生物催化与生物转化IV公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件.pptx

Chapter 11 Modification of Enzyme Molecule酶分子修饰酶分子修饰第1页第1页Contents of chapter 111、什么是酶分子修饰2、酶分子修饰基本要求和条件3、酶分子修饰办法4、酶修饰后性质改变GoGoGoGo5、酶定向进化Go第2页第2页11.1 11.1 什么是酶分子修饰？什么是酶分子修饰？o通过各种办法使酶分子结构发生一些改变，从而改变酶通过各种办法使酶分子结构发生一些改变，从而改变酶一些特性和功效技术过程称为酶分子修饰。一些特性和功效技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工办法与一些化学基团（物质），尤其是含有生物相容性物质，进行共价连接，从而改变酶结构和性质。第3页第3页酶分子修饰意义o提升酶活力活力 activityactivityo增强酶稳定性稳定性 stabilitystabilityo减少或消除酶抗原性抗原性 immunological propertyimmunological propertyo研究和理解酶分子中主链、侧链、构成单位、金属离子和各种物理原因对酶分子空间构象影响 structurestructure 回本章目录第4页第4页11.2 酶分子修饰基本要求和条件酶分子修饰基本要求和条件 o对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件选择对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件选择以及酶学性质等方面都要有足够理解。以及酶学性质等方面都要有足够理解。n（1 1）酶稳定性酶稳定性o热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pHpH、克制剂等。、克制剂等。n（2 2）酶活性中心情况酶活性中心情况 o活性中心基团、辅因子等。其它如分子大小、性状、活性中心基团、辅因子等。其它如分子大小、性状、亚基数等。亚基数等。第5页第5页酶分子修饰条件酶分子修饰条件o修饰反应尽也许在酶稳定条件下进行，并尽也许不破坏酶活性功效必需基团，使修饰率高，同时酶活力回收高。o（1）pH与离子强度 opH决定了酶蛋白分子中反应基团解离状态。因为它们解离状态不同，反应性能也不同。o（2）修饰反应温度与时间 o严格控制温度和时间能够降低以至消除一些非专一性修饰反应。o（3）反应体系中酶与修饰剂百分比 回本章目录第6页第6页11.3 11.3 酶分子修饰办法酶分子修饰办法 o金属离子置换修饰金属离子置换修饰,o大分子结合修饰大分子结合修饰(共价共价/非共价非共价)o侧链基团修饰侧链基团修饰o肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰o氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰o酶分子物理修饰酶分子物理修饰 第7页第7页(1)(1)酶金属离子置换修饰酶金属离子置换修饰o把酶分子中金属离子换成另一个金属离子，使酶特性和功效发生改变修饰方法称为金属离子置换修饰。o-淀粉酶中钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)o若从酶分子中除去其所含金属离子，酶往往会丧失其催化活性。假如重新加入原有金属离子，酶催化活性能够恢复或者部分恢复。若用另一个金属离子进行置换，则可使酶展现出不同特性。有能够使酶活性降低甚至丧失，有却能够使酶活力提升或者增加酶稳定性。第8页第8页金属离子置换修饰过程金属离子置换修饰过程 p a.酶分离纯化：首先将欲进行修饰酶通过度离纯化，除去杂质，取得含有一定纯度酶液。p b.除去原有金属离子：在通过纯化酶液中加入一定量金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等办法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。p c.加入置换离子：于去离子酶液中加入一定量另一个金属离子，酶蛋白与新加入金属离子结合，除去多出置换离子，就能够得到通过金属离子置换后酶。p 金属离子置换修饰只适合用于那些在分子结构中本来含有金属离子酶。金属离子置换修饰只适合用于那些在分子结构中本来含有金属离子酶。p 用于金属离子置换修饰金属离子，普通都是二价金属离子。用于金属离子置换修饰金属离子，普通都是二价金属离子。第9页第9页(2)(2)酶大分子修饰酶大分子修饰o使用一些能与酶非共价地互相作用而又能有效地保护酶一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶活力。o一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调整酶微环境来保护酶活力。o另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间互相作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增长了互相作用力，其稳定性也就增长了。非共价修饰非共价修饰第10页第10页o用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子表面，形成一层覆盖层。o比如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不但能够减少或消除酶抗原性，并且提升了抗蛋白酶能力，延长了酶在体内半衰期从而提升了酶药效。o每分子核糖核酸酶与6.56.5分子右旋糖酐结合，能够使酶活力提升到原有酶活力2.252.25倍；o每分子胰凝乳蛋白酶与1111分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力5.15.1倍 共价修饰共价修饰第11页第11页大分子修饰大分子修饰(共价共价)过程过程o修饰剂选择：大分子结合修饰采取修饰剂是水溶性大分子。比如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要依据酶分子结构和修饰剂特性选择适宜水溶性大分子。o修饰剂活化：作为修饰剂中含有基团往往不能直接与酶分子基团进行反应而结合在一起。在使用之前普通需要经过活化，然后才干够与酶分子某侧链基团进行反应。o修饰：将带有活化基团大分子修饰剂与经过度离纯化酶液，以一定百分比混合，在一定温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂活化基团与酶分子某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。o分离：需要经过凝胶层析等方法进行分离，将含有不同修饰度酶分子分开，从中取得含有很好修饰效果修饰酶。第12页第12页o聚乙二醇是线性分子含有良好生物相容性和水溶性，聚乙二醇是线性分子含有良好生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶抗在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶抗原性，使其末端活化后能够与酶产生交联，因而，它原性，使其末端活化后能够与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶修饰。被广泛用于酶修饰。酶 半衰期相对稳定性 天然SOD 6 min 1 右旋糖酐-SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量)SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量)SOD 24 h 240 聚乙二醇聚乙二醇-SOD-SOD 35 h35 h 350350第13页第13页(3)(3)酶分子侧链基团修饰酶分子侧链基团修饰o采用一定办法（普通为化学法）使酶蛋白侧链基团发生改变，从而改变酶分子特性和功效修饰办法。o能够用于研究各种基团在酶分子中作用及其对酶结构、特性和功效影响。在研究酶活性中心中必需基团时经常采用。o酶蛋白侧链基团是指构成蛋白质氨基酸残基上功效团。主要包括氨基、羧基、巯氨基、羧基、巯氨基、羧基、巯氨基、羧基、巯基、胍基、酚基基、胍基、酚基基、胍基、酚基基、胍基、酚基等。这些基团能够形成各种副键，对酶蛋白空间结构形成和稳定有主要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象改变，从而改变酶特性和功效。第14页第14页催化活性催化活性/非催化活性基团修饰非催化活性基团修饰o对非催化基团修饰可改变酶动力学性质，改变酶对特殊对非催化基团修饰可改变酶动力学性质，改变酶对特殊底物束缚能力。底物束缚能力。o经常被修饰残基是：经常被修饰残基是：n亲核亲核SerSer、CysCys、MetMet、ThrThr、LysLys、HisHisn亲电亲电TyrTyr、TrpTrpo对催化活性基团能够通过选择性修饰侧链成份来实现氨对催化活性基团能够通过选择性修饰侧链成份来实现氨基酸取代。基酸取代。第15页第15页常见基团化学修饰反应：羧基常见基团化学修饰反应：羧基常见基团化学修饰反应：羧基常见基团化学修饰反应：羧基第16页第16页常见基团化学修饰反应：氨基常见基团化学修饰反应：氨基常见基团化学修饰反应：氨基常见基团化学修饰反应：氨基第17页第17页常见基团化学修饰反应：巯基常见基团化学修饰反应：巯基常见基团化学修饰反应：巯基常见基团化学修饰反应：巯基第18页第18页常见基团化学修饰反应：咪唑基常见基团化学修饰反应：咪唑基常见基团化学修饰反应：咪唑基常见基团化学修饰反应：咪唑基第19页第19页常见基团化学修饰反应：酚羟基常见基团化学修饰反应：酚羟基常见基团化学修饰反应：酚羟基常见基团化学修饰反应：酚羟基第20页第20页常见基团化学修饰反应：胍基常见基团化学修饰反应：胍基常见基团化学修饰反应：胍基常见基团化学修饰反应：胍基第21页第21页常见基团化学修饰反应：色氨酸吲哚基常见基团化学修饰反应：色氨酸吲哚基常见基团化学修饰反应：色氨酸吲哚基常见基团化学修饰反应：色氨酸吲哚基第22页第22页(4)(4)酶蛋白主链修饰酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰)o利用酶分子主链切断和连接，使酶分子化学结构及其空间结构发生利用酶分子主链切断和连接，使酶分子化学结构及其空间结构发生一些改变，从而改变酶特性和功效办法。一些改变，从而改变酶特性和功效办法。o酶蛋白主链修饰主要是靠酶切酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。酶原激活法。a a、胃蛋白酶原激活、胃蛋白酶原激活 第23页第23页第24页第24页b b、胰蛋白酶原（、胰蛋白酶原（trypsinogentrypsinogen）激活）激活 第25页第25页第26页第26页c c、胰凝乳蛋白酶原（、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogenchymotrypsinogen）激活）激活 第27页第27页o氨基酸或核苷酸置换修饰能够采用化学修饰办法，比如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，并且要对酶分子逐一进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。o现在惯用氨基酸置换修饰办法是定点突变技术定点突变技术。定点突变（site site directed mutagenesisdirected mutagenesis）是20世纪80年代发展起来一个基因操作技术。是指在DNA序列中某一特定位点上进行碱基改变从而取得突变基因操作技术。是蛋白质工程（Protein EngineeringProtein Engineering）和酶分子构成单位置换修饰中惯用技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸置换修饰提供了先进、可靠、行之有效手段。(5)(5)氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰第28页第28页酶分子定点突变酶分子定点突变1 1、基因序列分析、基因序列分析2 2、蛋白质结构分析、蛋白质结构分析3 3、酶活性中心分析、酶活性中心分析4 4、引物设计进行基因定点突变、引物设计进行基因定点突变5 5、酶基因克隆表示、酶基因克隆表示6 6、变异特性分析、变异特性分析第29页第29页(6)(6)酶分子物理修饰酶分子物理修饰 o经过物理修饰，能够了解不同物理条件下，尤其是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）因为酶分子空间构象改变而引发酶特性和功效改变情况。o特点在于不改变酶组成单位及其基团，酶分子中共价键不发生改变，只是在物理原因作用下，副键发生一些改变和重排。回本章目录第30页第30页11.4 11.4 酶修饰后性质改变酶修饰后性质改变o热稳定性热稳定性：普通来说，热稳定性有较大提升。：普通来说，热稳定性有较大提升。o抗原性抗原性：比较公认是：比较公认是PEGPEG和人血清白蛋白在消除酶抗原性上效果比较和人血清白蛋白在消除酶抗原性上效果比较明显。明显。o各类失活因子抵抗力各类失活因子抵抗力：修饰酶对蛋白酶、克制剂都有一定抵抗能：修饰酶对蛋白酶、克制剂都有一定抵抗能力，从而提升其稳定性。力，从而提升其稳定性。o半衰期半衰期：普通在体内半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，：普通在体内半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、克制剂等稳定性，从而延长了在体内半衰期。增强对热、蛋白酶、克制剂等稳定性，从而延长了在体内半衰期。o最适最适pHpH：大部分酶经化学修饰后，酶最适：大部分酶经化学修饰后，酶最适pHpH发生了改变，这种改变发生了改变，这种改变在应用研究上有时含有主要意义。修饰酶最适在应用研究上有时含有主要意义。修饰酶最适pHpH更靠近于生理环境，更靠近于生理环境，在临床应用上有较大意义。在临床应用上有较大意义。oKmKm改变改变：大多数酶经修饰后，：大多数酶经修饰后，VmVm没有明显改变，但有些酶经修饰后，没有明显改变，但有些酶经修饰后，KmKm值变大。值变大。回本章目录第31页第31页11.5 11.5 酶定向进化酶定向进化o酶分子酶分子合理设计合理设计(rational design)(rational design)o酶分子酶分子定向进化定向进化(directed evolution)(directed evolution)第32页第32页酶合理设计酶合理设计第33页第33页体外定向进化意义体外定向进化意义体外定向进化意义体外定向进化意义o理论上，蛋白质分子蕴藏着很大进化潜力，诸多功效有理论上，蛋白质分子蕴藏着很大进化潜力，诸多功效有待于开发，这是酶体外定向进化基本先决条件。待于开发，这是酶体外定向进化基本先决条件。o所谓酶体外定向进化，又称试验分子进化，属于蛋白质所谓酶体外定向进化，又称试验分子进化，属于蛋白质非合理设计，它不需事先理解酶空间结构和催化机制，非合理设计，它不需事先理解酶空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊条件，模拟自然进化机制通过人为地创造特殊条件，模拟自然进化机制(随机突变、随机突变、重组和自然选择重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质突变酶。需性质突变酶。o酶体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学研究和酶体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学研究和应用范围，尤其是能够处理合理设计所不能处理问题，应用范围，尤其是能够处理合理设计所不能处理问题，为酶结构与功效研究开辟了崭新路径，并且正在工业、为酶结构与功效研究开辟了崭新路径，并且正在工业、农业和医药等领域逐步显示其生命力。农业和医药等领域逐步显示其生命力。第34页第34页定向进化原理定向进化原理o在待进化酶基因PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不含有3-5校对功效性质，配适当当条件，以很低比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向选择办法，选出所需性质优化酶(或蛋白质)，从而排除其它突变体。o定向进化基本规则是“获取你所筛选突变体获取你所筛选突变体获取你所筛选突变体获取你所筛选突变体”。oo定向进化定向进化定向进化定向进化=随机突变随机突变随机突变随机突变+选择选择选择选择。前者是人为引起，后者虽相称于环境，但只作用于突变后分子群，起着选择某一方向进化而排除其它方向突变作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行第35页第35页DNADNADNADNA改组和外显子改组改组和外显子改组改组和外显子改组改组和外显子改组oDNA改组（DNA shuffling）又称有性PCR(sexual PCR)，原理。该策略目标是创造将亲本基因群中突变尽也许组合机会，造成更大变异，最终获取最正确突变组合酶。通过DNA改组,不但可加速积累有益突变，而且可使酶2个或更多已优化性质合为一体。o外显子改组（exon shuffling）类似于DNA改组，二者都是在各自含突变片段间进行互换，前者尤其适合用于真核生物。在自然界中，不同分子内含子间发生同源重组，造成不同外显子结合，是产生新蛋白质有效路径之一。与DNA改组不同，外显子改组是靠同一个分子间内含子同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。第36页第36页DNADNADNADNA改组原理改组原理改组原理改组原理第37页第37页定向进化选择策略定向进化选择策略定向进化选择策略定向进化选择策略1、定向进化中，突变含有随机性，但通过选择特定方向突选择特定方向突选择特定方向突选择特定方向突变限定了进化趋势变限定了进化趋势变限定了进化趋势变限定了进化趋势，加之控制试验条件，限定突变种类，减少突变率，缩小突变库容量，这不但减少了工作量，更主要是加快了酶在某一方向进化速度。2、通常,筛选办法必须灵敏筛选办法必须灵敏筛选办法必须灵敏筛选办法必须灵敏,至少与目的性质相关至少与目的性质相关至少与目的性质相关至少与目的性质相关。另有一些其它筛选办法，如加入能产生可见光信号底物或利用绿色荧光蛋白荧光性质等。高通量筛选体系第38页第38页酶性质突变办法枯草杆菌蛋白酶E有机相活性/稳定性易错PCR-内酰胺酶总活力/底物专一性DNA改组枯草杆菌蛋白酶BPN稳定性 盒式诱变对硝基苯酯酶底物专一性/有机相活性易错PCR/DNA改组 胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性盒式诱变-半乳糖苷酶底物专一性DNA改组绿色荧光蛋白荧光DNA改组核酶底物专一性易错PCR/DNA改组天冬氨酸酶活性与稳定性随机/定位诱变药物和疫苗活性/专一性/最佳表示DNA改组酶体外定向进化应用实例酶体外定向进化应用实例酶体外定向进化应用实例酶体外定向进化应用实例回本章目录第39页第39页