外源化学物致突变作用公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件.pptx

毒理学基础毒理学基础第八章第八章 外源化学物致突变作用外源化学物致突变作用第1页第1页第一节第一节 概概 述述 第2页第2页一、基本概念一、基本概念 变异(variation)-因为遗传物质在自我复制过程 中偶而失误,或因为个体发育与生存受到改变内外环境条件影响,一个物种在个体或历代间性状出现不同程度差异.第3页第3页2.2.突突变变（mutation）因遗传结构本身改变及其引起变异（可遗传变异)。突变可分为突变可分为：1）自发突变自发突变（spontaneous mutation）2）诱发突变诱发突变（induced mutation）第4页第4页 3.遗遗传传毒毒理理学学（genetic toxicology）主要研究环境中致突变物(包括化学、物理、生物原因)致突变作用以及人类接触致突变物后也许引起健康效应.主要任务:研究环境中致突变物致突变作用以及其机制,应用检测系统发觉和探究致突变物,提出评价致突变物健康危害办法.第5页第5页1 1）致致突突变变作作用用（mutagenesis）指外来原因(化学,物理,生物原因)引起细胞核中遗传物质发生改变能力，并且这种改变可随同细胞分裂过程而传递。2)致致突突变变物物（mutagen）能够引起突变物质.(遗传毒物,诱变物)第6页第6页二、遗传学基础二、遗传学基础1.DNA与基因结构；2.染色质与染色体；3.体细胞与生殖细胞；4.基因型与表型；5.细胞周期与细胞分裂。第7页第7页第二节第二节 化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型 第8页第8页化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型 基因突变基因突变基因突变基因突变 碱基置换、移码突变碱基置换、移码突变突变突变突变突变 染色体畸变染色体畸变染色体畸变染色体畸变 (结构异常结构异常-染色单体畸变染色单体畸变 染色体畸变染色体畸变)染色体组畸变染色体组畸变染色体组畸变染色体组畸变 (数目异常数目异常-非整倍体、非整倍体、多倍体多倍体)第9页第9页一一.基因突变：基因突变：指基因中DNA序列改变（点突变)。1.碱碱基基置置换换（base substitution）是指DNA序列上某一碱基配对性能改变或脱落所致突变。1)转换转换（transition）2)颠换颠换（transversion）同义突变同义突变 错义突变错义突变 无义突变无义突变第10页第10页2.2.移码突变移码突变（frameshift mutation）指发生一对或几对（3或3倍数除外)碱基减少或增长，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误密码，并转译成为不正常氨基酸。3.3.整码突变整码突变 4.4.片段突变片段突变第11页第11页二二.染色体畸变染色体畸变(染色体结构异常染色体结构异常)：断裂剂(clastogen)断裂作用(clastogenesis)拟紫外线断裂剂：染色单体型畸变，S期依赖断裂剂 拟放射线性断裂剂：染色体型畸变，S期不依赖断裂剂 第12页第12页三三.染色体数目异常染色体数目异常(染色体组畸变染色体组畸变):):1.非非 整整 倍倍 体体 细 胞 增 长 或 减 少 一 条 或 几 条染色体。(2n-1,2n+1,2n+2)2.多倍体多倍体 细胞染色体数目成倍增长。(三倍体,四倍体等)第13页第13页第三节第三节 化学毒物致突变作用化学毒物致突变作用机制及后果机制及后果第14页第14页 一、机制一、机制（一）引起（一）引起（一）引起（一）引起DNADNADNADNA突变突变突变突变 1.碱基损伤 1）碱基错配 2）碱基类似物取代 3）碱基结构改变或破坏 4）平面大分子嵌入DNA链 第15页第15页2。DNA链受损1）二聚体形成2）DNA加合物形成3）DNA-蛋白质交联物形成第16页第16页(二二)引起突变细胞分裂过程改变引起突变细胞分裂过程改变(染染 色体组畸变机制色体组畸变机制)非整倍体非整倍体:不分离、染色体行动滞后、不分离、染色体行动滞后、联联 会、着丝粒早熟分离会、着丝粒早熟分离 多倍体多倍体:核内复制、核内复制、细胞质分裂障碍细胞质分裂障碍 第17页第17页(三三)其它改变其它改变第18页第18页 突变后果主要取决于化学物作用突变后果主要取决于化学物作用靶细胞靶细胞。生殖细胞突变生殖细胞突变 致死性突变 非致死性突变体细胞突变体细胞突变 肿瘤、致畸作用、衰老、动脉粥样硬化 二、突变后果二、突变后果第19页第19页基因库基因库基因库基因库(gene pool)(gene pool)指某一物种在特定期期中指某一物种在特定期期中能将遗传信息传至下一代处于生育年龄群体能将遗传信息传至下一代处于生育年龄群体所含有基因总和。（即指一个物种群体中在所含有基因总和。（即指一个物种群体中在生殖细胞内含有、并能传给下一代所有基因生殖细胞内含有、并能传给下一代所有基因总和。总和。遗传负荷遗传负荷遗传负荷遗传负荷(genetic load):(genetic load):指一个物种群体中每一指一个物种群体中每一个携带可遗传给下一代有害基因平均水平个携带可遗传给下一代有害基因平均水平.第20页第20页第四节第四节 机体对致突变作用影响机体对致突变作用影响第21页第21页 对外来原因致突变作用,机体本身含有一定防御功效。（1）DNA执行高保真度复制；（2）机体本身修复功效。第22页第22页1 1、DNA损伤修复功效损伤修复功效 1 1）光修复光修复 2 2）“适应性适应性”反应反应 3 3）切除修复切除修复 4 4）复制后修复复制后修复 5 5）呼救性修复呼救性修复(SOS(SOS修复修复)2 2、遗传原因对致突变作用影响、遗传原因对致突变作用影响 1 1）代谢酶遗传多态性）代谢酶遗传多态性 2 2）修复功效个体差别）修复功效个体差别第23页第23页第五节第五节 致突变试验办法致突变试验办法第24页第24页一、致突变试验办法选择原则一、致突变试验办法选择原则一、致突变试验办法选择原则一、致突变试验办法选择原则（一）观测效应终点类型（一）观测效应终点类型（一）观测效应终点类型（一）观测效应终点类型遗传学终点遗传学终点遗传学终点遗传学终点:有许多致突变试验所观测到现象并不能反有许多致突变试验所观测到现象并不能反 映基因突变和染色体畸变或染色体不分离，而仅仅映基因突变和染色体畸变或染色体不分离，而仅仅 反应致突变过程中发生其它事件。将试验观测到反应致突变过程中发生其它事件。将试验观测到 现象所反应事件称为现象所反应事件称为遗传学终点遗传学终点遗传学终点遗传学终点.第25页第25页 1983年国际环境致突变物致癌物防护委(ICPEMC）将致突变试验所反应遗传学终点分为5类:（1）DNA完整性改变；（2）DNA重排或互换；（3）DNA碱基序列改变；（4）染色体完整性改变；（5）染色体分离改变。第26页第26页遗传学终点包括：（归纳）基因突变 染色体畸变 原发性DNA损伤 非整倍体第27页第27页 由于一个致突变试验办法只能反应一个或两个遗传学终点，实际工作中，没有一个致突变试验办法能涵盖所有遗传学终点，为了避免出现假阴性，故需要用一组试验进行配套检测。第28页第28页（二）配套试验标准：1.遗传学终点齐全；2.应包含各种进化程度不同物种；3.体内、体外试验相结合；4.应包含生殖细胞和体细胞突变试验方法。第29页第29页二、致突变试验中一些问题二、致突变试验中一些问题 1.阴性和阳性对照设置 2.体外试验活化系统 S9 3.致突变试验与致癌试验关系第30页第30页 4.试验结果在毒理学安全性评价中作用。质量控制 a）阴性对照组和阳性对照组设置b）盲法观测；c）资料处理；d）试验结果重现性。阴性结果鉴定条件 阳性结果鉴定条件 第31页第31页三、惯用致突变试验三、惯用致突变试验办法办法第32页第32页（一）（一）鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验 （Ames test）1.1.原理原理原理原理 正向突变正向突变 野生型野生型 突变型突变型 回复突变回复突变 野生型鼠伤寒沙门氏菌能自行合成组氨酸（野生型鼠伤寒沙门氏菌能自行合成组氨酸（his+his+），在），在组氨酸缺乏培养基中能生长；而突变型鼠伤寒沙门氏菌自组氨酸缺乏培养基中能生长；而突变型鼠伤寒沙门氏菌自身不能合成组氨酸（身不能合成组氨酸（his-his-），在组氨酸缺乏培养基中不能），在组氨酸缺乏培养基中不能生长。假如细菌在受试物作用下能在组氨酸缺乏培养基生长。假如细菌在受试物作用下能在组氨酸缺乏培养基中生长，则阐明受试物使之发生了回变，表明该受试物有突中生长，则阐明受试物使之发生了回变，表明该受试物有突变作用。变作用。第33页第33页2.2.试验菌株试验菌株试验菌株试验菌株 鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株：鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株：TA97TA97、TA98TA98 ：移码突变；移码突变；TA100TA100：碱基置换；碱基置换；TA102TA102：移码突变移码突变+碱基置换碱基置换 组氨酸缺点（组氨酸缺点（his-his-）细菌屏障脂多糖缺点（细菌屏障脂多糖缺点（rfarfa 深粗型突变）深粗型突变）结晶紫抑菌试验结晶紫抑菌试验 切除修复系统缺损（切除修复系统缺损（uvrB uvrB 突变）突变）紫外线敏感试验紫外线敏感试验 R R因子（因子（pKM101pKM101、pAQ1pAQ1质粒）质粒）抗氨苄青霉素试验、抗四环素试验抗氨苄青霉素试验、抗四环素试验第34页第34页测试菌株（测试菌株（TATA系列系列)特性特性特性TA97TA97TA97TA97TA98TA98TA98TA98TA100TA100TA100TA100TA102TA102TA102TA102移码突变移码突变移码突变移码突变+碱基置换碱基置换碱基置换碱基置换+hishishishis+rfarfarfarfa+R R R R因子因子因子因子+抗四环素抗四环素抗四环素抗四环素-+uvrBuvrBuvrBuvrB+-自发回变菌落数自发回变菌落数自发回变菌落数自发回变菌落数(-S9)(-S9)(-S9)(-S9)90-10090-10090-10090-10030-5030-5030-5030-50120-200120-200120-200120-200240-320240-320240-320240-320第35页第35页 剂量设计:*最高剂量确实定主要取决于受试物对试验菌株毒性和受试物溶解度.*普通最低剂量为0.2g/皿,最高剂量为5mg/皿.*至少5个剂量,每剂量间隔不超出5倍.*每剂量3皿.对照组设计:*阴性对照:溶剂对照（H2O,DMSO)未处理对照*阳性对照第36页第36页推荐原则诱变剂办法S-9S-9TA97TA97TA98TA98TA100TA100TA102TA102点试点试-敌克松敌克松敌克松敌克松叠氮钠叠氮钠敌克松敌克松+2-2-氨基芴氨基芴2-2-氨基芴氨基芴2-2-氨基芴氨基芴掺入掺入-敌克松敌克松敌克松敌克松叠氮钠叠氮钠敌克松敌克松+2-2-氨基芴氨基芴2-2-氨基芴氨基芴2-2-氨基芴氨基芴第37页第37页3.试验办法试验办法 平板掺入法 点试验法 预培养法第38页第38页4.结果评价原则阳性结果判断原则:平板掺入法:受试组回变菌落数阴性对照组回变菌落数2倍,并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复并有统计学意义阳性反应.点试法:如受试物点样纸片周围长出较多密集回变菌落,与阴性对照组相比有明显区别.第39页第39页结果汇报(平板掺入法)阳性结果至少重复试验共3次,阴性结果至少重复试验共2次,才干作出判断.本办法不适合用于杀菌和/或抑菌作用受试物,不适合用于含有阻碍哺乳动物细胞复制系统受试物.第40页第40页（二）二）微核试验微核试验（micronucleus test)第41页第41页（三）（三）小鼠精子畸变试验小鼠精子畸变试验（四）（四）染色体畸变分析染色体畸变分析（细胞遗传学试验）（五）五）单细胞凝胶单细胞凝胶(SCGE)(SCGE)试验试验 慧星试验（comet assay)第42页第42页(六六)小鼠淋巴瘤细胞小鼠淋巴瘤细胞L5178YTK+/-L5178YTK+/-基因正相突变试验基因正相突变试验第43页第43页原理:在5-三氟胸苷(TFT)参与下，通过评价细胞集落生长率来鉴定受试物诱导L5178YTK+/-小鼠淋巴瘤细胞系正相突变能力。TK座位位于常染色体上,其基因产物为胸腺嘧啶脱氧核苷(胸苷)激酶（TK）.其作用是通过磷酸化将基质中外源性胸苷用于DNA合成.假如一个胸苷类似物（如TFT）存在于基质中,也可经TK路径磷酸化掺入DNA中,最后造成细胞死亡。第44页第44页 本试验使用TK座位杂合子(TK+/-)细胞，它单步正相突变就会形成TK+/-表型，失去TK活性，取得TFT抗性，即能像杂合子同样利用从头合成路径在普通培养基中生长，又能在TFT选择性培养基中存活，此时存活即为自发或致突变TK+-集落第45页第45页.测试用细胞 小鼠淋巴瘤细胞L5178细胞系，源于小鼠白血病细胞，为TK座位杂合子细胞（TK+/-).操作办法（略）.结果判断（毒理学试验办法与技术p66）第46页第46页思考题思考题1 1突变定义？化学毒物致突变类型有哪几种？突变定义？化学毒物致突变类型有哪几种？突变定义？化学毒物致突变类型有哪几种？突变定义？化学毒物致突变类型有哪几种？2 2突变后果有哪些？致突变与致癌、致畸关系？突变后果有哪些？致突变与致癌、致畸关系？突变后果有哪些？致突变与致癌、致畸关系？突变后果有哪些？致突变与致癌、致畸关系？3 3致突变试验时为何需要一组配套试验？选择一组试验时致突变试验时为何需要一组配套试验？选择一组试验时致突变试验时为何需要一组配套试验？选择一组试验时致突变试验时为何需要一组配套试验？选择一组试验时应注意哪些事项？应注意哪些事项？应注意哪些事项？应注意哪些事项？4.4.体外试验为何要加活化系统？惯用活化系统是什么？体外试验为何要加活化系统？惯用活化系统是什么？体外试验为何要加活化系统？惯用活化系统是什么？体外试验为何要加活化系统？惯用活化系统是什么？6.Ames6.Ames试验、微核试验、染色体畸变试验原理和目的是试验、微核试验、染色体畸变试验原理和目的是试验、微核试验、染色体畸变试验原理和目的是试验、微核试验、染色体畸变试验原理和目的是什么？什么？什么？什么？第47页第47页