解施-L-肉碱的产品得率分别达到59.61%.90 79%刖 98.03%.异龙酰-L-肉碱合成反应的活化能 163 OS KJ/mo l）高】石酰-L-肉臧0 99)bet ween OD v a lu e a nd a c yl-L-c a mit ine c o nt ent wh i c h ra nge wa s 20-130 u mo l in t h e biph a s ic s ys t em To a na lyze t h e s ys t em o f L-a rm t ine es t erif ic a t io n,t h e rec o v ery wa s 99.53-103 33%,t h e RSD wa s belo w 4 30%,a nd t h e det ec t io n limit wa s 1 85.mo l Th e met h o d wa s no t dis t u rbed by L-c a mit ineTh e c o ndit io ns f o r t h e bio c o nv ers io n o f L-c a mit ine f ro m c ro t o no bet a ine were o pt imized Th e o pt ima l rea c t io n c o ndit io ns were 40 o f rea c t io n t empera t u re,pH7 0,2.0%c ro t o no bet a ine,2 0 g/100ml c a rnit ine deh ydra t a s e(wet weigh t).0 2%f u ma ra t e.5-8 h o f rea c t io n t ime Th e meda l io n in elu ding Zn-+.K+.Cu*,Li+.Ba2+a nd Fe-+c o u ld inc rea s e t lie a c t iv it y o f c a rnit ine deh ydra t a s e,a nd a ll o f t lies e.Fe-wa s t h e m0s t ef f ec t iv e t o impro v e t lie enzyma t ic a c t iv it y Mg-+c o u ld dec rea s e t h e enzyma t ic a c t iv it yTh e c o ndit io ns o f h pa s e-c a t a lyzed a c yl-L-c a nnt ine s ynt h es is in io nic liqu id were o pt imized Th e o pt ima l rea c t io n c o ndit io ns were:f o r 1 s o v a leryl-L-c a nu t me.0 4 mmo l L-c a mit me,2 0 nil BmimJPFg.50 nig No v o zyme 435(10 000 PLU/g).0 22 a w.200 nig mo lec u la r s i ev es,-4 1 mo la r ra t io o f f a t t y a c id a nd L-c a rm t ine,60.150 r/min a nd 60 h.f o r o c t a no yl-L-c a mit me a nd pa lmit o yl-L-c a mit ine,0 4 mmo l L-c a rmt ine,2 0 ml BminiPF6.40 mg No v o zyme 435.0 22 a w.250 mg mo lec u la r s i ev es,5 1 mo la r ra t io o f f a t t y a c id a nd L-c a mit ine,60 (o c t a no yl-L-c a mit ine)a nd 65 (pa lmit o yl-L-c a rnit ine),200 r/min,48 h Th eir o v era ll yields c o u ld rea c h 59 14%,90.79%a nd 98.03%,res pec t iv ely Th e a c t iv a t energy o f is o v a leryl-L-c a rmt iiie(16?08 KJ/mo l)wa s h igh er t h a n t lia t o f o c t a no yl-L-c a rmt(130 74 KJ/mo l)a nd pa lmit o yl-L-c a mit ine(127 16 KJ/mo l)Th e h igh er yield a nd o pera t ic s t a bilit y were o bt a ined in BmimJPFg t h a n in a c et o mt nle Th e o pt ima l c o ndit io ns f o r a c yl-L-c a mit ine s ynt h es is by t ra ns es t enf ic a t io n were f o r is o v a leryl-L-c a mit ine.0-4 mmo l L-c a mit me,2 0 ml Bnu mPF6.40 mg No v o zyme 435.0 22 a w.6 1 mo la r ra t io o f Allylis o v a lera t e a nd L-c a rmt ine,60.120 r/niin a nd 48 h,f o r o c t a no yl-L-c a rm t ine a nd pa lmit o yl-L-c a rnit ine.0 4 in mo l L-c a rnit ine.2 0 ml BmimPFe.30 mg No v o zyme 435.0 22 a w.3 1 mo la r ra t io o f f a t t y a c id v inyl es t er a nd L-c a mit ine,60.150 r/min,32 h Th eir o v era ll yields c o u ld rea c h 73 61%.96 76%a nd 98 82%,res pec t iv elyTh e ro u t e*s ynt h es is o f L-c a mit ine a nd it s a c yla t e c a t a lyzed in s enes by t wo enzymes wa s es t a blis h ed Us ing BmimPF6 io nic liqu id a s t h e rea c t io n mediu m,L-c a mit ine wa s bio s ynt h es ized t h ro u gh t h e h ydra t io n o f c ro t o no bet a ine u nder t lie a c t io n o f c a rnit ine deh ydra t a s e.wh ic h wa s t ra ns f o rmed int o pa lmit o yl-L-c a rnit ine by lipa s e Pa lmit o yl-L-c a rnit ine wa s ext ra c t ed wit li 2-m e t li y 1-2-bu t a n o Wit h t lie remo v a l o f L-c a rm t ine,t h e bio t ra ns f o mi a t io n o f c ro t o no bet a ine int o L-c a rnit ine wa s c o nt inu ed m t h e rev ers ible h ydra t io n rea c t io n.Th e mo la r yield o f t o t a l L-c a rm t ine c o u ld a t t a in 87 2%a f t er t lie f iv e t imes int ermit t ent ext ra c t io n Va c u u m-ro t a iy ev a po ra t o r wa s a s u it a ble rea c t o r t o rea lize t lie s t ra t egy Th ro u gh t h e ro u t e,t lie c o nv ers io n wa s impro v ed,t h e key t ec h no lo gy o f L-c a rm t ine s epa ra t io n a nd ext ra c t io n wa s s o lv ed,a nd a c yl-L-c a mit ine wa s s ynt h es ized m t lie mea nt imeTh e key t ec h no lo gy o f a c yl-L-c a nu t ine s epa ra t io n a nd ext ra c t io n wa s s t u died Ac et o ne c o u ld prec ipit a t e t h e t h ree a c yl-L-c a rnit ine f ro m BmimJPFf iio nic liqu id,wit h 6-7 1 v o lu me nt io o f a c et o ne a nd BmmiJPFf i.a nd t h eir prec ipit a t io n ra t es c o u ld rea c h 90%Th e c ent nf u ga t io n a f t er ref ngera t io n c o u ld lea d t o t h e c o mplet e prec ipit a t io n a nd de c rea s e t h e t ime o f prec ipit a t io n Wa t er c o u ld ext ra c t i s o v a l ery 1-L-c a mit ine a nd o c t a no yl-L-c a rm t ine f ro m BmimPF6 Th eir pa rt it io n ra t io bet ween wa t er a nd t h e io nic liqu id were 1 35 a nd 1 16,res pec t iv ely Pa lmit o yl-L-c a mit ine c o u ld be ext ra c t ed f ro m t h e io nic liqu id by 2-Met h yl-2-bu t a no.a nd pa it it io n ra t io bet ween 2-Met h y 1-bu t a no a nd t lie io nic liqu id wa s 5 31 Th e ext ra c t io n t ime wa s 15-30 min Th e dec rea s e o f t empera t u re wa s f a v o u ra ble t o t h e ext ra c t io n Emu ls if ic a t io n ea s ily o c c u rred du ring t h e ext ra c t io n,wh ic h c o u ld be era dic a t ed by c ent nf u ga t io n a t 1000 r/min f o r 10 minKey words:L-c a rmt ine.a c yl-L-c a rmt ine.io nic.liqu id,BnnmPF6.c a rnit ine deh ydra t a s e,lipa s e目录摘要.IABSTRACT.HI第一章 结论.11.1 L-肉碱和酰祛-L-肉碱的化学结构及性质.11.2 L-肉碱和酰板L-肉僦的生理功能及应用 11 2.1 L-肉碱和酰居-L-肉麻的营养、保健功能及应用 11 2JL-肉碱及酰居工-肉碱的临床应用 31.3匚肉碱和帆.世-L-肉碱的制备,41 3 1提取法制备L-肉碱 41 31亿.1或法制备L-肉碱口刻 5d,.禽L-肉碱 51 3 4ML-肉械 9135不同L-肉碱制备方法的比较 101 3 6酰族-L-肉碱的化学催化合成田，52川 111 3.7酰处-L-肉做的酶的七；“111.4 L-肉玳川酰长-L-肉底的椅佗j法.11142 色港/I；妙:.121 4 3庖l/广，妙小.131.5:常规介质的催化技术发展及我力L-肉碱和酰感-L-肉碱制备1二的应用 13】5.1有机相能伸化反应体系 14152反咬束前催化反腐体系 141 53超临界流体的催化反应体系 141 54高子液体萌催化反应体系 141 5.5无济剂陋催化反应体系 1516我国L-肉碱酰壮-L-肉碱制备中存在的问题及研究内容1 6 1仃/l-的问虺162研究内容参与支械.16第二章肉碱脱水的和 带-L-肉碱检测方法的建立.262.1 引.262.2 材和叮k.262 2 1匕要:材料。试剂 262 2 2上耍仪器备 272 2 3肉碱脱水酶活力的测定.272 24酰基-L-肉碱的测定.282 25统计分析.2923结果5论 29231肉做脱水柝活叫W.；.的让，292 3 2酰菸-L-肉碱测定法的建 5?2.4 1-39参号忆献 39明三章肉碱脱水酶催化合成L-肉碱反应条仪的优化.413.1 切一 413.2 HM,J J；.-.413 2 1厂夏材料。试剂.413 2 2匕要仪牌。改费.413 2 3肉械脱农检的制备】.413 24依L-肉碳含基的测定 413 2 5梅催化合成L-肉碱的反感 423 26肉啾脱小帕活的测定 423.3结果与讨论.423 一3 1反应温度对底物转化率的能响 42332体系pH内反物彳的；433 33 底找i J L3 的；44334电干接受体对底物轧化:的，二工3 35h;切氏物彳一5日影响3 3 6反应时间对底物转化率的影响3 3 7.1-：.：i IIJ；：响.473.4本章.小弟.47参文献.47第四章脂肪防催化合成酰法工-肉碱反应条件的优化.494.1 引；.494.2 M 到.，504 2 1上要材料1小剂 5c4 22 上要仪器叮“备 504 2 3反而利始水分活1产 504 24酯介成制备酰W-L-肉碱.504 2.5能转化制和酰基-L-肉碱 504 2 6脂肪酰-L-肉碱的HPLC分析 504 2 7离子液体中脂肪称No v o zyme 435的回收 504 2s统计分析 504.3结见讨论 514 3 1酯C戊制的吼力-L-肉碱 514 3二酯也化制外吼也-L-肉碱 594.4本段小结.60参与支献.61第八章L-肉域及比献化物制备的双肺串联优化艺.645.1 lii 645.2 M 料 I L、；645 2 1 F要材刊式剂 645 2 2上要仪罂1设小 655 2 3双酶串联催化反而山骤 655 24 L-肉域的测定85 S 655 2 5水分舍信的测定 655 2 6统计分析.5.3结果与讨论531 3%串联反而步”的确上5 3双曲申联催化反应中革取利的迷打 685 SV遭：圾的串联L2的，“；3工 685.4本改小结 69参文献.70第六章 酰甚-L-肉碱分离提取技术的研究.716.1 引言.716.2材料与方法.716 21 1要材料与试剂.7162.2主要仪器与设备.716 2 3L-肉做酰化反向体系 72624有机溶剂沉淀法分离酰基-L-肉碱 726 2.5溶剂革取法分离酰基工-肉碱.726 26酰甚-L-肉碱的测定.726 27脂肪酸和脂肪酸烯能含肚的测定 726.3结果与讨论.726 3 1份机溶剂沉淀法从离子液体中分离提取吼他工-肉碱 726 3 2溶剂萃取法从离子液体中分离提取帆基-L-肉碱 756.4木瓜小弟.77参与支械.77主要结论与展望.79论文创新点.81致谢.83第一章绪论1.1 L-肉碱和酰基-L-肉械的化学结构及性质L-肉碱乂 WL-肉甫碱.维生素Bt临床常称为左卡尼汀,化学名称为L-羟基-y-三甲胺T酸一 L-肉做相对分子量为16120,白色粉末,焙点196-212 V.比旋光度 a g=-23 9易溶水（溶解度为250gM00ml）、热乙憎、甲梢,微溶尸冷乙酌,不 溶于己烷、内酮、乙酸、溶和笨等.稳定性较好”在pH 3-6溶液中放置 耳以卜而 不变肺能耐200 C以上高温而保持稳定 它的化学组合键和极性官临团使之具仃较好 的水溶性和吸湿（水）性口 口TCHrCH-CH-COO-图1-1 L-向楹的化学结构 Fig 1-1 Mo lec iila r s t ru c t u re o f L-c a rnit ine酰基-L-肉碱的性质如水溶性、旋光性、烙点等租酰租链的长的.有无双键及双键双 多少有关.如乙酰美-肉碱溶于水,而棕于水-L-肉碱在水中几乎不溶（住热水中的溶解 度为2一5g/100ml）.饱和的酰甚-L-肉碱通常为门色粉末状,多不饱和酰基-L-肉泡和黄色、淡黄色的固体、半黄体或粘性油状.酰基工-内碱易溶于氯仿,热黄酹、甲醉.不黄于己 烷、乙陋.不和内阳等口一汽色 OC-RH3cN-CH7CH-CH-COO-CH3 图1-2战米-L-内城的化学结佝 Fig 1-2 Mo lec u la r s t ru c t u re 0f a c yl-L-c a rnit ine1.2 L-肉碱和酰区-L-肉碱的生理功能及应用L-肉M和酰-L-肉碱的I;变功能是作为载体将氏链脂肪酸从线粒体朕外输送到膜 内进行p-氧化，为细胞提供能出此外，L-肉碱及酰基L肉碱还和供体及过此外基的 消除、糖酵解.消异生、脂肪生成.支链氨基酸代谢以及维持膜的稳定等有关口刀,因 此L-肉碱用酰苴工-肉喊口有广泛的生理活性,一 H缺乏将导致许多疾弱.1.2.1 L-肉碱和酰忌-L-肉碱的营养.保健功能及应用1.2.1.1 婴儿的营养婴儿出生后必须快速适应新的代谢能缸爆料的改变.即从胎儿期的以葡萄糖、0 酸代谢产生能量为上转化至以脂肪产能为主,（此过程中L-肉碱起着主要作用固Sc h imment i等（2007年）报道婴儿体内L-肉臧缺乏可使我代谢紊乱、甚至猝死叨.由 于婴儿自身合成L-肉刈能力较羽,因此婴儿食品应强化L-肉碱.此外,婴儿肌肉及母乳 初乳的L-肉碱含处与孕妇妊娠的周数旻正相关故应对单产儿补充L-肉碱.Wa c h t er等 C002年）报道,母乳喂养的早产儿激外补充L-肉碱30 mg/Kg体重,有助于增加体重和 促进正冢平衡皿-1.2.1.2 孕妇的营养Lo h nmger等（2005年）报道,妇女妊娠12周,其血液L-肉碱水平显著低于未怀 孕女性,以后继续下降直到分娩L-肉碱缺乏后使孕妇体内游离脂肪酸含量增加进而引 起妊娠期糖尿朝、妊娠期间补充足量的L-肉做，可以完全避免这一情况口上另外,Sc h imment i等（2007年）研究表明,母亲体内L-肉收缺乏易导致婴儿血浆中L-内碱水 平降低,给降产妇女补充适量L-肉碱不但有利于北身体的怏速恢爱,同时还促进婴儿发 心.1.2.1.3 中老年营养线粒体细胞能地的降低是人体衰者的生要原因之.（维持线粒体功能及能吊二产T 过程中,L-肉牛发挥着重要作用.但人体内L-肉碱浓度随年老而F降.Ju liu s（2006年）报道,给老年人朴充适量L-肉镰,可以维持较高的能量的水平避而筵缓衰老皿.藁老 的人一个原因是体内各个系统发生氧化反应.Sa v it h a等X05年）、Co lu c c i”（2005年）和Va ndh i等（2000年）报道.L-肉碱、乙惟-L-肉碱和丙酰-L.肉做可以清除体内自由居.增强抗氧化剂的活性、降低细胞的过氧化损伤,从而防止细胞老化时1习.L-肉碱土影响 行造竹细胞的功能，Co lu c c i等（2005年）报道,老年人补充L-肉碱,尤其是补充L-肉碱 酰化物异戊源-L-肉战,能显著增加域骨细胞的活性,减少老年性骨质疏松口K另外,人体把老后井抵御疾病的能力F降,充足的L-肉碱可提高免役系统功能、避免疾病的侵 袭.1.2.1.4 运动员营养高强度的身体训练后,人体肌肉组织中的游离L-肉碱浓度F降20%左右，此时若补 充适量L-肉碱可抑制俶蝴糖分解、节约糖原消耗,提高肌糖原浓度、防止血液乳酸堆机 王京钟等（1999年）报道犀用L-肉碱可完善脂肪以及碳水化合物的代谢途径从化使物 体能量增加、提局运动成绩阿.L一肉碱注可促进血液循环、使蛋白质更小于吸收,辅助 肌肉组织损伤的复麻.Kra emer等（2005年报遒,每天在运动员的饮食中扑充L-肉等.能够有效避免肌肉损伤、加快体能恢复并延氏共运动寿命口Q12.1.5减肥食品L-肉碱能减少体内脂肪积累并使剩余利肪转化为能为,充足的他我又减少了人喋1 食物的欲空：同时L-肉也能够维持血耦的稳定,避免人体对过多糖分补充的福耍.1 锈等（2007年）给单纯性肥胖志愿者补充L-肉明 伏验前后受试者体重、腰惘、愣I 体脂总量等与对照组相比存在显著先异呵.朱晓萍也证明,一定范围内小鼠体内的 L-肉碱含量愈而,小砧减肥和抗疲劳的效果愈强口刃1.2.2 L-向诚及酰基-L-肉碱的临床应用1.2.2.1 件衰竭、血液透析及腹膜透析慢性忏功能衰竭时,仔脏合成L-肉碱明显减少，易引起心血管疾病、脂质代谢异常、肌肉痉挛.低血压等系列和透析相关的急慢性并发症,及时补充L-肉臧能缓解以上症 状叫 芮海荣等 2005年）088例衣期肾衰透析肉碱缺乏症患寸,每次肌迹结束后静 脉推注L-肉碱lg,疗程3个小患苕的血浆游肉L-肉碱浓度、食欲、精神状态.透析中 的低血压.拄挛,透析后的虚弱无力等疥状得到行效改薛,总仃效率为90%口】，s a v ic a 等（20Q5年）对48例维持性血液透析件补充L-肉碱，6个月后患者的曲清。反应蛋白水平 明显降低,衣叨L-肉碱可抑制透析患拧的炎祐反而回 此外，Ko s a n（2003年）等t，L-肉碱足可降低腹膜透析病人的阿朴脂蛋白B水平网.1.2.2.2 心血管系统Mo ns h ima U000年）报道.人体心肌细胞内的脂肪酸。辜化通过二段酸后环向细 胞提供能限.可改善缺血心肌组织的功能活动、提岛心肌耐缺氧能力、预防和减轻心肌 损伤,以印-乳化为1有L-肉碱的参叮口 Pa u ly等（1003年）研究衣明.及时补充L-肉碱 可明显降低缺血性心脏病患者的心功能斑竭和死亡的发生奉庐1.C曲等（2003）报道,L-肉碱及其衍生物能够改善缺血后L肺功能,减少再灌注诱导的心室纤幽的儿率、心肌 梗死后的梗塞而枳以及大鼠的离体心脏!缺血/内滩注叨间的体内细胞凋亡罔.La ng。等 2005年）对经力冠状动咏搭桥术的融尿加患者注射L-肉做或内湫-肉碱,能够缩小横跨 心脏内皮素的差异,降低再濯注期间的次黄嚓呛流失及改善患者的新陈代谢和脉泞系统 功能并且丙酰工-肉碱的效果好寸L-肉碱口71.陈扬波等（“o s年）研究认为L-肉碱可稳 定心绞痛,对佐治不稳定型心线捕安全有效.此外.L-肉碱及其衍生物不为临床用药 a心律失常、心脏册膜置换术等心血管系统疾病的应用二也有着广泛的研究.1.2.2.3 男科临床治疗Lenzi等（2003年）报道L-肉碱肉与精子的运动和成熟过程、协助精f能量代谢卬1.是药物治疗与性不育症的重要突破之Li等（2007年）研究表明,游离L-肉碱浓度 I常男子和不育男子中的含量显蓍不同,补充上内模可提高精子的弧 发!界刻.Ba lerc ia等（20051）试验证实.L-肉碱联合乙酰工-肉碱可明显改善特发性期精f症患 苕的粕子活力并提高粘液轨自由旅的清除能力口Ca v a llini 2004年）发现L-肉状对 老年男性勃起功能障碍具有定的疗效画.此外,乙酰-L-肉碱和丙酰-L-肉球还应用于 Peyro m，病的治疗.1.2.2.4 癌症临床应用Gra imgna no等（2006年）对12个年龄在4273岁之间的日症早期患者扑克L-肉W 3患者的疲劳周期明显缩短.营养状况有效改善,体重增加,过乳化损伤,谷胱廿肽过氧 化商活性也有所降低田L葱环类抗生1多天比星星治疔恶性肿物如淋巴瘤、白血病和实 性揄等的最行效合物.但由尸该药威胁许多瘟症患者的心脏功能限制了它的临床应用.Wa ldner售（2006年）对20个癌症患者在化疗前通过输液和口服补充L-肉碱.发现L-肉 做可阻11多柔比星诱导的心脏矗性.并刺激白细胞的活化代谢函.1.2.2.5 蟾尿痂、高血脂症的治疗Ira t a m等（2003年）报道L-肉碱可使犍尿病肾病患者的H油三酯水平显著下降.对 胆固醇水平也有降低作用即.Ra s s o u l等（2005年）以鹿楣诱导的岛II.油三能症的Wis t a r 大鼠为试验模型证实了L-肉碱对高甘油三酯和游离脂肪酸有降低作用,并证议?1人的岛 血脂症的治疗中使用L-肉碱声.此外,L-内碱酰化物棕慨限工-肉做作为蛋臼激酶C（PKO 抑制剂可以预防糖尿病及其并发症的发生卬1.2.2.6 的血疝的治疗佝长林等2001年）通过研究L-肉版和琮帆酹工-肉碱对体外培养大鼠件帼单个核细 胞红系克隆生成的影响发现,L-肉碱在较弱的浓度F能促进红系生乩 而粽梅酰-L-肉成 在较低浓度下对纤系生长即有促进作用卬卸.Ts a gns（2005）检测了患有。-海洋性贫 血症（h o mo zygo u s bet a t h a la s s emia）的45个孩千和20个成年人发现以卜人群血清中的 肉做及酷根L-肉峨含量低J正常水平.并断言补充L-肉碱和酰曜-L-肉碱或许能改善或 消除相关症状网.1.2.2.7 其他方面L-肉碱和酰战-L-肉做还对惊枫口工pa t统合症口/胃粘膜伍薪阳】、溃琢性眄炎阴】、肝硬化百弗里德莱西氏共济失调症眄、孤独症等病症叼有一定的治疗效果,有的已 经用于临床.1.3L-肉碱和酰基-L-肉板的制备制备制肉做的方法行提取法、化学合成法和生物催化法,生物催化法又包括醇法和 微生物发精法.L-肉碱通过化学催化或由法催化发生酰化反应即合成酰基-L-肉碱.13.1 提取法制备L-肉做提取法足从动物的肉或乳中提取L-肉提，典型的提取方法是Ca t er等4 1952年报 道的从牛肉中提取L-肉碱,提取纯化的步骤比较复杂,主要技术关键是肉浸汁中f ill碱组 分的分离口.朱晓萍（2004年）比较了高氟酸.盐酸和水对羊肉中L-肉碱的提取效果.发现高氯酸提取含量较高、R次是盐酸,而水牧军口刃.由芬仲食物中L-肉碱的绝对 含量偏低,并且通常存心L-肉碱结构类似物胆碱.因而直接提取法步骤比较复杂.得盅 较低,成本较高.13.2 化学合成法制各L-肉碱0 5013.2.1 直撰拆分法直接拆分法是从DL-肉蹑或其中间体出发.用樟脑酸、N-d酰-D-谷氨酸或或妖酰L(+)泗石酸等拆分剂进行化学拆分.如拆分外消鹿的肉碱胺、2,3-氯丙醉、头丁烯 酸、3。-胫他-一甲胺、环乳氯丙烷及 乙烯酮等.这种技术路线的优点是燃料成本 较低，缺点是拆分的理论收率至多是50%、实际的合成收率很低、拆分剂茴点,其分离 回收也I分麻烦.1.3.2.2 从子性化合物出发制备L-肉碱主要是利用L-抗坏血酸、L-阿拉伯糖.D-H属糖、D-革果酸、P魏海、4-基-L-肺旗酸，L(+)酒石酸、D-半乳糖酸14-内酯、(S)3-羟茶内醋为原料经多步反 应制度L-肉碱.以上反应中须用到汛化钾等有毒物质.或护用到三氟乙敏甘、级化锂铝 等昂贸的试剂.原料妾源受限,反应条件苛刻.1.3.2.3 不对你合成法主要是以氯已酰乙酸已酯、烯丙基滨等北手性物质为起始原料.经化学催化或生物 邮化“创造出”所需要的手性中心.这种技术路线的缺点是催化剂成本岛.并且用催 化“创造”产件中心时.实际I二不能得到纯的对应异构体.由F所得到的产物对应异构 体过量值 3,%)多变,对两种物化性质相同的对应异构体的分离非常困电13.3储法制 备L-肉僦1.33.1施法折分制备L肉破闷521 DL-内板拆分某些微I物可对映选抒性降解DL-肉碱混合物中的D-肉峙来获得L-肉碱.19S5年.Ch a rles等人选育出专 降解D-肉碱的乙酸f月不动仔菌(Ac inetob act er c alcoa ceticus)ATCC39647菌株.该曲株在含育20g/LDL-肉戚的培养层中经25 V.44h好找培落 D-肉俄全部消失,L-肉碱利卜38%,1986年,威斯模辛校友研究法令会(Wis c o ns in Alu mm P.es ea rc h Fo u nda t io n)发何 项利用曾氏不动杆菌(Alwoffi)好生菌株和突变株从 DL-肉碱制备L-肉碱及北盐的早利.DL-肉碱酰除拆分1989年.Kyo wa Ha kko的专利介绍假单胞肝的 CA28-50A从 DL-肉碱酰胺牛:产L-肉碱.苗体细胞愚洱在含有10%DL-肉缄酰胺盐酸盐的瞬酸缓冲液 中,16 C反应72h,L-肉碱的得率约78%,经阳离子交换色谱柱的纯率为98%1994-1996 年,Ku la等用新的肉曲酰桐酶EC3.5 173对映选挣性水解L-肉臧酰胺.在具行伏 酰胺酶活性的65个菌株中,DSM6320的L-肉碱性胺酶活性最高.该酶受L-肉碱酰I 和肉碱诱导.型厂脂甜菜减和脱氧肉菜的诱导性较小,产梅最佳条件为pH7 5.30 海促反应受L-肉碱和D-肉底映胺的比争性抑制.在分批式转化反应中.以浓度为1000 mH的DL-肉碱吼胺为底物,可获得完全转化的L-肉碱，肉碱的光学纯收可达到99%.DL-肉碱酰息幅拆分19S6年.Ara go zzim”筛选获得了 26个菌株(僧叭 细菌和戒的，选择性求解DL-事酰基肉碱.在试验的菌株中,尖胞镰相谢(Fusarium oyysponim s p)。加IMAM的 水解活性最高,在含有0.5%Dl-辛酰甚肉峥的培养居中培养的h.可获得540mgL-肉 碱盐酸盐，纯化后得率40%.1987,Ch o u Ka s u ih in等用属于木状杆苗属 Corymebactenum).芽抱杆菌属(Bacillus)和假单胞针菌属(Pseudomonas)的微T.物出化肉做炕酯I产L-肉1或.炭光假单胞什的(Pseudomonas fluorescent)IFO30 S1 在濯加肉碱乙酯的复杂培养其中拆荡培养48h,收获的菌体细胞在含有10g/L肉碱乙酯 的崎酸缓冲液中抬泞18 h.可产生1 3g/L的L-肉碱。DL-酰基肉做拆分1984年,Dro ps y等发现电鳗乙酰胆碱幅醉(Ac et ylc h o lines t era s e)能选择性水解D-乙酰肉碱,从而发展了用乙酰胆碱酯酶生产L-肉碱的方法.他们用1800单位的乙而发 桐酯粥作用于40mLi mo l/L的DL-乙酰肉碱,经水解得1 7 gL-肉碳1992年,To yo Jo zo 利用产碱曲(Alcalgenes sp.)FEPJ.IBP-2570产乍的酰英肉碱酯随水解设,yL-肉碱形成 脆肪酸和L-肉碱。2003|,T大兵等利用蜗牛陋(Sna il Enzyme)选择性水解乙酰 肉碱,得到光学纯度为98%的乙酹-L-肉碱,乙暇-L-肉碱收率为96%DL-肉碱牌拆分19S9年,Ha kko提出了用棒状IT薄属 Coi-ymebactenum s p)产生的敏水钟前(EC-3.5.5D水解DL-肉版脂生产L-肉臧的工艺.据专利称.此工艺便宜，可在室温 和中性pH条件F进行.L-肉碱的收率接近78%.13.3.2幽法转化制备L-肉磕.由y-丁乐甜菜碱制备L-肉碱由广丁拙对我碱制备L-肉碱起催化作用的的是巴，甜菜碱脱笈施 添方法是最只实 现工业化的L-肉碱梅转化法制备方法，单在上世纪80年代,瑞上Lo nza公司(世界上最 大、最早的肉敝生产J家)以介于农肝菌属(Agjvbactgnum)和根揄菌属 Rhizobiutn)之间的微小物HK4(DSM2938)的突变体HK1349为的种,采用补料分批匚之进行L-肉 糠的工业化生产.速苗株性能优畀.我用刖胞循环连续生产系统,L-肉碱的 世60g/L,生产率54gLh,粘化依95%以I.求用补料分批1.2 1 f h v-由i&心儿广.转化为L-肉碱转化率为99 5%，但是HK1349的产豳培养基组成复杂.故原料成本较 高,且转化反应时间较长(70h以上)因而人们试图选育出或它更优良的菌种.Na(2001)采用无色杆赭 Achromobacter cycloclast)转化62 h.L-肉僦产垃达 15 g/L.化率为45%叩,此生产性能远不如HK1349./下游技术厅面,据Meyer等(2005)6孙志浩等（2005）的报道,y-丁基甜菜臧转化反应结束后,反应体系再经过以下处理即 可得到L-肉地产品:微滤和超滤