浅析细菌内毒素检测方法和常见问题.pptx

浅析细菌内毒素检测方法及常见浅析细菌内毒素检测方法及常见问题问题 浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第1页页内内 容容v细菌内毒素介绍细菌内毒素介绍v细菌内毒素检测方法细菌内毒素检测方法v常见问题及处理方案常见问题及处理方案浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第2页页一、细一、细 菌菌 内内 毒毒 素素 简简 介介v主要内容主要内容 起源起源 特征特征 与热源关系与热源关系 在药检中应用在药检中应用浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第3页页v主要起源主要起源 主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素，其化学成份主要是脂多糖，溶后便会释放出内毒素，其化学成份主要是脂多糖，这是一个大分子物质，分子量约为这是一个大分子物质，分子量约为106，其粒径约，其粒径约在在1 5纳米纳米。细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含内毒素量为含内毒素量为1至至100EU/ml。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第4页页v主要特征主要特征（试验器材处理方法）（试验器材处理方法）1.1.耐热性耐热性 普通在普通在100加热加热1小时无影响，小时无影响，120加热加热4小时能破坏小时能破坏98，180200干热干热2小时或小时或250干热半小时干热半小时才能完全破坏。才能完全破坏。故故：注射剂普通灭菌条件是不能破坏内毒素。注射剂普通灭菌条件是不能破坏内毒素。2.2.不耐酸碱性不耐酸碱性 内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第5页页v主要特征主要特征（试验器材处理方法）（试验器材处理方法）3.3.水溶性与不挥发性水溶性与不挥发性 热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。故：不可用湿热灭菌法处理试验器具故：不可用湿热灭菌法处理试验器具浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第6页页v主要特征主要特征（去除内毒素方法）（去除内毒素方法）4.4.滤过性滤过性 原体积很小，约在原体积很小，约在1 15 nm5 nm之间，故能经过除菌之间，故能经过除菌滤器而进入滤液中，但不能经过石棉滤板，也不能滤器而进入滤液中，但不能经过石棉滤板，也不能经过半透膜。经过半透膜。5.5.吸附性吸附性 能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有一定电荷，因而可被一些离子交换介质吸附。一定电荷，因而可被一些离子交换介质吸附。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第7页页v热原热原=内毒素内毒素？热热原原指指微微生生物物产产生生一一些些多多糖糖蛋蛋白白复复合合物物等等使人体发烧物质，使人体发烧物质，不但不但仅仅是是细细菌内毒素。菌内毒素。但但在在药药检检范范围围，细细菌菌内内毒毒素素是是主主要要热热原原物物质质，能能够够说说无无内内毒毒素素就就无无热热原原，控控制制内内毒毒素素就就是控制是控制热热原原。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第8页页v热原检验方法介绍热原检验方法介绍 中中国国药药典典热热原原检检验验方方法法是是采采取取家家兔兔升升温温法法进进行检验。行检验。将将一一定定剂剂量量供供试试品品，静静脉脉注注入入家家兔兔体体内内，在在要要求求时时间间内内，观观察察家家兔兔体体温温升升高高情情况况，以以判判定定供供试试品品中中所含热原程度是否符合要求。所含热原程度是否符合要求。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第9页页热原检验法浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第10页页v与热源对比内毒素检验法优势与热源对比内毒素检验法优势v方便、快捷、经济；方便、快捷、经济；v重现性好、灵敏度高；重现性好、灵敏度高；v防止抗原产生，克服生物测定误差；防止抗原产生，克服生物测定误差；近年来已经普遍采取细菌内毒素检验法，逐步替换了热源近年来已经普遍采取细菌内毒素检验法，逐步替换了热源法法浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第11页页v在药检中应用在药检中应用 细菌内毒素检验作为控制药品质量一个方法，细菌内毒素检验作为控制药品质量一个方法，已经广泛被世界各国药典收载。已经广泛被世界各国药典收载。v成品检验成品检验药品安全性检验之一药品安全性检验之一 v半成品（生产过程）检验半成品（生产过程）检验事前质控伎俩，防事前质控伎俩，防止造成药品成批报废止造成药品成批报废浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第12页页二、二、细菌内毒素检测方法细菌内毒素检测方法v中国药典中国药典同意使用方法同意使用方法：v供试品检测时，可使用其中任何一个方法进行试验。但当测供试品检测时，可使用其中任何一个方法进行试验。但当测定结果有争议时，除另有要求外，以凝胶法结果为准。定结果有争议时，除另有要求外，以凝胶法结果为准。v本节将着重介绍凝胶法操作与相关原理。本节将着重介绍凝胶法操作与相关原理。测定 方法凝胶法凝胶法 光度测定法光度测定法 浊度法浊度法 显色基质法显色基质法 浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第13页页鲎试剂与内毒素反应机理内毒素内毒素C因子因子活化活化C因子因子凝胶凝胶B因子因子 凝固酶原凝固酶原凝固酶凝固酶活化活化B因子因子凝固蛋白原凝固蛋白原鲎凝血系统酶联反应鲎凝血系统酶联反应浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第14页页名词解释名词解释1鲎及鲎试剂鲎及鲎试剂鲎：一个古老栖身于沿海海洋生物，节肢动物鲎：一个古老栖身于沿海海洋生物，节肢动物 门，在我国主要分布于浙江、福建及两广沿海一带。门，在我国主要分布于浙江、福建及两广沿海一带。鲎试剂：利用鲎血液中变性细胞，经裂解液和机械鲎试剂：利用鲎血液中变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到一个细胞溶解物，能与方式促使细胞破裂而提取到一个细胞溶解物，能与极微量细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应速度和极微量细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应速度和凝胶坚固程度与内毒素浓度相关，是体外检测内毒凝胶坚固程度与内毒素浓度相关，是体外检测内毒素敏感试剂。素敏感试剂。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第15页页浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第16页页名词解释名词解释2国家标准品及工作标准品国家标准品及工作标准品国家标准品：国家标准品：（单位：（单位：EU/mlEU/ml）自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品效仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品效价；价；工作标准品：工作标准品：经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符复核、干扰试验及各种阳性对照；复核、干扰试验及各种阳性对照；浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第17页页名词解释名词解释3细菌内毒素检验用水细菌内毒素检验用水凝胶法：凝胶法：内毒素含量小于内毒素含量小于0.015EU/ml0.015EU/ml灭菌注射用水；灭菌注射用水；故：灭菌注射用水故：灭菌注射用水细菌内毒素检验用水细菌内毒素检验用水 光度法：光度法：内毒素含量应小于内毒素含量应小于0.005EU/ml0.005EU/ml；浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第18页页细菌内毒素检测之凝胶法细菌内毒素检测之凝胶法v试验程序试验程序1、试验准备：试剂、仪器及用具、试验准备：试剂、仪器及用具2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度3、鲎试剂灵敏度复核、鲎试剂灵敏度复核4、供试品干扰试验（新药或新方法）、供试品干扰试验（新药或新方法）5、供试品细菌内毒素凝胶法检测、供试品细菌内毒素凝胶法检测浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第19页页v试验材料及用具试验材料及用具1、仪器、仪器名称名称要求要求天平天平感量感量0.1mg0.1mg以下以下电热干燥箱电热干燥箱300300恒温水浴箱恒温水浴箱371 371 水银或酒精温度计水银或酒精温度计100 1 100 1 漩涡混合器漩涡混合器/计时器计时器60min1min60min1min2、器具、器具器具分类器具分类器具名称器具名称反应试管反应试管玻璃试管（外径玻璃试管（外径1075mm）、试管架、）、试管架、小三角瓶或磨口瓶小三角瓶或磨口瓶移液器具移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头其它其它酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、封口膜、记号笔封口膜、记号笔浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第20页页v试剂试剂1 1、鲎试剂：含有国家颁发同意文号、鲎试剂：含有国家颁发同意文号2 2、内毒素工作标准品、内毒素工作标准品3 3、内毒素检验用水、内毒素检验用水4 4、7575乙醇乙醇v惯用英文缩写惯用英文缩写BETBET：细菌内毒素检验：细菌内毒素检验 BETBET水水：细菌内毒素检验用水：细菌内毒素检验用水 MVDMVD：供试品最大有效稀释倍数：供试品最大有效稀释倍数 NCNC：阴性对照：阴性对照MVCMVC：供试品最低有效浓度：供试品最低有效浓度 PCPC：阳性对照：阳性对照：鲎试剂灵敏度：鲎试剂灵敏度 L L：供试品细菌内毒素限值：供试品细菌内毒素限值浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第21页页v灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。复核。目标目标是为了是为了对试剂、检测者操作、环境条件、水平条对试剂、检测者操作、环境条件、水平条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。试验举例：内毒素工作标准品为试验举例：内毒素工作标准品为90EU/支；支；待测鲎试剂灵敏度待测鲎试剂灵敏度0.25EU/ml0.25EU/ml。1 1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用7575酒精擦拭后启开，酒精擦拭后启开，加加1mlBET1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min15min后进行稀释，步骤以下后进行稀释，步骤以下(箭头下方为加入箭头下方为加入BETBET水量水量)：90EU/ml90EU/ml10EU/ml10EU/ml1EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml0.0625EU/ml0.2ml0.2ml1.6ml1.6ml0.2ml0.2ml1.8ml1.8ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第22页页0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml水水水水溶解后标准品溶解后标准品水水水水水水水水9090EU/mlEU/ml1010EU/mlEU/ml1 1EU/mlEU/ml0.50.5EU/mlEU/ml0.250.25EU/mlEU/ml0.1250.125EU/mlEU/ml0.06250.0625EU/mlEU/ml（2）（）（0.5）（0.25）浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第23页页2 2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为、溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml0.1ml装量，则取装量，则取1818支，每支加入支，每支加入0.1mlBET0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于水溶解；若鲎试剂装量大于0.1ml0.1ml，则取若干支，则取若干支，按标示量加入按标示量加入 BETBET水溶解，再取水溶解，再取0.1ml0.1ml分装于标准玻璃试管分装于标准玻璃试管（10mm75mm10mm75mm），将试管按以下形状排列。），将试管按以下形状排列。3 3、加样：每列每支加入对应浓度内毒素标准品溶液各、加样：每列每支加入对应浓度内毒素标准品溶液各0.1ml0.1ml，第五列加入第五列加入BETBET水水0.1ml0.1ml。1 1222 23 30.50.54 40.250.25BETBET水水22220.50.50.50.50.250.250.250.25浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第24页页v反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动混匀，置混匀，置37 水浴中保温水浴中保温602min602min，将每管拿出缓缓，将每管拿出缓缓倒转倒转180180，凝胶不变形为，凝胶不变形为“”，凝胶不能保持完，凝胶不能保持完整为整为“”。当当2.02.0四支管都为阳性，四支管都为阳性，0.25四支管都为阴性时，四支管都为阴性时，试验成立，按下面底公式计算复核灵敏度试验成立，按下面底公式计算复核灵敏度c c：c clglg-1-1(X/4)(X/4)（X:X:反应终点浓度对数值。）反应终点浓度对数值。）当当0.5c c 2.02.0时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测时时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测时仍以标示灵敏度仍以标示灵敏度为准。为准。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第25页页左侧管旋转左侧管旋转180凝胶不能保持完整为阴性，记为凝胶不能保持完整为阴性，记为“”；右侧管旋转；右侧管旋转180180凝胶不变形为阳性，记为凝胶不变形为阳性，记为“”。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第26页页举例：举例：设待复核鲎试剂标示灵敏度设待复核鲎试剂标示灵敏度为为0.125EU/ml0.125EU/ml:平行平行管数管数内毒素标准溶液浓度（内毒素标准溶液浓度（EU/mlEU/ml）NCNC反应终反应终点浓度点浓度C CX X(lgC)(lgC)0.250.250.1250.1250.060.060.030.031+-0.06-1.22-1.222+-0.125-0.903-0.9033+-/0.125-0.903-0.9034+-/0.125-0.903-0.903clg-1(X/4)lg-1（-1.22）（）（-0.903）（）（-1.22）（）（-1.22）/4 0.104（EU/ml）cc在在0.50.52.02.0范围内，符合要求。范围内，符合要求。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第27页页v方法学验证方法学验证供试品干扰预试验供试品干扰预试验目标：目标：确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强），确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强），得到供试品最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数，得到供试品最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数，为正式干扰试验提供依据。为正式干扰试验提供依据。影响原因：影响原因：新药检验方法建立；新药检验方法建立；鲎试剂批号或起源改变；鲎试剂批号或起源改变；检品生产工艺，配方，成份改变；检品生产工艺，配方，成份改变；检品关键成份起源改变；检品关键成份起源改变；浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第28页页 方法学验证方法学验证供试品干扰预试验供试品干扰预试验v供试品溶液最大稀释倍数计算 MVDCL/L:供试品内毒素限值；C：供试品溶液浓度；当L以 EU/ml表示时，C为1ml/ml;当L以EU/mg或EU/u表示时，C单位为mg/ml或u/ml(注意：当L以EU/ml表示时，C值不是样品浓度，就是1)。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第29页页 方法学验证方法学验证供试品干扰预试验供试品干扰预试验v内毒素限值内毒素限值(L)确实定确实定 药典附录有对应计算公式，即当今世界各国普遍采药典附录有对应计算公式，即当今世界各国普遍采取细菌内毒素计算公式，即：取细菌内毒素计算公式，即：L=K/M，式中，式中K为按为按要求给药路径，人每千克体重每小时能够接收不产要求给药路径，人每千克体重每小时能够接收不产生任何不良反应细菌内毒素剂量（亦称致热阈），生任何不良反应细菌内毒素剂量（亦称致热阈），它基本上是一固定值，药典上对每一给药路径它基本上是一固定值，药典上对每一给药路径K值值都有详细要求。都有详细要求。M为按要求给药路径，人每千克体为按要求给药路径，人每千克体重每小时给药最大剂量。这一个值确实定实际上才重每小时给药最大剂量。这一个值确实定实际上才是计算限值关键。是计算限值关键。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第30页页方法学验证方法学验证供试品干扰预试验供试品干扰预试验（1）标准上普通依据药品使用说明书或国家药典委）标准上普通依据药品使用说明书或国家药典委员会编制员会编制临床用药须知临床用药须知来确定最大剂量。来确定最大剂量。如儿如儿童用药剂量大于成人用药剂量，则以儿童剂量为准。童用药剂量大于成人用药剂量，则以儿童剂量为准。（2）为确保安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗）为确保安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等重症用药品、需联适用药药品药品，心血管疾病等重症用药品、需联适用药药品药品，可依据计算值适当调整，严格至计算限值可依据计算值适当调整，严格至计算限值1/2或或1/3。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第31页页v方法学验证方法学验证供试品干扰试验供试品干扰试验 目标：目标：验证预干扰中确定浓度或倍数下供验证预干扰中确定浓度或倍数下供 试品对于鲎试剂与内毒素反应有没有干扰作用。试品对于鲎试剂与内毒素反应有没有干扰作用。试验方法：试验方法：须选择两家以上鲎试剂进行试验须选择两家以上鲎试剂进行试验 编编号号内毒素内毒素浓度浓度/配制内配制内毒素溶毒素溶液液稀稀释释用液用液稀稀释释倍数倍数所所含含内内毒毒素素浓浓度度平行平行管数管数A A无无/供供试试品溶液品溶液2 2B B2/2/供供试试品溶液品溶液供供试试品溶液品溶液1 12 24 48 822110.50.50.250.254 44 44 44 4C C2/检检验用水验用水检验检验用水用水1 12 24 48 822110.50.50.250.254 44 44 44 4D D无无/检检验用水验用水2 2浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第32页页v方法学验证方法学验证供试品干扰试验供试品干扰试验结果判定：结果判定：假如有供试品和无供试品测得鲎试剂灵敏度（假如有供试品和无供试品测得鲎试剂灵敏度（c）均）均在在0.5-2.0范围内时，则认为供试品在该浓度下不干扰范围内时，则认为供试品在该浓度下不干扰试验，不然需要对供试品做适当处理。试验，不然需要对供试品做适当处理。干扰排除：干扰排除：对供试品进行更大倍数稀释；对供试品进行更大倍数稀释；选择灵敏度更高鲎试剂；选择灵敏度更高鲎试剂；其它适宜方法其它适宜方法 如过滤、中和、透析或加热处理等排除干扰。如过滤、中和、透析或加热处理等排除干扰。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第33页页v供试品细菌内毒素凝胶法检测供试品细菌内毒素凝胶法检测 检测方法：检测方法：结结果果 判定判定 阴性阴性 阳性阳性 阳性阳性 阴性阴性编编号号内毒素浓度内毒素浓度/配配制内毒素溶液制内毒素溶液平行管数平行管数 A A无无/供供试试品溶液品溶液2 2 B B2/2/供供试试品溶液品溶液2 2 C C2/检验用水检验用水2 2 D D无无/检验用水检验用水2 2 注：注：A 无干扰浓度供试品溶液；无干扰浓度供试品溶液；B 供试品阳性对照；供试品阳性对照；C 阳性对照；阳性对照；D 阴性对照。阴性对照。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第34页页三、常见问题及处理方案三、常见问题及处理方案1、试验前未复核鲎试剂产品灵敏度、试验前未复核鲎试剂产品灵敏度 鲎试剂灵敏度改变或质量不符合要求，会影响试验结鲎试剂灵敏度改变或质量不符合要求，会影响试验结果，所以试验前应复核鲎试剂产品灵敏果，所以试验前应复核鲎试剂产品灵敏2、试验器具洁净度不符合要求、试验器具洁净度不符合要求 普通用硫酸清洁液浸泡，用自来水冲洗洁净，再用新普通用硫酸清洁液浸泡，用自来水冲洗洁净，再用新鲜蒸馏水冲洗三道，并干热（鲜蒸馏水冲洗三道，并干热（250）恒温）恒温1h即可。即可。试验用玻璃器具必须严格无菌无热原，提议不要使用试验用玻璃器具必须严格无菌无热原，提议不要使用一次性塑料制品。一次性塑料制品。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第35页页3、试验条件达不到要求、试验条件达不到要求 试验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室，试验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室，应备有一台超净工作台。应备有一台超净工作台。4、温度不符合要求、温度不符合要求 试验室温度为试验室温度为252很好，恒温水浴箱温度为很好，恒温水浴箱温度为371为宜为宜。5、忽略样品本身干扰、忽略样品本身干扰 浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第36页页 供试品若经干扰试验证实存在干扰原因，可采供试品若经干扰试验证实存在干扰原因，可采取适宜方法来消除干扰。消除干扰一个主要标准是取适宜方法来消除干扰。消除干扰一个主要标准是不能影响供试品中内毒素生物活性不能影响供试品中内毒素生物活性。(1).(1).供试品稀释法供试品稀释法 MVD=CL/MVD=CL/鲎试剂灵敏度鲎试剂灵敏度()()越高越高(数值越小数值越小)，供试品稀释倍，供试品稀释倍数数越大，干扰越小。越大，干扰越小。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第37页页 (2).(2).物理方法物理方法 如加热法如加热法(血液制品血液制品)、冷析法、冷析法(甘露醇甘露醇 )(3).(3).化学方法化学方法 如调整如调整PHPH值值(奎诺酮类奎诺酮类)、调整金属离子、调整金属离子(血液保养血液保养液、液、FDP)FDP)(4).(4).生物方法生物方法 如抗增液使用，阻断如抗增液使用，阻断G G因子反应，预防假阳性；因子反应，预防假阳性；(5).(5).其它方法其它方法 如过滤法、溶剂抽提等如过滤法、溶剂抽提等 浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第38页页6 6、鲎试剂浓度达不到要求、鲎试剂浓度达不到要求 开开启启内内毒毒素素标标准准品品和和鲎鲎试试剂剂时时，要要将将粘粘附附在在安安瓿瓿壁壁上上粉粉末末尽尽可可能能地地弹弹落落下下去去。用用砂砂轮轮划划过过安安瓿瓿后后，要要用用酒酒精精棉棉（最最好好能能用用沾沾异异丙丙醇醇无无纺纺布布，以以防防止止产产生生假假阳阳性性结结果果）擦擦拭拭，预预防防开开启启时时玻玻璃璃屑屑落落入入安安瓿瓿内内。开开启启内内毒毒素素标标准准品品时时，要要在在安安瓿瓿曲曲颈颈上上部部，并并尽尽可可能能保保留留较较长长安安瓿瓿颈颈，准准确加入确加入1.0ml1.0ml鲎试验用水复溶。鲎试验用水复溶。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第39页页7 7、细菌内毒素混合不均匀、细菌内毒素混合不均匀（1 1）.内毒素工作标准品溶解后要在旋涡混合器混合内毒素工作标准品溶解后要在旋涡混合器混合1515分钟，以后每一步稀释前要最少混合分钟，以后每一步稀释前要最少混合3030秒，秒，其它国家药典也有类似要求；其它国家药典也有类似要求；（2 2）.含有两极活性内毒素分子在水中展现不均匀含有两极活性内毒素分子在水中展现不均匀分布。不按要求进行旋涡混合器混合会使所稀释内分布。不按要求进行旋涡混合器混合会使所稀释内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照不凝等不正确试验结果。不凝等不正确试验结果。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第40页页振荡前振荡前振荡后振荡后内毒素分子在水溶液中状态内毒素分子在水溶液中状态浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第41页页8 8、对灵敏度标示值误解、对灵敏度标示值误解 如如=0.06EU/ml=0.06EU/ml，实实 际际 上上 表表 示示 灵灵 敏敏 度度=0.0625EU/ml=0.0625EU/ml，这这么么写写是是为为了了简简便便。稀稀释释过过程程中中一一定定要要按按照照=0.0625EU/ml=0.0625EU/ml来来稀稀释释，不然，会对试验结果有影响。不然，会对试验结果有影响。9 9、保温过程中受到振动、保温过程中受到振动 在在 保保 温温 过过 程程 中中 要要 注注 意意 不不 要要 振振 动动，以以 免免 因因 振振 动造成假阴性结果。动造成假阴性结果。浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第42页页浅析细菌内毒素检测方法和常见问题浅析细菌内毒素检测方法和常见问题第第43页页