光学显微镜基础知识100条.pdf

中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）1 中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）2 目录目录 1 显微镜的光学原理图.12 显微镜观察方式一 明视野观察（Bright field,BF）.13 显微镜观察方式二 暗视野观察（Dark field）.14 显微镜观察方式三 相差镜检法（Phase contrast,PH）.25 显微镜观察方式四 微分干涉镜检术（DIC）.36 显微镜观察方式五 偏光显微镜（Polarizing Microscopy,POL）.47 显微镜观察方式六 霍夫曼调制相衬（HMC）.58 显微镜观察方式七 荧光显微镜（Fluorescence Microscopy,FL）.69 显微镜观察方式八 塑料 DIC（Plas DIC）.710 物镜.711 消色差物镜（Achromatic）.812 复消色差物镜（Apochromatic）.813 平场消色差物镜（Plana chromatic）.814 平场复消色差物镜（PF,Planapochromatic）.815 半复消色差物镜（Semi Apochromatic）.816 放大率（Magnification）.817 视场数.918 物镜参数：数值孔径.919 物镜参数：焦深.1020 物镜参数：齐焦距离.1021 物镜参数：工作距离.1122 物镜参数：分辨率.1123 覆盖差.1124 齐焦合轴.1225 目镜.1226 阿贝聚光镜（Abbe condenser）.1227 消色差聚光镜（Achromatic aplanatic condenser）.1328 摇出式聚光镜（Swing out condenser）.1329 暗视野聚光镜.1330 相差聚光镜.1431 微分干涉聚光镜.1432 视场光阑.1533 象差.1534 色差（Chromatic aberration）.1535 球差（Spherical aberration）.1536 彗差（Coma）.16中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）337 象散（Astigmatism）.1638 场曲（Curvature of field）.1639 畸变（Distortion）.1640 机械筒长.1641 偏振光.1742 萤石物镜.1843 体视显微镜.1844 冷光源.1845 变倍比.1946 同轴落射照明.1947 环形光照明.2048 倒置显微镜.2049 视频显微镜.2050 有限远与无限远光学系统.2051 临界照明（Critical illumination）.2152 柯勒照明（Kohler illumination）.2153 切片.2154 斯托克位移.2155 自发荧光.2256 次发荧光.2257 免疫荧光.2258 荧光光源.2259 显微图像软件.2460 三维反卷积.2461 目镜测微尺.2562 台微尺.2663 多人共览.2764 折射率.2765 载物台.2766 白平衡.2867 色温.2868 日光型滤光片.2969 绿色滤色片.2970 中灰度滤色片.2971 荧光滤色块.2972 荧光滤色块转盘.3073 荧光串色.3074 绿色荧光蛋白.3175 显微标本制作技术.3176 物镜转盘.3277 工具显微镜.3278 金相显微镜.3279 金相试样制备.3280 反射微分干涉技术.33中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 81 反射暗场技术.3382 C 接口.3383 活细胞工作站.3484 碟片共聚焦（转盘式共聚焦）.3485 显微切割技术.3486 全自动病理扫描系统.3587 显微操作.3588 荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET）.3589 荧光漂白恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching,FRAP）.3690 光漂白中的荧光损失（Fluorescence Losing In Photobleach,FLIP）.3691 荧光共定位分析（Colocalization）.3692 激光扫描共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM）.3693 针孔（pinhole）.3794 荧光寿命成像（Fluorescence Life-time Imaging Microscopy,FLIM）.3795 双光子显微镜.3896 超高分辨率技术（Super Resolution Microscopy,SRM）.3997 全内反射荧光显微镜（Total Internal Reflection Fluorescence,TIRF）.4098 光激活定位显微技术（Photoactivated Localization Microscopy,PALM）.4099 随机光学重建显微法（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,STROM）.41100 受激发射损耗显微技术（Stimulated Emission Depletion,STED）.42 光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）4中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条条 1 显微镜的光学原理图显微镜的光学原理图 光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）1 2 显微镜观察方式一显微镜观察方式一 明视野观察（Bright field,BF）目目目目镜镜镜镜 物物物物镜镜镜镜 眼眼眼眼睛睛睛睛 明视野镜检是大家比较熟悉的一种镜检方式，广泛应用于病理、检验，用于观察被染色的切片，所有显微镜均能完成此功能。明视野图片明视野图片 3 显微镜观察方式二显微镜观察方式二 暗视野观察（Dark field）暗视野实际是暗场照明。它的特点和明视野不同，不直接观察到照明的光线，而观察到的是被检物体反射或衍射的光线。因此，视场为黑暗的背景，而被检物体则呈现明亮的像。暗视野的原理是根据光学上的丁道尔现象，微尘在强光直射通过的情况下，人眼不能观察，这是因为强光绕射造成的。若把光线斜射它，由于光的反射，微粒似乎增大了体积，为人眼可见。暗视野观察所需要的特殊附件是暗视野聚光镜。它的特点是不让光束由下至上的中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 通过被检物体，而是将光线改变途径，使其斜射向被检物体，使照明光线不直接进入物镜，利用被检物体表面反射或衍射光形成的明亮图像。暗视野观察的分辨率远高于明视野观察，最高达 0.02-0.004m。暗视野图片暗视野图片 4 显微镜观察方式三显微镜观察方式三 相差镜检法（Phase contrast,PH）在光学显微镜的发展过程中，相差镜检法的发明成功，是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道，人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度）。对于无色透明的生物标本，当光线通过时，波长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到标本。相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，也就是有效的利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察，因此相差镜检法广泛应用于倒置显微镜。相差图片相差图片 相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了 1/4（波长），如果再增加或减少 1/4，则光程差变为 1/2，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，提高反差。在构造上，相差显微镜又不同于普通光学显微镜，具有两个特殊之处：（1）环形光阑（annular diaphragm）位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）2中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 （2）相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟 1/4。分为两种：A+相板：将直射光推迟 1/4，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加明亮，形成亮反差（或称负反差）。B+相板：将衍射光推迟 1/4，两组光波合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更暗。相差原理相差原理 5 显微镜观察方式四显微镜观察方式四 微分干涉镜检术（DIC）微分干涉镜检术出现于 60 年代，它不仅能观察无色透明的物体，而且图像呈现出浮雕状的立体感，并具有相衬镜检术所不能达到的某些优点，观察效果更为逼真。原理：微分干涉镜检术是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等，光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小，而不出现重影现象，使图像呈现出立体的三维感觉。微分干涉图片微分干涉图片 DIC 显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。DIC 利用的是偏光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）3中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 振光，有四个特殊的光学组件：偏振器（polarizer）、DIC 棱镜、DIC 滑行器和检偏器（analyzer）。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了偌玛斯基棱镜，即 DIC 棱镜，此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x 和 y），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个偌玛斯基棱镜，即 DIC 滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（x 和 y）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。在光束形成目镜 DIC 影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x 和 y 波的光程差决定着透光的多少。光程差值为 0 时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出明暗差。为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节DIC 滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的亮度。调节 DIC 滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。微分干涉原理图微分干涉原理图 6 显微镜观察方式五显微镜观察方式五 偏光显微镜（Polarizing Microscopy,POL）偏光显微镜是用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。（1）偏光显微镜的特点 将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同性）或双折射性（各向异性）。双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛的应用在矿物、化学等领域，在生物学和植物学也有应用。（2）偏光显微镜的基本原理 偏光显微镜的原理比较复杂，在此不做过多介绍，偏光显微镜必须具备以下附件：起偏光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）4中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 镜，检偏镜，补偿器或相位片，专用无应力物镜，旋转载物台。（3）偏光镜检术的方式 正相镜检（Orthscope）：又称无畸变镜检，其特点是使用低倍物镜，不用伯特兰透镜（BertrandLens），被研究对象可直接用偏振光研究。同时为使照明孔径变小，推开聚光镜的上透镜。正相镜检用于检查物体的双折射性。锥光镜检（Conoscope）：又称干涉镜检，研究在偏振光干涉时产生的干涉图样，这种方法用于观察物体的单轴性或双轴性。在该方法中，用强会聚偏振光束照明。（4）偏光显微镜在装置上的要求 光源：最好采用单色光，因为光的速度、折射率和干涉现象由于波长的不同而有差异。一般镜检可使用普通光。目镜：要带有十字线的目镜。聚光镜：为了取得平行偏光，应使用能推出上透镜的摇出式聚光镜。伯特兰透镜：聚光镜光路中的辅助部件，这是把物体所有造成的初级相放大为次级相的辅助透镜。它可保证用目镜来观察在物镜后焦平面中形成的平涉图样。（5）偏光镜检术的要求 载物台的中心与光轴同轴。起偏镜和检偏镜应处于正交位置。制片不宜过薄。（6）典型应用图例 偏光图像（纤维和淀粉）偏光图像（纤维和淀粉）7 显微镜观察方式六显微镜观察方式六 霍夫曼调制相衬（霍夫曼调制相衬（HMC）原理是利用斜射光照射，它将相位梯度转换为光强度变化，这样可以用来观察未经染色的样品和活细胞。这项技术可以视厚样品观察有立体感。罗伯特霍夫曼博士在 1975 年发明这项技术。光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）5中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 霍夫曼调制相衬霍夫曼调制相衬 HMC 照明的一个例子是使用在体外受精实验中，其中光照下几乎透明的卵母细胞是很难看清楚。所以 HMC 没有 DIC 的效果好。HMC的系统通常包括一个带狭缝的聚光镜和带狭缝的物镜。聚光镜里还有一个可以旋转的起偏器。根据HMC的原理一些显微镜制造商引进该技术的变种，例如尼康的高级调制相衬（NAMC），奥林巴斯的浮雕相衬（RC）和徕卡的集成霍夫曼调制相衬（IMC）。8 显微镜观察方式七显微镜观察方式七 荧光显微镜（Fluorescence Microscopy,FL）荧光镜检术是用短波长的光线照射用荧光素标记过的被检物体，使之受激发后产生长波长的荧光，然后观察。荧光图像荧光图像（1）优势：检出能力高（放大作用）对细胞的刺激小（可以活体染色）能进行多重染色（2）用途：光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）6中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 物体构造的观察荧光素 荧光的有无、色调比较进行物质判别抗体荧光等 发荧光量的测定对物质定性、定量分析。荧光原理图荧光原理图 9 显微镜观察方式八显微镜观察方式八 塑料DIC（Plas DIC）塑料DIC不同于普通的透射微分干涉显微术（DIC），它不用偏振光这样的特殊光线照亮目标物，因此聚光镜侧也没有起偏器。在透过DIC棱镜后光线才形成线性偏振光，接下来的检偏镜使在同一平面震动的光透过，因此形成干涉。聚光镜内的狭缝光阑足以使光线转变l/4波长，结果就形成清晰的干涉图像。另外，对比度也可方便调节以适应不同的观测目标物。塑料DIC是第一种让人们能够使用塑料容器观察的偏振光学DIC方法。塑料塑料 DIC 原理原理 左为相差，右为塑料左为相差，右为塑料 DIC 的细胞图像的细胞图像 10 物镜物镜 物镜是由若干个透镜组合而成的一个透镜组。组合使用的目的是为了克服单个透镜的成像缺陷，提高物镜的光学质量。显微镜的放大作用主要取决于物镜，物镜质量的好坏直接影响显微镜映像质量，它是决定显微镜的分辨率分辨率和成像清晰程度的主要部件，所以对物镜的校正是很重要的。光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）7中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）8物镜的分类方式：（1）按显微镜镜筒长度（以 mm 计）：透射光用 160 镜筒，带 0.17mm 厚或更厚的盖玻片；反射光用 190 镜筒，不带盖玻片；透射光与反射光用镜筒，筒长无限大。（2）按浸法特征：非浸式（干式）、浸式（油浸、水浸、甘油浸及其他浸法）。（3）按光学装置：透射式、反射式以及折反射式。（4）按数值孔径和放大倍数：低倍（NA0.2 与10X），中倍（NA0.65 与40X），高倍（NA0.65 与40X）。（5）按校正象差的情况：消色差物镜，半复消色差物镜，复消色差物镜，平视场消色差物镜，平视场复消色差物镜和单色物镜。11 消色差物镜（消色差物镜（Achromatic）消色差物镜较常见，由若干组曲面半径不同的一正一负胶合透镜组成，只能矫正光谱线中红光和蓝光的轴向色差。同时校正了轴上点球差和近轴点彗差，这种物镜不能消除二级光谱，只校正黄、绿波区的球差、色差，未消除剩余色差和其他波区的球差、色差，并且像场弯曲仍很大，也就是说，只能得到视场中间范围清晰的像。使用时宜以黄绿光作照明光源，或在光程中插入黄绿色滤光片。此类物镜结构简单，经济实用，常和福根目镜、校正目镜配合使用，被广泛的应用在中、低倍显微镜上。在黑白照相时，可采用绿色滤色片减少残余的轴向色差，获得对比度好的相片。12复消色差物镜（复消色差物镜（Apochromatic）由多组特殊光学玻璃和萤石制成的高级透镜组组合而成。将红、蓝、黄光校正了轴向色差，消除了二级光谱，因此像质很好，但镜片多、加工和装校都较困难。色差的校正在可见光的全部波区。若加入蓝色或黄色滤光片效果更佳。它是显微镜中最优良的物镜，对球面差、色差都有较好的校正，适用于高倍放大。但仍需与补偿目镜配合使用，以消除残余色差。13 平场消色差物镜（平场消色差物镜（Plana chromatic）采用多镜片组合的复杂光学结构，较好的校正像散和像场弯曲，使整个视场都能显示清晰，适用于显微摄影。该物镜对球差和色差的校正仍限于黄绿波区，且还存在剩余色差。14 平场复消色差物镜（平场复消色差物镜（PF,Planapochromatic）除进一步对场曲校正外，其它像差校正程度均与复消色差物镜相同，使映像清晰、平坦；但结构复杂，制造困难。15半复消色差物镜（半复消色差物镜（Semi Apochromatic）部分镜片用萤石制成，故又称萤石物镜，性能比消色差物镜好，价格比复消色差物镜便宜。校正像差程度介于消色差与复消色差两种物镜之间，但其它光学性质都与后者相近。16 放大率（放大率（Magnification）物镜和目镜放大倍数的乘积。中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 观察倍率(M)=物镜倍率 X 目镜倍率 照相倍率(M)=物镜倍率 X 照相目镜倍率 17 视场数视场数 视场数也叫视野数，视场数是指目镜的视场光圈直径用 mm 表示的值。能够观察的样品表面范围由视场数决定。实际视场Field of View（F.O.V.）：通过目镜能观察到的物体表面的实际范围（实际视场）。F.O.V.（Field of View）用下式表示 FOV 计算公式计算公式 18 物镜参数：数值孔径物镜参数：数值孔径 子午光线能进入或离开纤芯（光学系统或挂光学器件）的最大圆锥的半顶角之正弦，乘以圆锥顶所在介质的折射率，数值孔径是判断物镜性能（分辨率、焦深、亮度等）的重要指数。数值孔径又叫镜口率，简写为NA。它是由物体与物镜间媒质的折射率（n）与物镜孔径角的一半（2）的正弦值的乘积，其大小由下式决定：NA=nXsin/2。数值孔径简写NA（蔡司公司的数值孔径简写CF），数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低（即消位置色差的能力，蔡司公司的数值孔是代表消位置色差和倍率色差的能力）的重要标志。其数值的大小，分别标在物镜和聚光镜的外壳上。孔径角又称“镜口角”，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）9中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质率n值。基于这一原理，就产生了水浸系物镜和油浸物镜，因介质的折射率n值大于 1，NA值就能大于 1。数值孔径最大值为 1.4，这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前，有用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为 1.66，所以 NA 值可大于 1.4。与其他参数的关系：数值孔径是显微镜物镜的重要参数，决定了物镜的分辨率。与物镜的放大倍数，工作距离，景深有直接关系。一般来说，它与分辨率成正比，与放大率成正比，焦深与数值孔径的平方成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应的变小。容易产生的误区：数值孔径与分辨率成正比，但这并不是说在选择物镜的时候一定要选择数值孔径（NA）最大才是最好，因为物镜还会有很多其他重要参数，比如荧光透过率、工作距离等等，最好根据自己的实验选择。19 物镜参数：焦深物镜参数：焦深 焦深也叫景深，其定义是：指使用显微镜观察和拍摄样品表面时，从对准焦点的位置开始，改变物镜与样品表面的距离时，对焦能够保持清晰的范围。肉眼的调整能力因人而异，所以焦深也会出现因人而异的情况。现在常用的是与实验结果比较一致的 Berek 公式。焦深计算公式焦深计算公式 20 物镜参数：齐焦距离物镜参数：齐焦距离 齐焦距离是指，对准焦点时的物镜镜体定位面到物体表面的距离。OLYMPUS UIS2/UIS光学系统物镜的齐焦距离为 45 mm，ZEISS ICCS光学体统、LEICA HC光学系统的齐焦距离也是 45mm，NIKON CFI 60 光学系统的齐焦距离是 60mm。光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）10中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 齐焦距离示意图齐焦距离示意图 21 物镜参数：工作距离物镜参数：工作距离 工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。工作距离图示工作距离图示 22 物镜参数：分辨率物镜参数：分辨率 分辨率是指在物体表面能够分解的最小间隔。数值孔径（NA）越大，分辨率越高。通常，分辨率的大小可以用下式表示。分辨率公式分辨率公式 23 覆盖差覆盖差 显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）11中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。国际上规定，盖玻片的标准厚度为 0.17mm，许可范围 0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标的 0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度为 0.17mm。24 齐焦合轴齐焦合轴 齐焦即在镜检时，当用某一倍率的物镜观察图像清晰后，再转换另一倍率的物镜时，其成像亦应基本清晰。而且像的中心偏离也应该在一定的范围内，也就是合轴程度。齐焦性能的优劣和合轴程度的高低是显微镜质量的一个重要标志，它是与物镜的本身质量和物镜转换器的精度有关。25 目镜目镜 目镜的作用是把物镜放大的实像（中间像）再放大一次，并把物像映入观察者的眼中，实质上目镜就是一个放大镜。已知显微镜的分辨率能力是由物镜的数值孔径所决定的，而目镜只是起放大作用。因此，对于物镜不能分辨出的结构，目镜放得再大，也仍然不能分辨出。目镜的结构比物镜简单得多，一般由 2-5 片透镜分 2 组或 3 组构成，上面的一块透镜叫“接目镜”，下面的叫“场镜”。在目镜筒内，目镜的物方焦点平面处装了一个金属的光阑叫“视场光阑”，它的作用是限定有效的范围，而除去周围不清楚的像，物镜放大后的中间像落在视场光阑平面处，所以目镜中的指示标志，目镜测微尺和分划板都装在这个位置。从目镜中透射出来的光线，在目镜的接目镜以上相交，这个相交点叫“眼点”，观察时眼点应该处在眼点的位置上，这样才能接受从目镜射出的全部光线，看到最大的视场，否则观察的效果不好。26 阿贝聚光镜（阿贝聚光镜（Abbe condenser）这是由德国光学大学大师恩斯特阿贝（Ernst Abbe）设计。阿贝聚光镜由两片透镜组成，有较好的聚光能力，但是在物镜数值孔径高于 0.60 时，则色差、球差就显示出来。因此，多用于普通显微镜上。光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）12中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 阿贝聚光镜阿贝聚光镜 27 消色差聚光镜消色差聚光镜（Achromatic aplanatic condenser）这种聚光镜又名“消色差消球差聚光镜”和“齐明聚光镜”，它由一系列透镜组成，对色差球差的校正程度很高，能得到理想的图像，是明场镜检中质量最高的一种聚光镜，其NA值达 1.4。因此，在高级研究显微镜常配有此种聚光镜。它不适用于 4 X以下的低倍物镜，否则照明光源不能充满整个视场。消色差聚光镜消色差聚光镜 28 摇出式聚光镜（摇出式聚光镜（Swing out condenser）在使用低倍物镜时（如 4X），由于视场大，光源所形成的光锥不能充满整个视场，造成视场边缘部分黑暗，只中央部分被照亮。要使视场充满照明，就需将聚光镜的上透镜从光路中摇出。摇出式聚光镜摇出式聚光镜 29 暗视野聚光镜暗视野聚光镜 用于暗视野照明。光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）13中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 暗视野聚光镜暗视野聚光镜 30 相差聚光镜相差聚光镜 用于观察无色透明样本的相差聚光镜，要配合相差物镜使用，倒置显微镜上用的几乎都是相差聚光镜。正置显微镜则会根据用户要求选配。相差聚光镜相差聚光镜 31 微分干涉聚光镜微分干涉聚光镜 该聚光镜是最复杂的一种，也可以叫多功能聚光镜，因为它一般可以实现：明视野，暗视野，相差，DIC等几乎所有观察方式的照明。只有高档研究用显微镜才配置这种聚光镜。微分干涉聚光镜微分干涉聚光镜 光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）14中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 32 视场光阑视场光阑 限制成像范围的光阑称为“视场光阑”。例如，照相系统中的底片框就是视场光阑。光源的视场光阑是显微镜照明光路系统中的重要部件之一。通常是装设在显微镜的底座面上，有保护外罩兼作视场光阑的调节转盘，为便于转动，转盘外围做得较厚大而且滚了花边并在周边上标有刻度作参考。视场光阑由 10 片或更多的页片组成一个接近于圆形的多边形通光光圈，从显微镜的样品视域中可以看到视场光阑经聚光镜所成的多边形，但是视场光阑不可以任意开大或缩小，它只能按照柯勒照明系统的要求并依据所使用的物镜倍数来调节其适当的大小。透射光显微镜的光源，不论是外接的或内置的灯室，都要经底座内的集光聚光系统和反光镜，把原来水平传送的照明光折转 90而垂直向上经视场光阑出射到聚光镜系统中。33 象差象差 象差（aberration），是指透镜或反射镜所呈的像与原物面貌并非完全相同的现象。象差又可以分为几类，例如球面象差是由于一点光源发散的光线被分聚在不同的点上的缘故。色彩象差的原因是透镜的折光指数随光波的长短而变化，从而引起像的边缘呈现色彩。可以理解为实际像与根据单透镜理论确定的理想像的偏离。这些偏离是折射定律造成的。象差是由透镜对色光的不同弯曲能力所致，并造成带有色晕的像。与色无关的象差（“单色象差”）包括使像变形的象差（“畸变”、“场曲”）和使像模糊的象差（“球差”、“彗差”、“散光”）。象差在照相机、望远镜和其他光学仪器中可以通过透镜的组合减小到最低限度。镜面也有与透镜一样的单色象差，但没有象差。34 色差（色差（Chromatic aberration）发生在多色光为光源的情况下，单色光不产生色差。色差色差 白光由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种光组成，各种光的波长不同，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物方的一个点，在像方则可能形成一个色斑。35 球差（球差（Spherical aberration）球差是轴上点的单色相差，是由于透镜的球形表面造成的。球差造成的结果是，一个点成像后，不再是个亮点，而是一个中间亮、边缘逐渐模糊的亮斑。从而影响成像质量。消除方法：使用凸、凹透镜组合。光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）15中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 球差球差 36 彗差（彗差（Coma）慧差 彗差象散属轴外点的单色相差。轴外物点以大孔径光束成像时，发出的光束通过透镜后，不再相交一点，则一光点的像便会得到一逗点状，形如彗星，故称“彗差”。消除方法：使用轴向平行光。37 象散（象散（Astigmatism）也是影响清晰度的轴外点单色象差。当视场很大时，边缘上的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则引起象散。象散使原来的物点在成像后变成两个分离并且相互垂直的短线，在理想像平面上综合后，形成一个椭圆形的斑点。消除方法：通过复杂的透镜组合来消除。38 场曲（场曲（Curvature of field）场曲即像场弯曲。当透镜存在场曲时，整个光束的交点不与理想像点重合，虽然在每个特定点都能得到清晰的像点，但整个像平面则是一个曲面。这样在镜检时不能同时看清整个像面，给观察和照相造成困难。研究用显微镜的物镜一般都是平场物镜，这种物镜已经矫正了场曲。39 畸变（畸变（Distortion）前面所说各种象差除场曲外，都影响像的清晰度。畸变是另一种性质的象差，光束的同心性不受到破坏。因此，不影响像的清晰度，但像与原物体相比，在形状上造成失真。40 机械筒长机械筒长 为了使不同的物镜和目镜在安装组合后能正确对焦，物镜镜筒连接面和目镜安装面（目镜与镜筒的连接面）的距离，以及物镜的一次成像位置到目镜安装面的距离a必须固定。这个距离叫做机械筒长，标准机械筒长为 160 mm。光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）16中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 机械筒长示意图机械筒长示意图 41 偏振光偏振光 偏振原理：通常光源发出的光，它的振动面不只限于一个固定方向而是在各个方向上均匀分布的。这种光叫做自然光。光的偏振性是光的横波性的最直接、最有力的证据，光的偏振现象可以借助于实验装置进行观察，P1、P2 是两块同样的偏振片。通过一片偏振片 P1直接观察自然光（如灯光或阳光），透过偏振片的光虽然变成了偏振光，但由于人的眼睛没有辨别偏振光的能力，故无法察觉。如果我们把偏振片 P1 的方位固定，而把偏振片 P2 缓慢的转动，就可发现透射光的强度随着 P2 转动而出现周期性的变化，而且每转过 90就会重复出现发光强度从最大逐渐减弱到最暗；继续转动 P2 则光强又从接近于零逐渐增强到最大。由此可知，通过 P1 的透射光与原来的入射光性质是有所不同的，这说明经 P1 的透射光的振动对传播方向不具有对称性。自然光经过偏振片后，改变成为具有一定振动方向的光。这是由于偏振片中存在着某种特征性的方向，叫做偏振化方向，偏振片只允许平行于偏振化方向的振动通过，同时吸收垂直于该方向振动的光。通过偏振片的透射光，它的振动限制在某一振动方向上，我们把第一个偏振片 P1 叫做“起偏器”，它的作用是把自然光变成偏振光，但是人的眼睛不能辨别偏振光。必须依靠第二片偏振片 P2 去检查偏振光。旋转 P2，当它的偏振化方向与偏振光的偏振面平行时，偏振光可顺利通过，这时在 P2 的后面有较亮的光。当 P2 的偏振方向与偏振光的偏振面垂直时，偏振光不能通过，在 P2 后面也变暗。第二个偏振片帮助我们辨别出偏振光，因此它也被称为“检偏器”。偏振光原理偏振光原理 光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）17中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 42 萤石物镜萤石物镜 萤石（荧石）物镜，也叫半复消色差物镜（Halfapochromatic），由于部分镜片用萤石制成，故称萤石物镜，性能比消色差物镜好，价格比复消色差物镜便宜。校正象差程度介于消色差与复消色差两种物镜之间，但其他光学性质都与后者相近；价格低廉，最好与补偿目镜配合使用。这种物镜每个厂家的标志不一样，但一般都带有FL（萤石标志）。萤石物镜萤石物镜 ZEISS PLAN-NEOFLUAR 40 43 体视显微镜体视显微镜 体视显微镜又称“实体显微镜”、“立体显微镜”或“操作和解剖显微镜”，是一种具有正像立体感的目视仪器，被广泛的应用于生物学、医学、农林、工业及海洋生物各部门。特点（1）双目镜筒中的左右两光束不是平行，而是具有一定的夹角体视角（一般为 12 度-15度），因此成像具有三维立体感；（2）像是直立的，便于操作和解剖，这是由于在目镜下方的棱镜把像倒转过来的缘故；（3）虽然放大率不如常规显微镜，但其工作距离很长；光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 100 条（系列之二）条（系列之二）18（4）焦深大，便于观察被检物体的全层；（5）视场直径大；（6）对观察体无需加工制作，直接放入镜头下配合照明即可观察。观察物要求放大倍率一般不大，在 200X 以下，常用的在4X-45X 之间，以落照射明为主，也可用透射光观察透明物体或半透明物体，或观察物体的轮廓。因物镜与观察体距离较大，可进行镜下操作。应用于微电子行业、医学外科等领域。目前体视镜的光学结构是：有一个共用的初级物镜，物体成像后的两条光束被两组中间物镜变焦镜分开，并成一体视角再经各自的目镜成像，它的倍率变化是通过改变中间镜组之间的距离而获得的，因此又称为“连续变倍体视显微镜”（Zoomstereo microscope）。随着应用的要求，目前体视镜可选配丰富的选购附件，如荧光，照相，摄像，冷光源等等。44 冷光源冷光源 中国显微图像网 显微镜知识丛书 中国显微图像网 显微镜知识丛书 （1）关于冷光源一词，并非有热光源的说法与之对应，冷光源一方面要求在一定强度的光照条件下对物体的热辐射作用小，另一方面要求光源的色温控制在较高的水平，趋于冷色调，即称之为冷光源。色温偏低的光源即暖色调光源，其波长较长，通常色温低于 5000K，5000-3000K 色温的光源通常是电能直接简单转化为光能的灯源，灯泡发热较高，红外辐射也较高。通常氙气灯、金属卤素弧光灯是常见的冷光源灯源，通过特定的滤光片，对色温改善和热隔绝起到重要的作用。完全不发热的光源是不存在的，光本身就是一种能量的表现，长时间的照射和积累必然会产生热效应。只是在不同环境下，当热散失速度大于其热效应时，给人的感觉是不发热。（2）至今，大多数显微镜使用的照明光源（非荧光），都是发热量很高的灯泡（如卤素灯泡），在正立和倒置显微镜上，由于灯泡位于专门设计的灯室内，因此灯泡产生的热量对样品和观察者产生的不利影响可忽略；但体视显微镜由于构造的原因，可能会令灯泡的位置距离所需观察的样品很近，此时其所产生的热量足以对样品和观察者产生不利影响，有鉴于此，现代的体视显微镜普遍采用将灯泡位置远离观察样品的设计，通常的做法是通过一定长度的光导纤维来传递照明光线，这就免除了上述的不利影响，也就是显微镜行业所称的“冷光源