生物催化和生物转化II公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件.pptx

水解反应v酶概念及其催化反应特点v酶催化与微生物催化差别v酶起源v酶分类v分子手性表示办法v分子手性与药物药理、药效和安全之间关系v酶催化反应过程v惯用酶及其催化反应类型和特点第1页第1页v水解酶(hydrolases，EC 3.x.x.x)是最惯用生物催化剂，占生物催化反应用酶65。它们能水解酯、酰胺、蛋白质、核酸、多糖、环氧化物和腈等化合物。生物催化水解反应类型如图81所表示，其中酯酶、脂肪酶和蛋白酶是生物催化手性合成中最惯用水解酶。第2页第2页第3页第3页第一节 水解反应机理和特点v酶催化底物水解反应机理与底物在碱性条件下化学水解反应机理很相同。v丝氨酸型水解酶活性中心Asp、His、Ser构成三联体，其中丝氨酸羟基作为亲核基团向底物酯或酰胺中羰基碳原子发起亲核攻打，形成酶-酰基中间体，见图8-2(a)：然后其它亲核试剂(水、胺、醇、过氧化氢等)攻打酶-酰基中间体，酶将酰基转移到酰基受体上，酶本身恢复原形，见图8-2(b)。第4页第4页第5页第5页v微生物脂肪酶(1ipases)在水解反应中使用较多，而猪肝酯酶(pig liver esterase,PLE)和马肝酯酶(horse liver esterase，HLE)使用相对较少，这些酶对羧酸酯含有高度立体选择性。v乙酰胆碱酯酶(acetylcholineesterase，ACE)对非天然酯水解表现出很高立体选择性，但是这种酶是从电鳗中分离纯化制备，价格昂贵，限制了它使用。第6页第6页v完整微生物细胞能高选择性地催化酯水解，但实现该反应条件复杂。一个来自微生物羧酸酯酶NP(carboxyl-esterase NP)已可用基因工程法表示制备，该酶能催化一些特殊结构酯高选择性水解。v许多蛋白酶同样能选择性水解羧酸酯，使用最多是-胰凝乳蛋白酶(-chymotrypsin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)。使用相对较少有胰蛋白酶(trypsin)、胃蛋白酶(pepsin)、木瓜蛋白酶(papain)和青霉素酰化酶(penicillin acylase)。第7页第7页第二节酯水解v一、酯结构类型v酯酶和蛋白酶催化底物酯按其结构特性分为I型酯和II型酯，它们结构特性见图8-3。第8页第8页第9页第9页vI型酯手性中心在羧酸部分，型酯手性中心在醇基部分。不论是I型酯还是型酯，酯酶和蛋白酶都要求底物分子中手性中心尽也许在水解反应位点附近，以确保其手性辨认。v猪肝酯酶(pig liver esterase,PLE)是惯用一个酯酶。这种酶成复杂，普通最少有5种同功酶组成，每一个同功酶又是由三个亚基组成。因为它们含有相同立体选择性，因此，这一粗酶混合物仍被视为是一个单纯酶，但最近也有一些关于它们差异性报道。第10页第10页vPLE选择性与酶起源和酶制备办法相关。对于有机合成反应来说普通采用酶丙酮粗提物，这种粗酶价格廉价、稳定性好。这是由于化学反应体系中普通为单一底物，故而对酶底物专一性要求不高。然而在生物体内由于细胞内存在大量底物和各种酶，因此要求酶含有高底物专一性。第11页第11页v从马肝中提取马肝酯酶(horse liver esterase，HLE)以及来自于鸡、豚鼠、大鼠、仓鼠酯酶底物专一性都不高。而兔肝酯酶底物专一性比PLE在某种程度上要好得多，但这些酶起源有限、使用较少。第12页第12页v1反应条件温和 PLE可在温和反应条件下催化乙酸环丙酯、前列腺素E1甲酯水解，假如用化学法水解(酸解或碱解)这类酯，则很容易造成分解反应发生，见图8-4。这一特性已被成功地用于前列腺素El(1)合成过程中最后羧基脱保护反应，见图8-4。第13页第13页v2区域选择性 酯酶催化水解反应含有区域选择性，PLE能区域选择性地催化苹果酸二甲酯(2)1-羧酸酯发生水解反应。同样，由外式和内式-双环2.2.1庚酸乙酯构成混合物(3)，PLE只能水解混合物中位阻较小外式羧酸酯，而内式羧酸酯则不能被水解，反应后生成(4)和(5)，两者很容易被分离纯化，见图8-5。第14页第14页第15页第15页v酯酶可选择性水解顺、反(EZ)烯酸酯异构体，其它水解酶(如蛋白酶、脂肪酶)却很少含有这种区域选择性，普通水解成二元酸。第16页第16页第17页第17页第18页第18页v(二)I型酯水解 v1潜手性二酯v 猪肝酯酶(PLE)和-胰凝乳蛋白酶可催化潜手性3-位取代戊二酸二甲酯(9)不对称化。鲁氏不动杆菌(Arthrobacter lowefii)和节杆菌(Arthrobacter sp)完整细胞含有酯酶活性，也能催化这类反应，但二者催化反应立体选择性相反，分别产生不同构型产物(10)和(11)，见图8-8。第19页第19页第20页第20页第21页第21页v-甲基-L-氨基酸是一类手性合成源，可用于手性药品合成中。它们与天然氨基酸结构不同，不能采取常规氨基酸衍生物拆分法来制备。酯酶能催化潜手性二羧基二甲酯选择性水解为手性单酯(8)，然后单酯(8)中羧基经过Cudius重排反应可转化为氨基，最终PIE再将单酯水解生成光学纯-甲基L-氨基酸，图89。第22页第22页第23页第23页v(三)型酯水解 1内消旋环状二醇二酯 水解酶能催化内消旋单环二醇羧酸酯对映选择性水解，环戊烯-1,4-二醇二羧酸酯(14)能被PLE水解得到高光学纯度手性单酯化合物(15)。手性环戊烯二醇类衍生物是前列腺素及其衍生物合成起始原料。酯分子中酰基部分对酶催化活性有着很大影响，当起始底物中酰基链增大时，酶水解产物单酯光学纯度下降，比如双乙酸酯水解产物对映体过量率巴e.e为86，而双丁酸酯水解产物e.e则下降为33，见图8-13。第24页第24页第25页第25页v乙酰胆碱酯酶(ACE)催化环戊烯二醇二酯水解反应含有很高立体选择性，其产物(16)立体构型与PLE水解产物构型相反。环大小改变将影响ACE所催化水解反应立体选择性。ACE催化内消旋六元环二醇二酯水解产生消旋体产物(17)，而催化内消旋七元环二醇二酯水解产生单一对映体(18)，其对映体过量率靠近100，但该酶催化内消旋体五元环二醇二酯水解则产生相反构型单酯(16)，产物对映体过量率约为99，见图8-14。第26页第26页第27页第27页v三、微生物酯酶 完整微生物细胞能直接用于催化酯立体选择性水解，枯草杆菌、产氨短杆菌、凝结芽孢杆菌、豆酱毕赤氏酵母和黑色根霉等是惯用于酯水解微生物。1外消旋仲醇酯水解 第28页第28页第29页第29页v微生物生物转化存在代谢反应控制问题，利用冻干面包酵母中酯酶进行静态细胞培养法生物转化可有效地克制其它副反应。v外消旋体乙酸-1-炔-3-醇酯(35)和外消旋泛解酰内酯乙酸酯(36)均可用冻干面包酵母催化拆分，产物对映体过量率与取代基性质相关，见图8-20。第30页第30页四、含有酯酶活性蛋白酶 1-胰凝乳蛋白酶 v-胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶可催化许多非天然酯立体选择性水解。v对于I型酯类底物，-胰凝乳蛋白酶要求底物分子中手性中心相连基团必须有一个为亲水性、另一个为疏水性。第31页第31页第32页第32页v-胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶同样可用于区域选择性催化水解反应。-胰凝乳蛋白酶可选择性水解脱氢谷氨酸二甲酯(42)1-位酯基，而木瓜蛋白酶则选择性水解5-位酯基，见图8-23。第33页第33页第34页第34页v2枯草杆菌蛋白酶 枯草杆菌蛋白酶可立体选择性水解酯类化合物。枯草杆菌蛋白酶选择性催化天冬氨酸或谷氨酸二苄基酯(43)1-位酯基水解。枯草杆菌蛋白酶还能高选择性地催化丙烷-1，2，3-三羧酸乙酯(44)中2位酯基水解，见图8-24 第35页第35页第36页第36页v3青霉素酰化酶 青霉素酰化酶可高选择性地水解苯乙酸酯，因此可用于除去苯乙酸保护基。苯乙酸与伯醇或仲醇均可形成酯，青霉素酰化酶优先水解酯分子中醇基部分与天然青霉素G母核空间结构相同底物.第37页第37页五、脂肪酶 v脂肪酶能催化甘油三酯水解为脂肪酸和甘油，它们在食品和油脂加工以及手性中间体制备中有着广泛应用。在v生物催化反应中，有30以上研究涉及到脂肪酶，这类酶在手性技术中正发挥着越来越主要作用。v脂肪酶除了催化水解反应外，还能催化酯合成反应。第38页第38页(一)脂肪酶水解反应特点 脂肪酶催化反应分子机理与蛋白酶和酯酶不同。酯酶催化反应速度与底物浓度关系符合米氏方程曲线，而脂肪酶则表现出S形曲线，见图8-28。第39页第39页v (六)其它脂肪酶 生物转化反应中使用较多脂肪酶是PPL、CRL、PSL、MSL，尚有一些其它脂肪酶正在研究开发中。曲霉属脂肪酶(Aspergillus sp1ipase,ASL)能催化含有空间位阻酰氧基酯类消旋体拆分。分子中引入含硫原子酰基能够明显地改进ASL催化反应立体选择性。第40页第40页第41页第41页v氰醇是拟除虫菊酯制备主要原料，也是手性-羟基酸、-羟基醛、氨基醇合成中间体。光学纯氰醇可通过微生物脂肪酶拆分它消旋体酯来制备。v在拆分反应中，酯水解产生氰醇会原位消旋化，因此只有不被水解底物才干取得高光学纯对映体。第42页第42页第43页第43页第三节 环氧化物水解 v环氧化物是一类主要有机化合物，是许多生物活性物质合成原料。普通可用化学法制备环氧化物，但反应立体选择性不高。环氧化物水解酶能催化环氧化物进行区域和对映选择性水解，从而通过生物拆分法制备所需构型环氧化物。生物催化烯烃环氧化反应也能直接制备光学纯环氧化物，但是这项技术需要发酵设备和复杂后处理工程。第44页第44页v环氧化物水解酶在生物体内外源性化合物代谢中起着主要作用。在活细胞中，芳香烃和烯烃类化合物能够经过两种不同路径代谢。v在低等原核细胞(如细菌)中，双氧酶催化分子氧环加成到芳香环碳碳双键中形成芳基二氧杂环丁烷，然后再被还原酶还原为顺式连二醇。在高等真核细胞(如真菌、哺乳动物)中，芳香环碳碳双键则被氧化为环氧化物，环氧化物含有强亲电性，是一类强烷化剂，含有毒性、致畸和致癌作用，与生物细胞不相容。v为了消除它们影响，细胞内环氧化物水解酶能使之转化为生物惰性反式连二醇，使代谢物水溶性增加，并能被生物体深入分解代谢和排泄，真核细胞内环氧化物水解酶多数位于肝脏内，它们负责外源性化合物解毒作用 第45页第45页第46页第46页v一、肝微粒体环氧化物水解酶 v肝细胞中已确定存在两种环氧化物水解酶：微粒体环氧化物水解酶(microsomal epoxidehydrolase，MEH)和胞质环氧化物水解酶(cytosolic epoxide hydrolase，CEH)，二者对底物选择性不同。普通惯用MEH作为生物催化剂，它对非天然环氧化物含有高反应活性和立体选择性。第47页第47页第48页第48页第49页第49页v2末端环氧化物水解v 环氧化物水解酶使用受到底物在水溶液中稳定性影响，一些环氧化物在酸性或碱性pH值条件下不稳定，会自发性水解。这种水解过程没有选择性，因而最后产物光学纯度差。v取代基R性质对反应选择性有很大影响，直链烷基环氧乙烷不能被有效地拆分，而支链烷基则可增长反应选择性，见表8-5。另外，增长底物浓度也可提升反应选择性 第50页第50页第51页第51页v3非末端环氧化物水解 环氧化物水解酶能催化顺式构型非末端环氧化物立体选择性水解。第52页第52页第53页第53页v4环状环氧化物水解v环氧化物水解酶能催化内消旋顺式1，2-环氧环烷(81)不对称水解产生反式环烷连二醇，第54页第54页第55页第55页第56页第56页v对肝环氧化物水解酶研究即使诸多，但主要集中在解毒机理方面。由于这些酶制备困难，普通很难用于制备性生物转化。v微生物起源环氧化物水解酶则制备容易，因而常被用于生物催化反应中。v二、微生物环氧化物水解酶v 在微生物催化烯烃环氧化过程中，能够观测到环氧化物水解现象，这是由微生物环氧化物水解酶所引起，微生物环氧化物水解酶在手性合成中应用还不多。第57页第57页v1非末端环氧化物水解第58页第58页v2末端环氧化物水解v 第59页第59页v细菌环氧化物水解酶能催化消旋体分支末端环氧化物(88)对映选择性水解，其水解发生在未取代环氧碳原子上，这种催化反应可采用冻干细菌细胞作为催化剂，见图8-61。第60页第60页v在酶法环氧化物水解反应体系中，添加其它亲核试剂会产生非乙二醇产物，反应同样含有立体选择性。比如氨解会产生-氨基乙醇(89)，叠氮化物参与反应则产生-叠氮醇(90)，见图8-62。第61页第61页第62页第62页第四节第四节 腈腈 水水 解解v含有腈基有机化合物是一个主要合成原料。天然腈存在于植物、真菌、细菌、藻类、海绵、昆虫、甚至哺乳动物中。v许多植物会产生氰基葡萄糖苷，微生物和植物还会产生脂肪族腈或芳香腈，如氰脂、蓖麻碱和苯乙腈，这些有机氰化合物不但能作为氮储备源，并且还能作为保护剂，制止其它生物侵害。v生物界中有一个防御机制存在时，就会有相应破坏机制，生物体内有多个腈化物降解路径如氧化、水解等。第63页第63页v1腈水合酶 v 腈水合酶和腈水解酶作用机理不同，最近研究发觉底物立体原因和电学性质对酶催化腈水解反应有很大影响。第64页第64页v2.腈水解酶 v腈水解酶催化反应机理类似于碱催化腈水解反应过程，这类酶既不需要金属离子，也不需要辅酶，不过度子中必须有亲核巯基。巯基首先亲核进攻腈中碳原子形成酶-亚胺中间体，再水合产生四周体中间体，该中间体除去氨转变为酰基-酶中间体，后者水解产生羧酸，并使酶恢复原形，见图8-65。第65页第65页第66页第66页v酶催化腈水解反应在生物催化手性合成中含有一定应用价值。氰化物是一个主要C，合成源，是一个水稳定“负碳离子”。v腈酶法水解可达到化学选择性、区域选择性和对映选择性要求。由于分离纯化腈水解酶不稳定，绝大多数生物转化反应是利用完整细胞作催化剂。腈水解酶还可用于工业废水中氰化物水解脱毒，以保护生态环境。第67页第67页v二、腈化学选择性水解 v现已发觉能提供腈化物水解酶微生物有芽孢杆菌属、短杆菌属、小球菌属等。它们代谢含有多样性，细胞内产生腈水解酶或腈水合酶取决于培养基中碳源和氮源，以及在培养基中酶表示诱导剂性质。当需要将腈转化为酰胺时，可在培养基中添加脂肪族腈作为诱导剂以诱导腈水合酶表示；当需要羧酸时，可在培养基中添加芳香族腈以诱导腈水解酶表示。第68页第68页v1腈水合酶v丙烯酰胺是聚丙烯酰胺类高分子材料合成主要单体，全世界年产量约为20万吨。v老式化学法是利用铜催化剂催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺，反应中会产生大量聚合物副产物，需要分离纯化。v现在可利用生物催化法大量合成丙烯酰胺，简化了生产工艺、减少了成本，这是一个环境友好生产工艺。v采用完整短杆菌细胞、绿叶假单胞菌或玫瑰色红球菌可将丙烯腈转化为丙烯酰胺，其产率不小于99。反应中产生副产物丙烯酸能够通过添加酰胺酶克制剂第69页第69页第70页第70页第71页第71页第72页第72页v2腈水解酶 v 改变培养条件可使微生物产生腈水解酶，它能使氰基直接转化为相应羧酸。第73页第73页v三、腈区域选择性水解 v化学法水解多氰基化合物没有选择性，而微生物酶法水解多氰基化合物含有区域选择性。第74页第74页v-氰醇和-氨基腈水解可用于制备-羟基酸和-氨基酸。第75页第75页第76页第76页第五节第五节 酰胺水解酰胺水解v多肽和蛋白质是由氨基酸通过酰胺键(肽键)互相连接形成生物大分子vL-氨基酸被广泛用于医药、食品和手性合成中。近年来一些非天然D-氨基酸被用作手性化合物合成前体，D-苯甘氨酸、D-对羟基苯甘氨酸是-内酰胺类抗生素惯用侧链。v氨基酸普通由发酵法、化学合成法和酶法制备，其中酶法合成对映体纯氨基酸主要有下列三种办法：水解酶催化消旋体拆分、裂合酶催化不对称氨加成和脱氢酶催化不对称还原胺化反应，见图8-72。第77页第77页第78页第78页v一、酰胺酶v 氨基酸酰胺酶(amidase)又称氨基肽酶，存在于动物肾脏、胰腺和微生物中，尤其是假单胞菌、曲霉和红球菌中含量丰富。v它能催化消旋体氨基酸酰胺选择性水解生成L氨基酸。vL-氨基酸与未反应D-氨基酸酰胺在不同溶剂、不同pH值条件下，二者含有不同溶解度，利用这种性质差异可将它们相互分离。第79页第79页v二、酰化酶v 第80页第80页第81页第81页第82页第82页第83页第83页第84页第84页第85页第85页