生物制药酶工程和手性药物专家讲座.pptx

第三章手性与手性药品第三章手性与手性药品生物制药酶工程和手性药物第1页手性是自然界基本属性手性是自然界基本属性宇宙宇宙是非对称，假如把组成太阳系全部物体置于是非对称，假如把组成太阳系全部物体置于一面跟伴随它们镜子面前，镜子中影像不能和实一面跟伴随它们镜子面前，镜子中影像不能和实体重合。体重合。生命由非对称作用所主宰。我能预生命由非对称作用所主宰。我能预见，全部生物物种在其结构上、在其外部形态上，见，全部生物物种在其结构上、在其外部形态上，究其根源都是宇宙非对称性产物。究其根源都是宇宙非对称性产物。LouisPasteur法国化学家巴斯顿法国化学家巴斯顿生物制药酶工程和手性药物第2页3手性手性(Chirality)：自然界基本属性自然界基本属性 组成生命活动基本化学物质是组成生命活动基本化学物质是组成生命活动基本化学物质是组成生命活动基本化学物质是手性化合物！手性化合物！手性化合物！手性化合物！手性药品：一把钥匙开一把锁！手性药品：一把钥匙开一把锁！1.1.氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸-蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质2.2.糖糖糖糖-多糖多糖多糖多糖3.3.核酸核酸核酸核酸-DNA-DNA 2/32/3以上开发中药品为手性以上开发中药品为手性以上开发中药品为手性以上开发中药品为手性 市场上市场上市场上市场上40%40%手性药品为单一异构体手性药品为单一异构体手性药品为单一异构体手性药品为单一异构体 年全球手性药品市场年全球手性药品市场年全球手性药品市场年全球手性药品市场15901590亿美元亿美元亿美元亿美元生物制药酶工程和手性药物第3页手性手性(chirality)这个词起这个词起源于希腊字源于希腊字“手手”(cheir)。手是手性手是手性右手与左手右手与左手成镜像。成镜像。手性手性是三维物体基本属是三维物体基本属性。假如一个物体不能性。假如一个物体不能与其镜像重合，该物体与其镜像重合，该物体就称为手性物体。就称为手性物体。手手性性生物制药酶工程和手性药物第4页从从天文学天文学到到地球科学地球科学，从，从化化学学到到生物学生物学，几乎处处都有，几乎处处都有手性显身影。手性显身影。生物制药酶工程和手性药物第5页太阳系太阳系全部天体全部天体（包含小行星）（包含小行星）都是按照都是按照右旋右旋方方向旋转，称为向旋转，称为右右手定则手定则。生物制药酶工程和手性药物第6页年年8月发生于大西月发生于大西洋阿尔贝托飓风，洋阿尔贝托飓风，其螺旋含有手性其螺旋含有手性特征。特征。生物制药酶工程和手性药物第7页在在植物植物学中，手性也是一个学中，手性也是一个主要形态特征。绝大部分攀主要形态特征。绝大部分攀缘植物是沿着主干往缘植物是沿着主干往右缠绕右缠绕，但也有少部分是往左缠绕，但也有少部分是往左缠绕，如香忍冬。如香忍冬。左手性紫藤左手性紫藤右手性多花紫藤右手性多花紫藤生物制药酶工程和手性药物第8页生物制药酶工程和手性药物第9页长瓣兜兰长瓣兜兰：花两侧长瓣螺旋是左右对称，：花两侧长瓣螺旋是左右对称，右侧是左旋，左侧是右旋右侧是左旋，左侧是右旋科学,Vol.54,No.55生物制药酶工程和手性药物第10页年年6月月13日，英国日，英国自然自然周刊发表周刊发表加拿大科学家杰森（加拿大科学家杰森（L.Jesson）和巴）和巴雷特（雷特（S.Barrett）研究某植物花柱手）研究某植物花柱手性论文，指出性论文，指出两个等位基因中一个控两个等位基因中一个控制花柱左右，制花柱左右，其中其中向右是显性。向右是显性。生物制药酶工程和手性药物第11页12即即使使产产生生这这种种手手性性确确实实切切机机理理、起起源源和和过过程程仍仍是是科科学学上上未未解解之之谜谜，但但有有一一点点是是明明确确：这这些些分分子子作作用以至于生命过程均与手性相关。用以至于生命过程均与手性相关。对对映映体体不不一一样样生生理理性性质质是是因因为为它它们们分分子子立立体体结结构构在在生生物物体体内内引引发发不不一一样样分分子子识识别别造造成成这这个个现现象象称称为为“手手性性识识别别”。这这种种识识别别可可比比喻喻为为手手与与手手套套关关系系，右右手手能能套套进进右右手手套套，而左手就套而左手就套不进右手套。不进右手套。手套与左右手相互关系手套与左右手相互关系手套与左右手相互关系手套与左右手相互关系生物制药酶工程和手性药物第12页有机分子手征性发觉有机分子手征性发觉1848年，法国化学家巴斯顿年，法国化学家巴斯顿（L.Pasteur,18221895）发觉酒石酸两种不一样存在发觉酒石酸两种不一样存在形式：形式：左旋左旋酒石酸酒石酸右旋右旋酒石酸酒石酸图：巴斯顿把酒石酸晶体分图：巴斯顿把酒石酸晶体分开成两个镜像异构体开成两个镜像异构体生物制药酶工程和手性药物第13页DNA在生命产生、演变、进化这么漫长过在生命产生、演变、进化这么漫长过程中，自然界造就了许多分子，手性程中，自然界造就了许多分子，手性分子占去了很大百分比。组成蛋白质分子占去了很大百分比。组成蛋白质氨基酸都是氨基酸都是 L L 型氨基酸，多糖和核酸型氨基酸，多糖和核酸单糖是单糖是 D D 型糖。人们甚至发觉，型糖。人们甚至发觉，19691969年坠落在澳大利亚默奇森陨石中氨基年坠落在澳大利亚默奇森陨石中氨基酸也主要是酸也主要是L L 型。型。生物分子手性同一性生物分子手性同一性生物制药酶工程和手性药物第14页15年诺贝尔奖：年诺贝尔奖：不对称催化不对称催化从试验室到工厂（从试验室到工厂（从试验室到工厂（从试验室到工厂（19841984）生物制药酶工程和手性药物第15页孟山都企业孟山都企业L-L-多巴生产工艺多巴生产工艺第一例工业化成功催化不对称反应（第一例工业化成功催化不对称反应（19701970S S）治疗帕金森病治疗帕金森病生物制药酶工程和手性药物第16页(S)-Metolachlor(Novatis,1996)不对称合成最大工业化例子（不对称合成最大工业化例子（10,000吨吨/年）年）materialamountMEA-imine10,000KgIr(COD)Cl2234gLigand68gNaI92gH2SO4250gH.U.Blaser,ASC,344,17除草剂除草剂生物制药酶工程和手性药物第17页九寨风光水相不对称催化反应水相不对称催化反应生物制药酶工程和手性药物第18页生物催化反应生物催化反应生物制药酶工程和手性药物第19页酶催化酶催化生物制药酶工程和手性药物第20页树状分子酶树状分子酶Dendrizyme外层区外层区内层区内层区核核心心生物制药酶工程和手性药物第21页22已用于工业不对称催化反应生物制药酶工程和手性药物第22页取得手性化合物不一样路径取得手性化合物不一样路径拆分拆分和和或或或或手性池手性池前手性前手性化合物化合物天然手性天然手性化合物化合物消旋消旋化合物化合物催化不对称合成催化不对称合成生物制药酶工程和手性药物第23页24手性与手性药品化合物活性关系以及表手性与手性药品化合物活性关系以及表手性与手性药品化合物活性关系以及表手性与手性药品化合物活性关系以及表现出错综复杂药代动力学现出错综复杂药代动力学现出错综复杂药代动力学现出错综复杂药代动力学和药效学特征和药效学特征和药效学特征和药效学特征在许多情况下，化合物一对对映体在生物体内药理活性、代谢过程、代在许多情况下，化合物一对对映体在生物体内药理活性、代谢过程、代谢速率及毒性等存在显著差异。谢速率及毒性等存在显著差异。使用单一对映体必要性使用单一对映体必要性(1)只有一个对映体含有所要求药理活性，只有一个对映体含有所要求药理活性，(+)或或(+)而另一个对映体则没有显著药理作用；而另一个对映体则没有显著药理作用；(2)一对对映体中两个化合物都有等同或一对对映体中两个化合物都有等同或(-)近乎等同定性和定量药理活性；近乎等同定性和定量药理活性；(3)两种对映体含有定量上等同，但定性上不一样活性；两种对映体含有定量上等同，但定性上不一样活性；(+)或或(+)(4)各种对映体含有定量上不一样活性；各种对映体含有定量上不一样活性；(+)或或(-)人体手性环境和特异对映体相互作用，造成手性药品对映体药代动力人体手性环境和特异对映体相互作用，造成手性药品对映体药代动力学和药效学立体选择性学和药效学立体选择性(stereoselectivity)差异，使临床应用手性药品出现差异，使临床应用手性药品出现复杂性。复杂性。1.吸收吸收2.分布分布3.代谢代谢4.排泄排泄生物制药酶工程和手性药物第24页25这这种种差差异异例例子子很很多多。治治疗疗哮哮喘喘病病沙沙丁丁胺胺醇醇就就是是一一例例。它它有有效效对对映映体体药药理理活活性性要要比比另另一一对对映映体体大大80倍倍。又又比比如如，L-多多巴巴是是治治疗疗帕帕金金森森症症药药品品，作作为为“前前药药”摄摄入入病病人人体体内内，再再由由体体内内酶酶将将多多巴巴转转化化为为含含有有药药理理作作用用多多巴巴胺胺。因因为为人人体体内内酶酶对对该该“前前药药”多多巴巴是是专专一一性性，只只有有左左旋旋L-多多巴巴胺胺被被酶酶所所转转化化，所所以以，服服用用消消旋旋多多巴巴话话，右右旋旋多多巴巴不不被被酶酶所所转转化化，日日积积月月累累在在人人体体内内沉沉淀淀下下来来，势势必必对对病病人人造造成成新新危危害害。假假如如手手性性药药品品两两个个对对映映体体药药理理活活性性相相当当，它它们们毒毒副副作作用用无无差差异异，那就没有必要服用单一对映体药了。那就没有必要服用单一对映体药了。(-)-(R)-沙丁胺醇沙丁胺醇(-)-L-多巴多巴盖替沙星盖替沙星生物制药酶工程和手性药物第25页26(Timolol)是是已已知知作作用用最最强强b b-肾肾上上腺腺素素受受体体阻阻断断剂剂，作作用用强强度度为为普普萘萘洛洛尔尔(propranolol)8倍倍，临临床床用用于于治治疗疗高高血血压压、心心绞绞痛痛、青青光光眼眼等等。尤尤其其对对于于原原发发性性开开角角型型青青光光眼眼有有良良好好效效果果，优优于于传传统统降降眼眼压压药药。当当前前临临床床使使用用是是(S)-(-)-Timolo对对映映体体滴滴眼眼液液，对对于于哮哮喘喘病病人人禁禁用用，长长久久连连续续使使用用则则会会引引发发较较为为严严重重副副作作用用甚甚至至致致命命。(R)-(+)-Timolo对对映映体体在在动动物物试试验验上上其其对对b b-肾肾上上腺腺素素受受体体阻阻断断作作用用小小于于(S)-(-)-Timolol对对映映体体，不不过过在在降降低低眼眼压压方方面面其其作作用用降降低低不不多多。(S)-(-)-Timolol对对映映体体b b2受受体体阻阻断断作作用用是是(R)-(+)-Timolol对对映映体体49倍倍，其其收收缩缩支支气气管管作作用用是是(R)-(+)-Timolol对对映映体体13倍倍，但但其其降降低低眼眼压压作作用用仅仅为为(R)-(+)-Timolol对对映映体体4倍倍。因因而而(R)-(+)-Timolol对对映映体体有有可可能能成成为为比比(S)-(-)-Timolol更更为为安安全全、更更少少全全身身副副作作用用治治疗疗青青光光眼手性药品。眼手性药品。(R)-(+)-Timolol(S)-(-)-Timolol生物制药酶工程和手性药物第26页27(S)-普萘洛尔普萘洛尔,98倍倍(S)-萘普生萘普生,35倍倍(S)-奥美拉唑奥美拉唑L-多巴多巴右异环磷酰胺右异环磷酰胺(dexifosfamide)盖替沙星盖替沙星抗肿瘤药抗肿瘤药生物制药酶工程和手性药物第27页28盐酸舍曲林盐酸舍曲林(-)-酒石酸左啡诺酒石酸左啡诺右旋雷佐生右旋雷佐生(镇痛剂，比吗啡强镇痛剂，比吗啡强5倍倍)(减轻毒副作用减轻毒副作用)(+)(1R,3S)(-)(1S,3R)Azasetron罗格列酮罗格列酮30倍倍(5HTa受体拮抗剂受体拮抗剂)Tetrahedron Lett.,43,4951生物制药酶工程和手性药物第28页生物制药酶工程和手性药物第29页30手性药品政策与市场情况手性药品政策与市场情况手性药品政策与市场情况手性药品政策与市场情况近近年年来来许许多多国国家家药药政政部部门门对对手手性性药药品品开开发发、专专利利申申请请及及注注册册，开开始始作作出出对对应应要要求求。美美国国食食品品与与药药品品管管理理局局(FDA)在在1992年年政政策策要要求求：对对于于含含有有手手性性原原因因药药品品倾倾向向于于发发展展单单一一对对映映体体产产品品。随随即即又又表表示示勉勉励励把把已已在在销销售售外外消消旋旋药药品品转转化化为为手手性性药药品品称称为为“手手性性转转换换”；对对于于申申请请新新外外消消旋旋药药品品，则则要要求求对对两个对映体都必须提供详细生理活性和毒理数据，而不得作为相同物质对待。两个对映体都必须提供详细生理活性和毒理数据，而不得作为相同物质对待。据据美美国国C&EN刊刊物物在在1999年年报报道道，全全球球单单一一对对映映体体药药品品依依然然连连续续增增加加，年年销销售售亿亿到到达达964亿亿美美元元。到到年年，年年销销售售额额已已突突破破1300亿亿美美元元。按按1998年年统统计计。全全球球最最畅畅销销500种种药药中中，以以单单一一异异构构体体销销售售手手性性药药品品占占二二分分之之一一以以上上，占其总销售额占其总销售额52%。生物制药酶工程和手性药物第30页31手性药品带来市场效益及增加需求手性药品带来市场效益及增加需求手性药品带来市场效益及增加需求手性药品带来市场效益及增加需求年年手性药品销售手性药品销售1472亿美元亿美元年年手性药品销售手性药品销售1320亿美元，比亿美元，比1999年增加年增加13%1999年年手性药品销售手性药品销售1170亿美元亿美元1997年年 手性药品销售手性药品销售910亿美元，亿美元，比比1996年增加年增加21%1993年年 手性药品销售手性药品销售356亿美元，亿美元，比比1992年增加年增加22%1990年年 手性药品销售手性药品销售180亿美元亿美元1997年全世界年全世界100个热销药品中，个热销药品中，50个是单一对映体个是单一对映体(手性药品手性药品)100个热销药品个热销药品852亿美元亿美元50个手性药品个手性药品428亿美元亿美元而在而在1993年年97个热销药中，手性药品占个热销药中，手性药品占20%生物制药酶工程和手性药物第31页生物制药酶工程和手性药物第32页手性药品研究意义1临床药品1850种天然和半合成药品523种化学合成药品1327种非手性6种手性517种非手性799种手性528种以单个对映体给药509种以外消旋体给药8种以单个对映体给药61种以外消旋体给药467种生物制药酶工程和手性药物第33页反应停反应停:五十年恩怨五十年恩怨(R)-thalidomide(S)-thalidomide手性与人类健康手性与人类健康:“反应停反应停”悲剧悲剧生物制药酶工程和手性药物第34页沙利度胺沙利度胺S-异构体可造成严重致畸性异构体可造成严重致畸性1957年年1962年，造成数年，造成数万名婴儿严重畸形。万名婴儿严重畸形。深入研究表明，其致畸作深入研究表明，其致畸作用是由沙利度胺其中一个用是由沙利度胺其中一个异构体（异构体（S-异构体异构体）引发，）引发，而而R-构型即使大剂量使用，构型即使大剂量使用，也不会引发致畸作用。也不会引发致畸作用。图：沙利度胺另一个对映体可图：沙利度胺另一个对映体可造成造成严重致畸性。严重致畸性。生物制药酶工程和手性药物第35页“苦苦”“甜甜”生物制药酶工程和手性药物第36页药品手性原因1手性四面体手性碳手性硫手性叔胺生物制药酶工程和手性药物第37页药品手性原因2取代丙二烯类手性轴环芳香类手性平面取代联苯手性轴生物制药酶工程和手性药物第38页杀虫剂棉酚（Gossypol）及其对映体因分子中两个萘环之间存在阻转异构现象，含有手性轴，有左、右旋对映体。生物制药酶工程和手性药物第39页药品手性原因3l螺旋手性（Spiral Chirality）：左手螺旋和右手螺旋因旋转方向不一样，不能重合在一起。非平面性环状化合物能够认为是螺旋一部分，因而产生对映体。生物制药酶工程和手性药物第40页1,4-Benzodiazepines P螺旋 M螺旋 因为C2C3N4C5扭角方向不一样，为正角和负角，分别用P（plus）和M（minus）表示。虽为手性分子，但两种构象相互转变能垒不高，在室温下能够相互转化，故不表现光学活性。生物制药酶工程和手性药物第41页2.2手性药品表示方法1l左旋体和右旋体能使偏振光偏振面按顺时针方向旋转对映体称为右旋体（dextrotatory），在药名前用d或(+)表示；反之，称为左旋体（levorotatory），在药名前加l或()表示。外消旋体（racemate）则是由等量左旋体和右旋体组成，没有旋光性，在其药名前用dl或()表示。这种表示方法，直观地反应了对映体之间光学活性差异，不过不能提供药品分子三维空间排列或绝对构型信息。生物制药酶工程和手性药物第42页2.2手性药品表示方法2lD和L系统以标准参考物化学相关性来确定药品立体化学构型。标准参考物有糖类如D甘油醛，氨基酸如L丝氨酸。在RRXHC型光学异构体中，取其主链竖向排列，以氧化态较高或1号碳原子置于上方，照Fisher投影，在所得投影式中X在右边者称为D型，如D(+)甘油醛；X在左边者称为L型，如L()甘油醛；外消旋体表示为DL甘油醛。生物制药酶工程和手性药物第43页2.2手性药品表示方法2lD和L系统因为D/L构型表示法与表示旋光方向d和l轻易混同，且意义不甚明确，当前多限于糖和氨基酸立体化学命名。生物制药酶工程和手性药物第44页2.2手性药品表示方法3lR和S系统将手性中心取代基按原子序数依次排列，abcd，把d作为手性碳原子顶端，a、b、c为四面体底部3个角，从底部向顶端方向看，若保持从大到小基团按顺时针方向排列者，称为R型，若为逆时针方向排列者，称为S型。生物制药酶工程和手性药物第45页沙立度胺（Thalidomide）事件l在20世纪60年代出现沙立度胺事件，成为药学史上沉痛教训。lR(+)和S()沙立度胺都有镇静作用，可用于缓解妊娠妇女晨吐反应，因而我国仿制时将其称为“反应停”。S()沙立度胺还有免疫抑制活性。l无数妇女服用了消旋药品，减轻了反应，但随即产下了数千例畸胎。生物制药酶工程和手性药物第46页沙利度胺（Thalidomide）-天使还是魔鬼？俗名俗名“反应停反应停”，早期作为，早期作为怀孕妇女止呕药使用怀孕妇女止呕药使用R-(+)-R-(+)-沙利度胺为镇静止呕药沙利度胺为镇静止呕药S-(-)-S-(-)-沙利度胺有致畸作用沙利度胺有致畸作用50年代末，在欧洲出现数千例短肢年代末，在欧洲出现数千例短肢畸胎新生儿，一度震惊全世界畸胎新生儿，一度震惊全世界生物制药酶工程和手性药物第47页多效唑（paclobutrazol）-杀菌还是助长？(2R,3R)-(+)-杀真菌剂杀真菌剂(2S,3S)-(-)-植物增加剂植物增加剂问题问题：假如只需要杀死真菌，为何也要：假如只需要杀死真菌，为何也要喷洒植物生长剂呢？喷洒植物生长剂呢？生物制药酶工程和手性药物第48页掺假食品和饮料判别-手性选择指纹图分析氨基酸能够判别掺假果汁分析氨基酸能够判别掺假果汁比氨基酸更特殊标识物：苹果酸，乳酸酯、酒石比氨基酸更特殊标识物：苹果酸，乳酸酯、酒石酸和丁二醇酸和丁二醇原料中手性选择指纹图即能够判别原料中手性选择指纹图即能够判别“原产地原产地”，也使掺假产品难于蒙混过关也使掺假产品难于蒙混过关生物制药酶工程和手性药物第49页手性分离和分析主要性手性分离和分析主要性 获取单一对映体化合物获取单一对映体化合物 对对于于包包括括分分子子手手性性分分析析领领域域要要采采取取高高对对映映体选择性分析方法体选择性分析方法手性分离特殊性手性分离特殊性在在非非手手性性环环境境中中，对对映映体体物物理理化化学学性性质质（如如熔熔点点、沸沸点点、折折射射率率、蒸蒸气气压压、溶溶解解度度、红红外外、核核磁磁谱谱和和质质谱等）大都相同，这就造成对映体分离困难。谱等）大都相同，这就造成对映体分离困难。生物制药酶工程和手性药物第50页2 2 取得单一对映体路径取得单一对映体路径手性源手性源(chiralpool)合成合成前手性前手性底物底物不对称不对称合成合成外消外消旋体旋体拆分拆分预防预防“外消旋外消旋化化”“立体选择性立体选择性”反应，如手反应，如手性催化、手性诱导、生物催性催化、手性诱导、生物催化化结晶法结晶法衍生法衍生法酶法酶法色谱法色谱法生物制药酶工程和手性药物第51页 天天然然手手性性库库：从从自自然然界界存存在在光光活活性性化化合合物物提提取取得得到到，如如氨氨基基酸酸、羟羟基基酸酸、糖糖、生生物物碱碱和和萜萜类类等等为为原原料料，采采取取保保持持原原构构型型、转转化化或或手手性性转转换换等等方方法法合合成成手性化合物手性化合物不不对对称称合合成成：采采取取手手性性辅辅助助基基、手手性性配配体体、手性催化剂对前手性底物进行选择性反应手性催化剂对前手性底物进行选择性反应外外消消旋旋体体拆拆分分：常常规规合合成成方方法法得得到到外外消消旋旋体体产物，怎样将它们深入分离产物，怎样将它们深入分离生物制药酶工程和手性药物第52页3 3外消旋体拆分方法外消旋体拆分方法 等等量量对对映映体体混混合合物物，其其旋旋光光性性相相互互抵抵消消，没没有有旋旋光光能能力力，称称为为外外消消旋旋体体。将将外外消消旋旋体体分分为为对对映映体体过过程程，叫叫做做对对映映体体拆拆分分（resolution）。广广义义地地讲讲，对对不不等等量对映体混合物进行分离，也属于对映体拆分范围。量对映体混合物进行分离，也属于对映体拆分范围。生物制药酶工程和手性药物第53页接种晶体拆分法接种晶体拆分法 在在一一个个外外消消旋旋混混合合物物热热饱饱和和溶溶液液中中加加入入其其中中一一个个纯纯对对映映体体晶晶种种，然然后后冷冷却却，则则同同种种对对映映体体将将附附在在晶晶体体上析出；上析出；滤滤去去晶晶体体后后，母母液液重重新新加加热热，并并补补加加外外消消旋旋体体使使之之到达饱和，冷却使另一对映体析出。到达饱和，冷却使另一对映体析出。这么交替进行，可方便地取得大量纯对映体结晶。这么交替进行，可方便地取得大量纯对映体结晶。在在没没有有纯纯对对映映体体晶晶种种情情况况下下，有有时时用用结结构构相相同同其其它它手手性性化化合合物物（有有时时甚甚至至非非手手性性化化合合物物）作作晶晶种种，也也能能取得成功。取得成功。（为何？）（为何？）晶体形成时有规律定向排列，可能自然形成一手性环境。晶体形成时有规律定向排列，可能自然形成一手性环境。生物制药酶工程和手性药物第54页D,LD,LD,LD,L氯霉素母体氨基醇结晶拆分示意图氯霉素母体氨基醇结晶拆分示意图氯霉素母体氨基醇结晶拆分示意图氯霉素母体氨基醇结晶拆分示意图 D,L氨基醇水溶液D氨基醇，80冷至20D氨基醇晶体母液80浓缩冷至20L氨基醇晶体母液生物制药酶工程和手性药物第55页3.2 3.2 生物拆分法生物拆分法生生物物酶酶、微微生生物物、细细菌菌等等生生物物源源含含有有非非常常专专一一反反应应特特征征。利利用用酶酶能能够够选选择择性性地地使使外外消消旋旋体体中中一一个个对对映映体体发发生生反反应应，如如降降解解，从从而而到到达达拆拆分分目目标标。所所以以，这这一一方法也称为方法也称为“生物化学拆分法生物化学拆分法”。1858年年，Pasteur就就观观察察到到：外外消消旋旋酒酒石石酸酸在在酵酵母母或或青青霉霉存存在在下下进进行行发发酵酵，天天然然（+）-酒酒石石酸酸铵铵逐逐步步被被消消耗耗，而而经经过过一一段段时时间间之之后后，从从发发酵酵液液中中分分离离出出纯纯（-）-酒酒石石酸酸铵铵。这这是是微微生生物物代代谢谢了了天天然然（+）-酒酒石石酸，而留下了（酸，而留下了（-）-酒石酸。酒石酸。生物制药酶工程和手性药物第56页图图图图5D,L5D,L苯基甘氨酸外消旋体酶拆分苯基甘氨酸外消旋体酶拆分苯基甘氨酸外消旋体酶拆分苯基甘氨酸外消旋体酶拆分 生物拆分特点生物拆分特点：立体专一性强、拆分效率高和生产条件：立体专一性强、拆分效率高和生产条件温和。当前，温和。当前，酶法拆分已从水溶液向有机介质发展酶法拆分已从水溶液向有机介质发展。D,L苯基甘氨酸(PG)(CH3C)2OOD,L乙酰PGL氨肽酶LPGD乙酰PG水解/H +DPGD,LPGH2SO4/加热(外消旋化)生物制药酶工程和手性药物第57页用用微微生生物物酶酶拆拆分分外外消消旋旋体体，比比化化学学拆拆分分法法含含有有显显著著优越性：优越性：（1）酶催化反应通常含有高度立体专一性；）酶催化反应通常含有高度立体专一性；（2）副反应少，产率高，产品分离提纯简单；）副反应少，产率高，产品分离提纯简单；（3）反应条件较温和，如）反应条件较温和，如050，pH靠近中性；靠近中性；（4）酶酶无无毒毒，易易降降解解，不不会会造造成成环环境境污污染染，适适于于规规模模生产。生产。用用酶酶拆拆分分外外消消旋旋体体氨氨基基酸酸尤尤其其主主要要。因因为为多多数数合合成成氨氨基基酸酸消消旋旋体体不不易易用用化化学学方方法法拆拆分分，而而酶酶法法拆拆分分却却非非常有效，可用于制备旋光性氨基酸。常有效，可用于制备旋光性氨基酸。生物制药酶工程和手性药物第58页3.4色谱拆分法色谱拆分法怎怎样样取取得得高高对对映映体体纯纯手手性性物物质质在在许许多多领领域域都都是是很很主主要要。色色谱谱法法不不但但是是对对映映体体分分析析和和纯纯度度测测定定有有力力工工具具，而且液相色谱拆分法还是制备和纯化主要伎俩。而且液相色谱拆分法还是制备和纯化主要伎俩。历历史史上上，曾曾采采取取一一些些天天然然手手性性吸吸附附剂剂，如如淀淀粉粉、蔗蔗糖糖、羊羊毛毛等等成成功功拆拆分分一一些些外外消消旋旋体体。当当代代制制备备色色谱谱在在拆拆分分外外消消旋旋体体方方面面更更是是发发挥挥更更大大作作用用。如如选选取取拆拆分分能能力力很很强强手手性性固固定定相相填填充充剂剂，用用大大柱柱子子，一一次次已已能能拆拆分分几十克量外消旋体，并到达几十克量外消旋体，并到达99%旋光纯度。旋光纯度。生物制药酶工程和手性药物第59页4 4 高效手性分离技术色色谱谱法法和和电电泳泳法法是是一一类类高高效效分分离离方方法法，但但常常规规色色谱谱/电电泳泳方方法法仍仍不不能能直直接接分分离离对对映映体体。（为何？）（为何？）因因为为在在非非手手性性环环境境中中，对对映映体体分分离离性性质质（如如沸沸点点、蒸蒸气气压压、溶溶解解度度、分分配配系系数数、吸吸附附特特征征以及淌度）完全相同。以及淌度）完全相同。怎怎样样利利用用高高效效色色谱谱和和毛毛细细管管电电泳泳分分离离分分析析对对映体化合物？映体化合物？热力学热力学/分离性质上差异分离性质上差异生物制药酶工程和手性药物第60页4.2 4.2 手性分离原理手性分离原理1）手性试剂衍生法手性试剂衍生法手手性性消消除除采采取取柱柱前前衍衍生生技技术术，即即用用光光学学纯纯手手性性试试剂剂，将将对对映映体体衍衍生生成成非非对对映映体体复复合合物物，这这些些非非对对映映体体复复合合物含有不一样理化性质，便能使用常规色谱技术分离。物含有不一样理化性质，便能使用常规色谱技术分离。其其优优点点是是可可将将手手性性消消除除和和检检测测衍衍生生反反应应结结合合起起来来。除了满足普通色谱衍生要求条件外，还要注意：除了满足普通色谱衍生要求条件外，还要注意：所用所用衍生剂衍生剂应尽可能到达应尽可能到达对映体纯对映体纯；衍生剂衍生剂不能选择性不能选择性地与两种基质对映体反应；地与两种基质对映体反应；生成份离性大稳定非对映体。生成份离性大稳定非对映体。生物制药酶工程和手性药物第61页衍衍生生后后两两种种非非对对映映体体检检测测器器响响应应可可能能不不一一样样，不不宜宜按归一化计算对映体纯度。按归一化计算对映体纯度。手手性性试试剂剂衍衍生生位位置置应应靠靠近近对对映映体体样样品品手手性性中中心心，以以求求取取得得最最大大分分离离效效果果。过过大大衍衍生生试试剂剂可可能能会会缩小样品理化性质差异，造成份离困难。缩小样品理化性质差异，造成份离困难。作作制制备备用用手手性性衍衍生生剂剂要要求求它它衍衍生生化化和和去去衍衍生生化化反反应应都都轻轻易易进进行行，且且总总收收率率要要高高，生生成成非非对对映映体体含含有有更更大大分离性（有利于提升制备量）。分离性（有利于提升制备量）。生物制药酶工程和手性药物第62页 比比如如将将氰氰醇醇衍衍生生成成Mosher酯酯后后，可可用用GC或或HPLC进进行行分分离离测测定定。苯苯乙乙醇醇氰氰Mosher酯酯可可用用毛毛细细管管气气相相色色谱谱（DurabondDB-5，0.330m柱柱)分分离离测测定定：而而4-甲甲氧氧基基苯苯乙乙醇醇氰氰Mosher酯酯可可用用高高效效液液相相色色谱谱（Nucleosil100-5柱）分析。柱）分析。外消旋样品外消旋样品手性衍生剂手性衍生剂非对映体，挥发性非对映体，挥发性和吸附特征有差异和吸附特征有差异()A()B/(+)A()B生物制药酶工程和手性药物第63页2)2)手性色谱手性色谱手性色谱手性色谱手性色谱原理手性色谱原理是经过待拆分对映体与手性固是经过待拆分对映体与手性固定相之间定相之间瞬间可逆相互作用瞬间可逆相互作用，依据形成瞬间缔，依据形成瞬间缔合物难易程度和稳定程度，经过屡次质量交换合物难易程度和稳定程度，经过屡次质量交换后，到达对映体间分离。后，到达对映体间分离。近年来，高效手性分离技术发展，造成与有机立体化学相关近年来，高效手性分离技术发展，造成与有机立体化学相关手性药品学、分子生物学、材料化学、地球化学、天然有机化手性药品学、分子生物学、材料化学、地球化学、天然有机化学等前沿领域取得许多突破性发觉和发展。学等前沿领域取得许多突破性发觉和发展。衍生法：非对映体形成是衍生法：非对映体形成是“固定、永久固定、永久”假如设法把手性试剂引入固定相，外消假如设法把手性试剂引入固定相，外消旋体样品流过柱子是否会形成非对映体旋体样品流过柱子是否会形成非对映体？生物制药酶工程和手性药物第64页 与与手手性性衍衍生生法法色色谱谱分分析析不不一一样样，对对映映体体组组成成测测定定精精度度与与手手性性固固定定相相所所用用对对映映体体纯纯度度无无关关（固固定定相相对对映映体体纯度只影响拆分因子纯度只影响拆分因子大小）。大小）。手性色谱能够经过两种方式进行：手性色谱能够经过两种方式进行：手性固定相法手性固定相法手性添加剂法手性添加剂法手手性性拆拆分分原原理理包包含含主主-客客体体作作用用、络络合合作作用用、配配体体交交换换、相相分分离离、离离子子交交换换等等。关关键键是是分分子子手手性性识识别别作作用用，即即对对映映体体与与固固定定相相（或或添添加加剂剂）间相互作用包括到分子立体选择性。间相互作用包括到分子立体选择性。生物制药酶工程和手性药物第65页三点作用模型三点作用模型相互作用强，保相互作用强，保留长，后出峰留长，后出峰相互作用弱，保相互作用弱，保留短，先出峰留短，先出峰基体(S)选择子(R)溶质基体(S)溶质(S)选择子生物制药酶工程和手性药物第66页手手性性固固定定相相含含有有很很强强特特征征性性，一一个个固固定定相相往往往往只只能能拆分一类或几类对映体。拆分一类或几类对映体。手手性性色色谱谱另另一一个个特特点点是是将将Pirkle型型手手性性固固定定相相手手性性变成相反构型，可使对映体洗脱次序颠倒过来。变成相反构型，可使对映体洗脱次序颠倒过来。研研制制新新手手性性固固定定相相，处处理理不不一一样样类类型型手手性性化化合合物物分分离是手性色谱发展前沿领域。离是手性色谱发展前沿领域。过去过去100年：拆分约年：拆分约7000种手性化合物种手性化合物手性色谱：已拆分近万种手性化合物手性色谱：已拆分近万种手性化合物液相色谱中手性固定相已研制液相色谱中手性固定相已研制100各种各种生物制药酶工程和手性药物第67页手性添加剂法手性添加剂法 在在液液相相色色谱谱流流动动相相或或毛毛细细管管电电泳泳缓缓冲冲溶溶液液中中加加入入手手性性添添加加剂剂（CA），CA与与对对映映体体溶溶质质经经过过静静电电引引力力和和氢氢键键等等非非共共价价键键结结合合方方式式，形形成成可可逆逆不不一一样样稳稳定定性性非非对对映体配合物，在非手性分离器中实现对映异构体分离。映体配合物，在非手性分离器中实现对映异构体分离。手手性性添添加加剂剂是是一一个个直直接接拆拆分分法法，其其优优点点在在于于不不需需要要化化学学衍衍生生，也也不不需需要要特特殊殊手手性性固固定定相相。CA必必须须能能提提供供有有效效基基团团和和位位置置方方便便与与溶溶质质对对映映体体形形成成非非对对映映配配合合物物，也也必必须须含含有有适适当当结结构构以以改改进进分分离离性性能能和和提提升升其其立立体体选选择性。择性。常常见见CA可可分分为为手手性性对对离离子子添添加加剂剂、手手性性配配位位添添加加剂剂和环糊精添加剂。和环糊精添加剂。生物制药酶工程和手性药物第68页TLCTLC分离芳香醇胺对映体分离芳香醇胺对映体分离芳香醇胺对映体分离芳香醇胺对映体用用D-10-樟樟脑脑磺磺酸酸铵铵作作为为手手性性离离子子对对试试剂剂添添加加到到流流动动相相中中，在在普普通通GF254薄薄 层层 硅硅 胶胶 板板(2.510cm)24展展 开开，拆拆 分分 拉拉 贝贝 乐乐 尔尔(Labarol)和和倍倍他他乐乐克克(Batarock)两两种芳香醇胺药品对映体。种芳香醇胺药品对映体。(a)LabarolCH2Cl2-CH3OH(67:33)，含含D-樟脑磺酸铵樟脑磺酸铵6.8mmol/L(b)(b)Batarock CH2Cl2-CH3OH(60:40)，含含 D-樟樟 脑脑 磺磺 酸酸 铵铵 6.8mmol/L（李李高高兰兰等等，色色谱谱，1999，17：216）a.Labarol b.Batarock生物制药酶工程和手性药物第69页HPLCHPLC拆分氧氟沙星拆分氧氟沙星拆分氧氟沙星拆分氧氟沙星国国内内使使用用外外消消旋旋OFLOXCIN,OFLOXCIN,而而日日本本已已开开发发左左旋旋氧氟沙星（氧氟沙星（LEVOFLOXCINLEVOFLOXCIN）,商品名商品名CravitCravit。6 mmol/L lphen+CuSO4+15%CH3OH(pH3.5)，ShimPark PREP ODS(20mm25cm),4.6mL/min,293nm,0.5ml15g/L()OFLS()OFL R(+)OFL 若改用若改用d-phen,出峰次序可能发生逆转！出峰次序可能发生逆转！生物制药酶工程和手性药物第70页环糊精结构OHOHHO甲基化生物制药酶工程和手性药物第71页手性添加剂法拆分苯基琥珀酸手性添加剂法拆分苯基琥珀酸 15 mmol/LCD+3%CH3CN+0.05%CF3COOH()-PSA可采取光可采取光活性番木鳖碱或活性番木鳖碱或(-)-脯氨酸拆分脯氨酸拆分0.30 mmol/L TMCD+16%CH3CN+0.05%CF3COOHNova-pakC18色谱柱色谱柱生物制药酶工程和手性药物第72页4.3手性色谱技术手性色谱技术 气相色谱气相色谱 高效液相色谱高效液相色谱 毛细管电泳毛细管电泳 超临界色谱超临界色谱生物制药酶工程和手性药物第73页生物制药酶工程和手性药物第74页生物制药酶工程和手性药物第75页4.3.1 4.3.1 气相色谱气相色谱GC含含有有快快速速、灵灵敏敏、简简便便和和定定量量准准确确等等优优点点。手手性性GC尤尤其其适适合合于于不不对对称称合合成成样样品品分分析析。因因为为分分析析样样品品普普通通无无需需衍衍生生，反反应应产产物物可可直直接接进进样样分分析析，用用量量极极微（微（10-8g），尤其适合于跟踪不对称反应全过程。），尤其