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Hereditas(Beijing)2024 年 4 月,46(4):306318 收稿日期:20231205;修回日期:20240130;网络发布日期:20240131 作者简介:韩伟，硕士研究生，专业方向：公共卫生。E-mail: 通讯作者:杨静，博士，副研究员，研究方向：前沿核酸技术。E-mail: 周喆，博士，研究员，研究方向：分子生物学研究。E-mail: DOI:10.16288/j.yczz.23-253 研究报告适用于降解样本的 201 个遗传标记检测体系的构建和验证 韩伟，张庆珍，杨静，周喆 军事科学院军事医学研究院生物信息中心，北京 100850 摘要:近年来，法医实践中复杂案件数量逐渐增多，需要联合使用短串联重复序列(short tandem repeat,STR)、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)、插入缺失多态性(insertion/deletion polymorphism,InDel)、微单倍型(microhaplotype,MH)等不同类型的遗传标记，为案件提供更多的参考信息。本研究筛选了 24 个常染色体 STR(autosomes STR,A-STR)、24 个 Y 染色体 STR(Y-STR)、110 个 A-SNP、24 个 Y-SNP、9 个 A-InDel、1 个 Y-InDel、8 个 MH 和 Amelogenin 共 201 个遗传标记，建立二代测序检测体系 HID_AM Panel v1.0。根据DNA 分析方法科学工作组(Scientific Working Group on DNA Analysis Methods，SWGDAM)的验证指南，对该体系的重复性、准确性、灵敏度、对降解样本的适用性、物种特异性、抗抑制性等指标进行评估。本体系分型结果与基于毛细管电泳方法检测的 48 个 STR 和 Amelogenin 结果完全一致，与 ForenSeq DNA Signature Prep Kit 重合的 79 个 SNP 分型结果完全一致；当 DNA 加入量不低于 200 pg 时可获得全部等位基因分型结果；当检测降解指数大于 15.87 的模拟降解样本时，检出成功率明显高于 GlobalFilerTM PCR 扩增试剂盒；当体系内血红素浓度不高于 40 mol/L、靛蓝浓度不高于 2 mmol/L、或腐殖酸浓度不高于 15 ng/L 时，扩增无明显抑制；鸭、鼠、牛、兔、鸡的 DNA 特异性扩增较少；常规样本中 STR 检出率达 99.74%，SNP、InDel、MH 全部检出。综上所述，本研究建立的检测体系具有较高的准确性、灵敏度、物种特异性和抗抑制性，适用于降解样本的个体识别。关键词:二代测序；多类型；遗传标记；降解样本 A DNA typing panel of 201 genetic markers for degraded samples:development and validation Wei Han,Qingzhen Zhang,Jing Yang,Zhe Zhou Bioinformatics Center of Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China Abstract:With the increasing number of complex forensic cases in recent years,its more important to combine the different types of genetic markers such as short tandem repeats(STRs),single nucleotide polymorphisms(SNPs),insertion/deletion polymorphisms(InDels),and microhaplotypes(MHs)to provide more genetic information.In this study,第 4 期 韩伟等:适用于降解样本的 201 个遗传标记检测体系的构建和验证 307 we selected totally 201 genetic markers,including 24 autosomes STRs(A-STRs),24 Y chromosome STRs(Y-STRs),110 A-SNPs,24 Y-SNPs,9 A-InDels,1 Y-InDel,8 MHs,and Amelogenin to establish the HID_AM Panel v1.0,a Next-Generation Sequencing(NGS)detection system.According to the validation guidelines of the Scientific Working Group on DNA Analysis Methods(SWGDAM),the repeatability,accuracy,sensitivity,suitability for degraded samples,species specificity,and inhibitor resistance of this system were assessed.The typing results on 48 STRs and Amelogenin of this system were completely consistent with those obtained using capillary electrophoresis.This system accurately detected 79 SNPs as parallelly confirmed by a FGx sequencer with the ForenSeq DNA Signature Prep Kit.Complete allele typing results could be obtained with a DNA input of no less than 200 pg.The detection success rate of this system was significantly higher than that of the GlobalFiler kit when the degradation index of mock degraded sample was greater than 15.87.When the concentration of hematin in the amplification system was 40 mol/L,indigo blue was 2 mmol/L,or humic acid was 15 ng/L,amplification was not significantly inhibited.The system barely amplified the DNA extract from duck,mouse,cow,rabbit,and chick.The detection rate of STRs on routine samples of this panel is 99.74%,while all the SNPs,InDels,and MHs were successfully detected.In summary,we setup a NGS individual typing panel including 201 genetic markers with the high accuracy,sensitivity,species specificity,and inhibitors resistance,which is applicable for individual identification of degraded samples.Keywords:next generation sequencing;multiple types;genetic markers;degraded samples DNA 是个体身份识别的“金标准”。个体身份识别是通过联合使用一定数量的遗传标记，基于统计学理论，实现高概率认定。最常用的遗传标记是短串联重复序列(short tandem repeat,STR)，其多态性高，单个遗传标记鉴定效力强13。通常，1320个常染色体 STR(autosomes STR,A-STR)可用于个体识别，19 个 STR 可用于亲子鉴定，39 个 STR 可满足全同胞关系鉴定需求4。但在法医学实践应用中，STR 也存在一些缺点：一是受到传统毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)检测方法的限制，基于 CE 的 STR 自动分型技术是通过区分片段长度和荧光种类对遗传标记进行检测，能够复合检测的STR 基因座数量有限，降低了系统效能；二是 STR扩增片段较长，在降解检材中不易检出，削弱了鉴定效力；三是突变率较高，约为 103105，增加了亲缘分析的难度5。近年来，一些新型遗传标记如单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)、插入缺失多态性(insertion/deletion polymorphism,InDel)、微单倍型(microhaplotype,MH)在法医遗传学分析中发挥重要作用。SNP 和 InDel 广泛分布于人类基因组中，数量庞大，具有较高的遗传稳定性，且分型简单、长度较短，在降解检材中的作用尤为突出610，MH是指 300 bp 范围内 25 个 SNP 的组合11，没有重复序列，不产生滑脱峰，兼具 STR和 SNP的优势12,13。当 A-STR 鉴定效力不足时，可以通过联合 SNP、InDel 和 MH 等其他类型的遗传标记提高个体识别率，也可以联合 Y 染色体 STR(Y-STR)、线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)等获取父系或母系的单倍型信息14,15。比起传统的 CE 方法，二代测序(next generation sequencing,NGS)技术检测通量高，为多类型遗传标记分析提供了可能1618。目前市面上存在多种适用于二代测序体系的 DNA 商品化检测试剂盒，如ForenSeq DNA Signature Prep Kit(美国 Verogen 公司)，可以同时检测 27 个 A-STR、24 个 Y-STR、7 个X-STR、94 个个体识别 SNP(individual identification SNP,IISNP)和 Amelogenin 等基因座；the Precision ID GlobalFiler NGS STR Panel v2(美国 Thermo Fisher Scientific 公司)，可同时检测 31 个 A-STR、Amelogenin 和 3 个 Y 染色体遗传标记；MGIEasy Signature Identification Library Prep Kit(深圳华大智造科技股份有限公司)，包括 127 个 STR、145 个 IISNP 等1926。多个团队对上述试剂盒的法医学效能进行了评估，常规样本均能得到较完整的分型，但降解样本由于组织细胞核酸高降解、低拷贝，基 308 Hereditas(Beijing)2024 第 46 卷 因座检出成功率低。例如，Fattorini 等27用 ForenSeq试剂盒检测 70水浴 6、8、10 h 的模拟降解样本，分别有44.8%，18.9%，5.1%的STR和58.7%，34.7%，10.9%的 SNP 能够获得正确分型。本实验室前期研究发现，采用 ForenSeq 试剂盒，检测降解指数(degradation index,DI=72.28)的样本时，STR 分型成功率为 77.97%；分析降解程度更高(DI=232.247)的样本时，STR 成功率为 66.1%。随着 DI 的增大，大片段基因座测序深度降低，小片段基因座出现优势扩增28。Sharma 等29也得出类似的结论。随着多重靶向扩增技术的成熟，各个实验室也可根据自身需求，自主开发遗传标记检测体系30。本研究在结合现有 DNA 数据库包含的基因座以及文献报道的基础上，筛选扩增片段小、鉴定效力高的 24 个 A-STR、24 个 Y-STR、110 个 A-SNP、24个 Y-SNP、9 个 A-InDel、1 个 Y-InDel、8 个 MH 和Amelogenin 共 201 个遗传标记；基于二代测序平台，自主构建多重复合扩增试剂盒 HID_AM Panel v1.0，实现多重遗传标记的联合检测；根据 DNA 分析方法科 学 工 作 组(Scientific Working Group on DNA Analysis Methods，SWGDAM)的验证指南31，对体系的重复性、准确性、灵敏度、对模拟降解样本的适用性、抗抑制性、种属特异性等性能指标进行评估，并验证该体系在常规样本中的检测能力。1 材料与方法 1.1 样本准备 9948 标准品 DNA(宁波海尔施基因科技有限公司)采用 QuantifilerTM Trio DNA Quantification Kit(美国 Thermo Fisher Scientific 公司)进行 DNA 定量后，稀释至 1 ng/L 备用。1.2 DNA 提取和定量 根据知情同意原则，采集 60 例中国北方汉族无关男性个体、7 例中国北方无关女性个体的新鲜抗凝静脉血，11 例中国北方汉族无关男性个体血卡(苏州新海生物科技股份有限公司)。静脉血采用QIAamp DNA Investigator Kit(德国 Qiagen 公司)提取 DNA，采用 QuantifilerTM Trio DNA Quantification Kit 进行 DNA 定量后，稀释至 1 ng/L 备用。本研究已通过军事科学院军事医学研究院伦理委员会批准(No.AF/SC-08/02.44)。1.3 基因座筛选 收集公安部 DNA 数据库包含的核心基因座，以及文献报道的常用 STR、SNP、InDel 和 MH，除了有 1 对遗传标记(rs214955-rs2308139)的物理距离为80.6 kb，其余遗传标记之间的物理距离均大于100 kb32。在本研究中，为便于计算，假设所有遗传标记处于连锁平衡状态。1.4 引物设计及多重复合扩增体系构建 基于 Illumina 测序平台，使用 MFEprimer 3.0软件设计多重复合扩增引物，控制所有扩增片段在300 bp 以内，构建扩增体系。1.5 文库制备和二代测序 文库制备主要分为两轮 PCR 扩增。第一步 PCR扩增总体系为30 L，包括3.5 L Enhancer buffer NB(1 N)，2.5 L Enhancer buffer M，5 L Primer pool，10 L EM808 polymerase mixture，9 L DNA，推荐DNA 模板为 5 ng。运行的 PCR 程序为：95 3 min 30 s；20 个循环：98 20 s，60 4 min；72 5 min。磁珠纯化产物后，进行第二轮接头序列 PCR 反应，反应体系为 30 L，包括 13.5 L 纯化后的第一步 PCR反应产物，2.5 L Enhancer buffer M，2 L 水，1 L I5 Index(10 mol/L)，1 L I7 Index(10 mol/L)和 10 L EM808 polymerase mixture。PCR 反应条件为：95 3 min 30 s；9 个循环：98 20 s，58 1 min，72 30 s；72 5 min。扩增结束后，进行第二轮磁珠纯化。完成建库后，使用安捷伦 2100 生物分析仪(美国Agilent 公司)进行质控。采用 NEBNext Illumina Library Quant Kit 试剂盒及 Applied Biosystems 7500实时荧光定量 PCR 仪(美国 Thermo Fisher Scientific公司)对 DNA 文库进行定量。根据定量结果进行文库均一化混合，采用 MiSeq V3(600 cycles)试剂及MiSeq FGx 测序仪进行高通量测序。1.6 毛细管电泳 采用 GlobalFilerTM PCR Amplification Kit(美国Thermo Fisher Scientific 公 司)扩 增 A-STR 和 第 4 期 韩伟等:适用于降解样本的 201 个遗传标记检测体系的构建和验证 309 Amelogenin 基因座，采用 SureID PathFinder Plus(宁波海尔施基因科技股份有限公司)扩增 Y-STR 基因座，PCR 产物采用 3730XL DNA 分析仪(美国Thermo Fisher Scientific公 司)进 行 电 泳，GeneMapper ID-X v1.6 进行数据分析，根据公安部发布的公共安全行业标准 GA/T 1163-2014人类DNA 荧光标记 STR 分型结果的分析及应用，荧光强度大于 100 RFU 视为有效检出。1.7 二代测序扩增体系技术指标验证 1.7.1 重复性 将 9948 标准品重复 3 次进行建库测序，比较 3次分型结果是否一致。1.7.2 准确性 将 9948 标准品的测序结果，与毛细管电泳方法和基于二代测序的 ForenSeq DNA Signature Prep Kit试剂盒的分型结果进行比较，判断分型结果的准确性。1.7.3 灵敏度 根据定量结果，将 9948 标准品原液分别稀释至不同浓度梯度，取 10 ng、5 ng、1 ng、200 pg、100 pg、50 pg，按照本文方法平行 3 次建库测序，统计不同 DNA 模板量的基因座深度、等位基因均衡性和分型成功率。1.7.4 模拟降解样本检测 采用 Covaris M220 超声打断仪打断 DNA 9948标准品，制备人工模拟降解样本。打断条件设置如下：目标片段长度：300 bp；最高入射功率：50 W；工作系数：20%；超声波作用于样品过程中超声波能量传递的数目：200；持续时间：80 s；温度：20；样本容积：50 L。9948 标准品分成 11 等份，分别标记为 D1、D2、D3 至 D11，打断次数依次为 1 次、2 次、3 次至 11次，用 QuantifilerTM Trio DNA Quantification Kit 对样本进行定量，检测大片段 DNA(214 bp)、小片段DNA(80 bp)、Y 染色体片段的 DNA 浓度和降解指数 DI。DI 为小片段和大片段 DNA 的浓度比，降解指数越大代表降解程度越高33。分别采用本试剂盒和 GlobalFiler 试剂盒进行检测，比较两种试剂盒性能。1.7.5 抗抑制性 取 5 ng DNA，加入血红素(生工生物工程(上海)股份有限公司)，使其终浓度为 5、10、20、40、80 mol/L；加入靛蓝(生工生物工程(上海)股份有限公司)，使其终浓度为 2、4、6 mmol/L；加入腐殖酸(生工生物工程(上海)股份有限公司)，使其终浓度为1、5、10、15、50 ng/L。按照本文方法进行建库测序，统计不同抑制剂条件下的分型成功率。1.7.6 种属特异性 对 鸭(Anatinae)、鼠(Mus musculus)、牛(Bos taurus)、兔(Oryctolagus cuniculus)、鸡(Gallus gallus)(实验室现存的物种鉴定样本)按照本方法进行建库测序，统计分型结果。1.7.7 常规样本检测 对 67 例血液样本和 11 例血卡样本进行测序，统计各基因座的分型情况。1.8 统计分析 采用 CLC Genomics Workbench 23.0 软件(德国Qiagen 公司)对二代测序数据进行 SNP、InDel、MH分析，根据公共安全行业标准 GA/T 1693-2020法庭科学 DNA 二代测序检测规范，将“Identify Known Mutations from mappings”参数 Minimum coverage 设置为 100 reads，Detection frequency 为软件默认值 20%。采用 STRait Razor v3 和 STRait Razor online 软 件34对 STR 进 行 分 析，Read Depth Threshold 设置为 100 reads，Heterozygote Balance Threshold 为软件默认值 0.4。使用 GraphPad Prism 9.5 软件对数据进行可视化呈现和统计学分析。等位基因均衡性(allele balance,AB)为测序深度较低等位基因与测序深度较高等位基因深度的比值，理想情况下，杂合子的 AB 应该接近于 1。2 结果与分析 2.1 HID_AM Panel v1.0 基因座筛选及测序质量分析 在兼顾公安部 DNA 数据库核心基因座及文献 310 Hereditas(Beijing)2024 第 46 卷 报道的基础上，本研究共筛选得到 201 个遗传标记，包含 48 个 STR、134 个 SNP、10 个 InDel、8 个 MH和 Amelogenin(基因座信息见附表 1)。其中 17 个A-STR 和 18 个 Y-STR 为公安部发布的公共安全行业标准 GA/T 41009-2021 定义的核心基因座，如图1A 所示遗传标记广泛分布在所有染色体上。进行多重引物设计后，201 个遗传标记中有 168个片段长度在 250 bp 以下，32 个片段长度在250260 bp 之间，超过 260 bp 的仅 1 个(图 1B)。加入测序接头(135 bp)后，文库质控结果如图 1C 所示，文库片段集中分布在 252435 bp 之间。在样本测序数据量达到 500 M 时，A-STR、Y-STR、SNP、InDel、MH 的平均测序深度均在 6000以上，所有基因座的等位基因均衡性 AB0.5，99%基因座的 AB0.6(图 1D)。2.2 HID_AM Panel v1.0 重复性及准确性分析 将 9948 标准品重复 3 次进行建库测序，3 次实验均检出 201 个基因座，分型结果完全一致，体系重复性良好。将本体系与基于 CE 方法(A-STR:GlobalFiler 试剂盒，Y-STR:SureID 试剂盒)的分型结果和基于 NGS 的商品化试剂盒(ForenSeq 试剂盒)的分型结果相比(图 2)，重叠的 48 个 STR、1 个 Amel和 79 个 SNP 基因座分型结果完全一致。图 1 遗传标记在染色体上的位置分布、扩增片段长度及等位基因均衡性 Fig.1 Location distribution on chromosomes,amplicon length and allele balance of genetic markers A：基因座在染色体上的位置分布；B：遗传标记的扩增片段长度分布；C：文库质控结果；D：各基因座的等位基因均衡性 第 4 期 韩伟等:适用于降解样本的 201 个遗传标记检测体系的构建和验证 311 图 2 HID_AM Panel v1.0 与毛细管电泳和 Forenseq试剂盒基因座重叠情况 Fig.2 Overlap of HID_AM Panel v1.0 loci with capillary electrophoresis and Forenseq kit 2.3 HID_AM Panel v1.0 灵敏度分析 将 9948 标准品原液分别稀释至不同梯度，取10 ng、5 ng、1 ng、200 pg、100 pg、50 pg DNA 起始量，平行 3 次进行文库构建。使用 7500 实时荧光定量 PCR 仪进行文库浓度检测，各文库的平均浓度依次为 6.6、5.2、1.0、0.21、0.087、0.047 nmol/L。不同 DNA 起始量的基因座深度和检测成功率分别见图 3A 和 B。当 DNA 起始量不低于 200 pg 时，STR的平均深度大于 3000，SNP、InDel 的平均深度大于 5000，微单倍型的平均深度大于 3500，分型成功率为 100%。当 DNA 起始量降至 100 pg 时，出现等位基因丢失。当 DNA 起始量为 50 pg 时，共出现 8 个 STR丢失和 22 个 SNP 丢失，但全部基因座的分型成功率仍大于 95%。各组等位基因均衡性如图 3C 所示，平均值依次为 92.11%、90.26%、85.35%、72.29%、66.45%和 49.10%。结果表明，在一定范围内，基因座等位基因均衡性与 DNA 起始量成正相关，随着DNA 起始量的降低，等位基因均衡性降低。在本体系中，当 DNA 起始量为 200 pg 时，仍有 70%基因座的 AB0.6，等位基因均衡性良好。2.4 HID_AM Panel v1.0 对模拟降解样本的适用性分析 11 组模拟降解样本定量结果见表 1，各基因座AB 分布如图 4A 所示。结果表明，随着降解指数的增大，DNA 浓度不断降低，等位基因均衡性不断降低，基因座分型成功率呈下降趋势。当样本 DI 为82.78 时，STR、SNP 及 InDel、MH 的分型成功率分别为 91.04%、98.22%、100%。当 DI 为 401.02 时，总体分型成功率仍可达 92.12%。将本试剂盒与基于CE 方法的 GlobalFiler 试剂盒对比(图 4B)，结果表明，当 DI10.45 时，两种方法的分型成功率无明显差异；当 DI15.87 时，本试剂盒的成功率明显高于 GlobalFiler 试剂盒(P0.05)。2.5 HID_AM Panel v1.0 抗抑制性分析 分别采用血红素、靛蓝、腐殖酸验证本体系的抗抑制性，结果如表 2、图 5 所示，当体系内血红素浓度从 5 mol/L 增加至 40 mol/L 时，文库浓度先升后降，STR 检出率降至 81.25%，InDel 和 MH均能正确检出。在血红素浓度为 20 mol/L 时，rs3032356 的深度小于 100，但分型结果正确。当血红素浓度为 80 mol/L 时，质控结果显示无产物生成，扩增明显抑制。当靛蓝浓度达到 2 mmol/L 时，文库浓度明显下降，6 个 STR、13 个 SNP、3 个 InDel、1 个 MH 基因座分型错误，STR 平均深度从 2625降至 1467；当靛蓝浓度增加至 4 mmol/L 时，检出等位基因最大深度为 6，远低于 100的阈值，扩增明显抑制。当扩增体系的腐殖酸浓度增加至 15 ng/L 时，可成功分型 43 个 STR、132 个 SNP、11 个 InDel 和8个 MH基因座，分型错误的 STR中出现 D18S51(15,15)，Penta D(8,8)，而毛细管电泳结果为 D18S51(15,18)，Penta D(8,12)，均缺失一个长片段等位基因；当腐殖酸浓度达到 50 ng/L 时，等位基因最大深度1，扩增明显抑制。2.6 HID_AM Panel v1.0 物种特异性分析 本体系对鸭、鼠、牛、兔、鸡的 DNA 进行文库构建和测序分析，样本检出基因座(深度100)及总测序深度如图 6 所示，鸭检出 TH01(9,9)、312 Hereditas(Beijing)2024 第 46 卷 图 3 不同 DNA 起始量样本的基因座深度、分型成功率和等位基因均衡性 Fig.3 Loci depth,genotyping success rate,and allele balance with different DNA starting amounts A：不同 DNA 起始量样本的各基因座深度；B：不同 DNA 起始量样本的各类基因座分型成功率；C：不同 DNA 起始量样本的各基因座等位基因均衡性。第 4 期 韩伟等:适用于降解样本的 201 个遗传标记检测体系的构建和验证 313 表 1 模拟降解样本大片段、小片段、Y 染色体片段浓度、降解指数及遗传标记分型成功率 Table 1 Concentrations of large amplicon,small amplicon,Y chromosome amplicon,degradation index(DI)and genotyping success rate of genetic markers in mock degraded samples 样本名称 大片段(pg/L)小片段(pg/L)Y 片段(pg/L)降解指数 DI STR 分型成功率(%)SNP+InDel 分型成功率(%)MH 分型成功率(%)全部遗传标记分型成功率(%)D1 0.44 0.80 1.32 1.84 98.51 99.11 100 98.97 D2 0.24 0.71 1.18 2.93 98.51 100 100 99.66 D3 0.14 0.70 1.03 4.84 97.01 99.11 100 98.63 D4 0.31 0.86 1.29 2.72 97.01 99.11 100 98.63 D5 0.07 0.69 0.94 10.45 95.52 98.22 100 97.6 D6 0.04 0.65 0.99 15.78 92.54 97.33 100 96.23 D7 0.02 0.40 0.74 16.66 97.01 100 100 99.32 D8 0.03 0.51 0.80 20.35 97.01 99.11 100 98.63 D9 0.01 0.41 0.69 37.61 97.01 98.67 100 98.29 D10 0.01 0.54 0.66 82.78 91.04 98.22 100 96.58 D11 0.00 0.49 0.62 401.02 83.58 95.56 87.5 92.12 图 4 模拟降解样本的等位基因均衡性及分型成功率比较 Fig.4 Allele balance and comparison of genotyping success rate in mock degraded samples A：各组模拟降解样本等位基因均衡性分布；B：HID_AM Panel v1.0 与 GlobalFiler 试剂盒在模拟降解样本中的分型成功率。CSF1PO(10,11)两个基因座；鼠检出 TH01(9,9)、Penta E(11,11)、rs754159999(A/A)三个基因座；牛检 出D18S51(12,17)；兔 检 出TH01(8,9)、DYS643(11)、Y_GATA_H4(12)三个基因座；鸡检出CSF1PO(10,11)、DYS533(10,11)两个基因座，所有动物检出基因座均小于 3，且所有物种中最大的总测序深度仅为 3325，是标准品的 0.63%。2.7 HID_AM Panel v1.0 在常规样本中的分型结果 在批量检测的 67 例血液样本(含 7 个女性)中，3048 个 STR 检出 3042 个，总体检出率达 99.80%，平均深度2000以上，其中4个样本的vWA未检出，2 个样本的 Penta E 未检出。8810 个 SNP、730 个 314 Hereditas(Beijing)2024 第 46 卷 表 2 加入不同浓度血红素、靛蓝、腐殖酸后分型错误的基因座 Table 2 The loci typed incorrectly after adding different concentrations of hematin,indigo blue or humic acid 样品名 分型错误 STR 分型错误 SNP 分型错误 InDel 分型错误 MH血红素-空白/血红素-5 mol/L CSF1PO/血红素-10 mol/L CSF1PO、D7S820、D9S1122、DYS437、DYS392、DYS448、DYS438/rs3032356/血红素-20 mol/L/血红素-40 mol/L D17S974、D19S433、D3S1358、D7S820、DYS481、DYS19、DYS643、Y_GATA_H4、DYS389II/血红素-80 mol/L 靛蓝-空白/靛蓝-2 mmol/L D18S51、Penta D、FGA、DYS458、DYS518、DYS389II rs1413212、rs2399332、rs717302、rs159606、rs12174864、rs1336071、rs826472、rs3780962、rs2107612、rs1295330、rs2096458、rs914165、rs747718394 rs35771136、rs2307805、rs16660 mh13KK-213靛蓝-4 mmol/L 腐殖酸-空白/腐殖酸-1 ng/L/腐殖酸-5 ng/L CSF1PO、D7S820、DYS393、DYS389I rs1295330/腐殖酸-10 ng/L DYS389II rs1295330/腐殖酸-15 ng/L D18S51、D21S11、Penta D、DYS518、DYS389II rs1295330、rs2096458/腐殖酸-50 ng/L 斜体标注基因座缺失一个等位基因，其余基因座缺失全部等位基因；代表基因座未检出，/代表无错误基因座。图 5 加入不同浓度血红素或腐殖酸后的 STR 分型成功率 Fig.5 Genotyping success rate of STR after adding different concentrations of hematin or humic acid 图 6 动物与人检出基因座和总测序深度对比 Fig.6 Comparison of detected loci and total sequen-cing depth between animals and human beings InDel、536 个 MH 全部检出，平均深度 2000以上。7个女性样本中 Y-SNP 深度均小于 10，与男性明显区分，但均检出深度在 100以下的 DYS533 基因座，第 4 期 韩伟等:适用于降解样本的 201 个遗传标记检测体系的构建和验证 315 通过针对 DYS533 设置独立分析阈值以消除错误，其余的 Y-STR、Y-SNP、Y-InDel 均未检测到扩增产物。11 个血卡样本均获得完整的 DNA 分型图谱，说明本体系适用于常规血液样本和血卡样本。3 讨论 不同类型的遗传标记优势互补，通过联合应用检测，可为个体识别提供更全面的信息。在法医物证学实践中，经常面临 DNA 降解、遗传标记检出率低的难题。选择合适的遗传标记，是提高遗传标记检出成功率，增强个体识别效力的关键途径。本研究基于高通量测序，筛选一套片段短、鉴定效力高的多类型遗传标记，自主构建复合扩增试剂盒HID_AM Panel v1.0。本研究首先按照兼顾数据库已有基因座和文献报道、经过群体遗传学验证的基因座的原则，筛选短片段遗传标记，获取包含 201 个遗传标记的组合。在选取的 151 个常染色体遗传标记中，有 1 对遗传标记(rs214955-rs2308139)的物理距离为 80.6 kb，基于 Plink 1.9 软件35，采用千人基因组计划第三阶段的 208