多抗制备免疫比浊实验专家讲座.pptx

沉淀反应沉淀反应微生物与免疫教研室微生物与免疫教研室多抗制备免疫比浊实验第1页此次试验内容试验一、双向免疫扩散试验试验一、双向免疫扩散试验 LDL多抗判定及效价测定多抗判定及效价测定试验二、免疫浊度测定试验二、免疫浊度测定 免疫球蛋白检测免疫球蛋白检测 多抗制备免疫比浊实验第2页一、此次试验目标：1、掌握可溶性抗原制备抗血清判定惯用方法。2、掌握双向免疫扩散试验方法。3、掌握抗体效价判断。4、掌握免疫浊度测定原理。5、熟悉免疫球蛋白检测临床意义。多抗制备免疫比浊实验第3页沉淀反应（precipitation）可溶性抗原可溶性抗原与对应抗体在适与对应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现当条件下发生特异性结合所出现沉淀现象沉淀现象。多抗制备免疫比浊实验第4页分类分类液体内沉淀试验液体内沉淀试验絮状沉淀试验絮状沉淀试验环状沉淀试验环状沉淀试验免疫浊度测定免疫浊度测定凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验免疫扩散免疫扩散免疫电泳免疫电泳单向免疫扩散试验单向免疫扩散试验双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验火箭免疫电泳火箭免疫电泳对流免疫电泳对流免疫电泳沉淀反应沉淀反应多抗制备免疫比浊实验第5页思索：抗原抗体反应四大特点？特异性特异性 可逆性可逆性百分比性百分比性 阶段性阶段性多抗制备免疫比浊实验第6页沉淀反应特点抗原为抗原为可溶性可溶性物质，如蛋白质、多糖物质，如蛋白质、多糖沉淀反应分两个阶段：沉淀反应分两个阶段：第一阶段、抗原抗体特异性结合第一阶段、抗原抗体特异性结合(不可见不可见)第二阶段、形成可见免疫复合物（可见）第二阶段、形成可见免疫复合物（可见）条件条件 电解质，温度，酸碱度电解质，温度，酸碱度 多抗制备免疫比浊实验第7页凝胶内沉淀试验(gel phase precipitation)主要是指主要是指琼脂糖扩散琼脂糖扩散或称或称凝胶凝胶扩散扩散(gel diffusion)(gel diffusion)。惯用凝胶有。惯用凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。胺凝胶等。多抗制备免疫比浊实验第8页依据试验目标与方法不一样，可将固相内沉依据试验目标与方法不一样，可将固相内沉淀验分为淀验分为2类：类：（一）免疫扩散（一）免疫扩散 单向单向免疫扩散试验免疫扩散试验 (single gel diffusion test)双向双向免疫扩散试验免疫扩散试验 (double gel diffusion test)（二）凝胶免疫（二）凝胶免疫电泳电泳(gel immuno-electrophoresis)火箭免疫电泳火箭免疫电泳双扩散免疫电泳双扩散免疫电泳多抗制备免疫比浊实验第9页一、单向免疫扩散试验(一一)原理原理 将一定量抗体混入琼脂凝胶中，将一定量抗体混入琼脂凝胶中，使待测抗原物质在凝胶中自由扩散，使待测抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。与抗原浓度呈正相关。多抗制备免疫比浊实验第10页(二)操作步骤（平板法）1.1.将将抗体抗体和和0.9%0.9%琼脂糖琼脂糖50-5650-56混合混合,即刻即刻倾注成平板。倾注成平板。2.2.待凝固后在琼脂板上打孔待凝固后在琼脂板上打孔,孔中加入孔中加入已已稀释抗原溶液稀释抗原溶液和不一样浓度和不一样浓度抗原标准品抗原标准品溶液溶液。3.3.置置37,37,让其向四面自由扩散让其向四面自由扩散,24-48h,24-48h后后可见其孔周围出现沉淀环。可见其孔周围出现沉淀环。多抗制备免疫比浊实验第11页单向辐射状免疫扩散单向辐射状免疫扩散上排为上排为5个不一样参考，中、下排为患者血清，个不一样参考，中、下排为患者血清，下排右下排右2为一异常病理血清为一异常病理血清多抗制备免疫比浊实验第12页(三)方法评价 单向琼脂扩散试验是一个稳定、单向琼脂扩散试验是一个稳定、简便、毋需特殊设备，普通试验室简便、毋需特殊设备，普通试验室均可使用常规方法，试验重复性和均可使用常规方法，试验重复性和线性均好。敏感度为线性均好。敏感度为1.25mg/L多抗制备免疫比浊实验第13页(四)影响原因1.抗原分子量抗原分子量 抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上含有均一性，待检血清和抗原标准品在血清学上含有均一性，不然可能出现结果偏高或偏低。不然可能出现结果偏高或偏低。2.抗体种类抗体种类 试验证实兔抗血清优于马、羊抗血清，兔试验证实兔抗血清优于马、羊抗血清，兔抗血清可测抗原抗血清可测抗原0.11IU/ml，马抗血清为，马抗血清为110IU/ml，羊为，羊为0.44IU/ml，为提升试验，为提升试验敏感度，应首选敏感度高抗血清。敏感度，应首选敏感度高抗血清。多抗制备免疫比浊实验第14页3.抗体稀释度抗体稀释度 抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度小，沉淀环增大，不一样浓度抗抗体浓度小，沉淀环增大，不一样浓度抗原间差异较显著，敏感度高。但沉淀环过原间差异较显著，敏感度高。但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也增大。所以增大。所以要求在沉淀环清楚基础上加大要求在沉淀环清楚基础上加大稀释度以提升敏感度稀释度以提升敏感度。多抗制备免疫比浊实验第15页二、双向琼脂扩散试验(一一)原理原理 将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板对应孔中，二者各自在凝胶中向四面板对应孔中，二者各自在凝胶中向四面自由扩散，当抗原与抗体相遇，在百分自由扩散，当抗原与抗体相遇，在百分比适当时形成可见白色沉淀线。沉淀线比适当时形成可见白色沉淀线。沉淀线特征与抗原抗体特征与抗原抗体浓度、纯度和扩散速率浓度、纯度和扩散速率等相关。等相关。多抗制备免疫比浊实验第16页(二)操作步骤（平板法）（平板法）1.融化琼脂，浇板融化琼脂，浇板 每张载玻片约每张载玻片约4ml。2.凝固，打孔凝固，打孔 孔径孔径3mm，孔间距，孔间距35mm，孔，孔型有型有双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花孔双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花孔型。型。3.加样加样 在相对孔内加抗原或抗体。在相对孔内加抗原或抗体。4.孵育孵育 使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗原抗体相遇，在百分比适时形成可见沉淀线。原抗体相遇，在百分比适时形成可见沉淀线。沉淀线数目、形态和位置与抗原和抗体纯度、沉淀线数目、形态和位置与抗原和抗体纯度、浓度和扩散速度相关。浓度和扩散速度相关。多抗制备免疫比浊实验第17页多抗制备免疫比浊实验第18页(三)双向免疫扩散试验应用1.检测未知抗原或抗体及其相对含量 将已知抗体或抗原与待检标本加入将已知抗体或抗原与待检标本加入成对孔中成对孔中依据沉淀线有没有依据沉淀线有没有定性定性；依据沉淀线位置预计抗原或抗体依据沉淀线位置预计抗原或抗体相对含量相对含量依据沉淀弧形状判断抗原或抗体依据沉淀弧形状判断抗原或抗体相对扩散速率。相对扩散速率。多抗制备免疫比浊实验第19页沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度关系沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度关系沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度关系沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度关系A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；浓度及扩散率近似；B：Ag、Ab浓度近似，扩散率浓度近似，扩散率Ag Ab；C：Ag、Ab浓度近似，扩散率浓度近似，扩散率Ag Ab；D：扩散率近似，浓度：扩散率近似，浓度Ag Ab；E：浓度：浓度Ag Ab，扩散率，扩散率Ag Ab；F：浓度：浓度Ag Ab，扩散率，扩散率Ag Ab多抗制备免疫比浊实验第20页2.抗原性质分析 利用利用三角孔型三角孔型，将待检抗原和标准抗原，将待检抗原和标准抗原加入相邻两个孔中，与另一孔相对，依加入相邻两个孔中，与另一孔相对，依据沉淀线形状分析待测抗原，见图据沉淀线形状分析待测抗原，见图。多抗制备免疫比浊实验第21页 三种扩散基本图型三种扩散基本图型多抗制备免疫比浊实验第22页3.抗体效价滴定抗体效价滴定 用用梅花型梅花型孔，中间放孔，中间放抗原，周围孔放下不抗原，周围孔放下不一样稀释度对应抗体，一样稀释度对应抗体，以出现沉淀线最高稀以出现沉淀线最高稀释倍数为该抗体效价。释倍数为该抗体效价。多抗制备免疫比浊实验第23页 效价检测结果效价检测结果该图是经过一次基础免疫，三次加强免疫，间隔七该图是经过一次基础免疫，三次加强免疫，间隔七天之后，颈动脉取血所得血清测定效价。天之后，颈动脉取血所得血清测定效价。免疫双扩散测效价，加样方式同上，从图中能够看免疫双扩散测效价，加样方式同上，从图中能够看出最终测得效价分别为：出最终测得效价分别为：1 1：256256，1 1：128128，1 1：128128中中中中间间孔孔孔孔抗原；抗原；抗原；抗原；周周周周围围孔孔孔孔血血血血清清清清血血血血清清清清稀稀稀稀释释倍倍倍倍数数数数分分分分别为别为：孔孔孔孔11/811/811/811/8；孔孔孔孔21/1621/1621/1621/16；孔孔孔孔31/3231/3231/3231/32；孔孔孔孔41/6441/6441/6441/64；孔孔孔孔51/12851/12851/12851/128；孔孔孔孔61/25661/25661/25661/256654321多抗制备免疫比浊实验第24页4.抗体或抗原纯度判定抗体或抗原纯度判定用混合抗原或抗体判定抗体或抗原，出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯，出现多条说明不纯。多抗制备免疫比浊实验第25页双扩散试验优缺点优点：简单易行，用途广泛优点：简单易行，用途广泛缺点：技术灵敏度低，出现结果慢，不缺点：技术灵敏度低，出现结果慢，不能准确定量。能准确定量。多抗制备免疫比浊实验第26页经典沉淀试验有经典沉淀试验有4个缺点无法克服：个缺点无法克服：操作繁琐操作繁琐敏感度低（敏感度低（10100g/ml）时间长时间长难以自动化难以自动化多抗制备免疫比浊实验第27页免疫浊度测定（一）基本原理：免疫浊度测定基本原理是：抗原抗免疫浊度测定基本原理是：抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。合物，使反应液出现浊度。当当反应液中反应液中保持保持抗体过量且固定抗体过量且固定时，形成时，形成复合物随复合物随抗原量增加而增加抗原量增加而增加，反应液，反应液浊度亦浊度亦随之随之增加增加，与一系列标准品对照，即可计算，与一系列标准品对照，即可计算出受检物含量。出受检物含量。多抗制备免疫比浊实验第28页（二）类型1.透射免疫比浊法2.散射免疫比浊法3.免疫胶乳比浊法 多抗制备免疫比浊实验第29页多抗制备免疫比浊实验第30页1 透射免疫比浊法原理：原理：抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物(IC)，当光线透过反应溶液时，因为溶液内复，当光线透过反应溶液时，因为溶液内复合物粒子对光线合物粒子对光线反射和吸收反射和吸收，引发透射光降低，引发透射光降低，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线吸收免疫复合物量越多，透射光越少，即光线吸收越多，可用吸光度表示。越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物量成吸光度和复合物量成正比正比，当抗体量固定时，与待检抗原量成正比。，当抗体量固定时，与待检抗原量成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。含量。多抗制备免疫比浊实验第31页方法评价：优点：优点：灵敏度比单扩法高灵敏度比单扩法高510倍；倍；CV小于小于10；操作简便快速，操作简便快速，1h可汇可汇报结果；报结果；结果准确，且能用全自结果准确，且能用全自动化或半全自动化仪器动化或半全自动化仪器进行分析，尤其伴随胶进行分析，尤其伴随胶乳粒子增强浊度测定法乳粒子增强浊度测定法出现，使敏感度提升，出现，使敏感度提升，其应用愈加广泛。其应用愈加广泛。缺点：缺点：抗体用量较大；抗体用量较大；检测需抗原抗体反应检测需抗原抗体反应到达平衡，耗时较长；到达平衡，耗时较长；不宜用于药品等半抗不宜用于药品等半抗原测定；原测定；灵敏度较散射比浊法灵敏度较散射比浊法低。低。多抗制备免疫比浊实验第32页2 散射免疫比浊法原理：原理：散射光散射光系指一定波长光沿水平轴照射，碰到系指一定波长光沿水平轴照射，碰到小颗粒免疫复合物，光线被折射，发生偏转，小颗粒免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转角度可因光线波长和颗粒大小不一样这种偏转角度可因光线波长和颗粒大小不一样而有所区分。散射浊度法是在入射光一定角度而有所区分。散射浊度法是在入射光一定角度检测粒子发出散射光，检测粒子发出散射光，散射光强度与复合物含散射光强度与复合物含量呈正比，量呈正比，即待测抗原越多，形成复合物越多，即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为散射光强度越强。又可分为速率散射比浊法速率散射比浊法(rate nephelometry)(rate nephelometry)和和终点散射比浊法终点散射比浊法(endpoint nephelometry)(endpoint nephelometry)。多抗制备免疫比浊实验第33页3 免疫胶乳比浊法原理原理 选择一个大小适中，均匀一致胶乳颗选择一个大小适中，均匀一致胶乳颗粒，吸附抗体后，当碰到对应抗原时，则粒，吸附抗体后，当碰到对应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光降低。这种降低程度与胶乳凝集使透过光降低。这种降低程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。成正比，与抗原量成正比。多抗制备免疫比浊实验第34页（a a）带抗体胶乳在波长之内可透过光线；）带抗体胶乳在波长之内可透过光线；（b b）结合后，则形成光线衰减）结合后，则形成光线衰减多抗制备免疫比浊实验第35页方法评价 敏感度高，试剂稳定，因反应液敏感度高，试剂稳定，因反应液中无中无PEGPEG沉淀剂影响，个体沉淀剂影响，个体ICIC对结果对结果影响也小，所以结果稳定、可靠，特影响也小，所以结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，普通分异性好；不需特殊仪器设备，普通分光光度计、自动化生化分析仪或散射光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。比浊仪均可使用。多抗制备免疫比浊实验第36页总评价缺点：缺点：测定结果与仪器测定结果与仪器性能和试剂质量亲密性能和试剂质量亲密相关，尤其反抗体质相关，尤其反抗体质量要求高，仪器和试量要求高，仪器和试剂价格比较贵。剂价格比较贵。优点：优点：自动化自动化快速快速(30(3060s)60s)灵敏灵敏(g/L)(g/L)准确准确精密度高精密度高(CV5(CV5)稳定性好稳定性好节约试剂节约试剂检测范围广检测范围广不需减去样本和试剂不需减去样本和试剂本底值等优点。本底值等优点。多抗制备免疫比浊实验第37页(三)免疫比浊法主要影响原因1.抗原抗体百分比抗原抗体百分比2.抗体质量抗体质量3.抗原抗体反应溶液抗原抗体反应溶液4.增浊剂使用增浊剂使用多抗制备免疫比浊实验第38页1 抗原抗体百分比1.1.高剂量钩状效应（高剂量钩状效应（high dose hook high dose hook effect)effect)2.2.海德堡（海德堡（heidelbergerheidelberger）曲线理论曲线理论多抗制备免疫比浊实验第39页多抗制备免疫比浊实验第40页多抗制备免疫比浊实验第41页2 抗体质量（1 1）特异性高）特异性高（2 2）效价高）效价高（3 3）亲和力高）亲和力高（4 4）抗血清起源）抗血清起源多抗制备免疫比浊实验第42页3 抗原抗体反应溶液pH 6.58.5电解质电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）多抗制备免疫比浊实验第43页4 增浊剂使用PEGPEG、tween-20tween-20等非离子型亲水剂等非离子型亲水剂作用：消除蛋白质分子周围电子云作用：消除蛋白质分子周围电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。近，结合形成大分子复合物。多抗制备免疫比浊实验第44页此次试验内容试验一、双向免疫扩散试验试验一、双向免疫扩散试验 LDL多抗判定及效价测定多抗判定及效价测定试验二、免疫浊度测定试验二、免疫浊度测定 免疫球蛋白检测免疫球蛋白检测 多抗制备免疫比浊实验第45页血清采集与处理取血方法：血清采集：耳缘静脉取血或颈动脉取血。血清处理：取好血后，放入取好血后，放入取好血后，放入取好血后，放入3737，30min30min后，使血清充分后，使血清充分后，使血清充分后，使血清充分析出（不能冰冻，不然产生溶血），经析出（不能冰冻，不然产生溶血），经析出（不能冰冻，不然产生溶血），经析出（不能冰冻，不然产生溶血），经3000rpm/5min3000rpm/5min分离血清分离血清分离血清分离血清，剩下放进剩下放进剩下放进剩下放进-20-20冰冰冰冰箱保留。箱保留。箱保留。箱保留。试验一、双向免疫扩散试验试验一、双向免疫扩散试验 LDL多抗判定及效价测定多抗判定及效价测定多抗制备免疫比浊实验第46页试验二、免疫浊度测定试验二、免疫浊度测定 免疫球蛋白检测免疫球蛋白检测试验步骤见说明书试验步骤见说明书IgG13g/L IgA2.62g/L IgM1.1g/L多抗制备免疫比浊实验第47页