病毒的纯化与保存.pptx
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1、病毒纯化和保留病毒的纯化与保存第1页病毒纯化目标(了解)n为了了解病毒结构、传染与免疫、遗传与变异等性质,经常需要高纯度病毒病毒的纯化与保存第2页病毒纯化原理病毒纯化原理(熟悉熟悉)n利用物理或化学方法尽可能地去除宿主细胞中组分,将病毒从其宿主细胞内提纯出来,在纯化过程中保持病毒生物活生物活性性和感染性感染性。病毒的纯化与保存第3页病毒纯化普通标准病毒纯化普通标准(熟悉熟悉)n1、释放病毒到胞外、释放病毒到胞外1.1 轻易释放病毒(培养液/尿囊液)1.2 不轻易释放病毒(细胞破碎)n2、去除细胞碎块、去除细胞碎块低速离心,以6000r/min离心3040分钟,可除去90以上细胞碎片和杂质 n3
2、、病毒悬液浓缩、病毒悬液浓缩病毒的纯化与保存第4页细胞破碎方法细胞破碎方法(熟悉熟悉)n超声破碎:密集小气泡快速炸裂,破坏细胞n高压匀浆:机械切割力n高速珠磨:玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂n酶溶法:溶菌酶、蛋白酶、葡聚糖酶n化学渗透:渗透压改变使细胞破裂n重复冻融:形成冰晶,使细胞膨胀破裂病毒的纯化与保存第5页 病毒纯化方法病毒纯化方法聚乙二醇(PEG)浓缩法nPEG是环氧乙烷和水缩合而成水溶性非离子聚合物,无毒、无刺激性。n平均分子量不一样,性质也有差异。分子量200600者常温下是无色无臭粘稠液体,分子量在600以上者就逐步变为半固体状、蜡状固体。n伴随分子量增大,其吸湿能力对应降低。
3、病毒的纯化与保存第6页不一样分子量PEG性质比较病毒的纯化与保存第7页病毒的纯化与保存第8页聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握)n分子量6000PEG用于病毒浓缩nPEG可使病毒颗粒形成多聚体,较低离心力即可沉淀n(1)直接加入法 病毒悬液量少时候使用此法;病毒悬液中加入8%-10%PEG病毒的纯化与保存第9页聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握)n(2)液体浓缩法 病毒的纯化与保存第10页聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握)n(3)固体浓缩法 将PEG固体覆盖于装有病毒悬液透析袋上,进行浓缩。透析袋孔径大小病毒的纯化与保存第11页超出滤法(熟悉)n原理:利用超滤膜将水、盐及小分子滤过,将大分子或病毒等颗粒
4、截留。n超滤膜孔径要比病毒颗粒小n只能去除比病毒小细胞碎块病毒的纯化与保存第12页吸附法(熟悉)n原理:病毒颗粒表面离子与吸附剂有亲和性,病毒吸附之后,使用适当条件将病毒洗脱下来。n吸附剂必须具备特点:较大表面积和吸附能力;较高吸附选择性;便于洗脱;性质稳定;病毒的纯化与保存第13页凝胶吸附法-磷酸钙凝胶n惯用凝胶,由0.5 mol/L CaCl2和0.5 mol/L Na2HPO4溶液混合制备凝胶状沉淀物,用0.001 mol/L磷酸盐缓冲液悬浮,置于445天,使之充分沉淀后应用。病毒的纯化与保存第14页凝胶吸附法-氢氧化锌凝胶n是由7mol/L氨水与0.1mol/L醋酸锌溶液滴加混合(pH
5、8.5)制备,在制备后数小时内较稳定。n方法:将水泡性口炎病毒悬液与氢氧化锌凝胶混合,使它们形成复合体后沉淀,然后用0.08mol/LEDTA(pH8.5)解离回收病毒。病毒的纯化与保存第15页凝胶吸附法-焦磷酸镁凝胶n是由0.1mol/L焦磷酸钠和0.1mol/LMgCl2,以2:10(体积)百分比在室温中迟缓滴加混合而取得较稳定焦磷酸镁凝胶。n将牛痘病毒悬液同此凝胶混合,使病毒吸附于凝胶,然后用0.1mol/L盐水洗2次,最终用0.3mol/L枸橼酸钠溶液解离病毒,将病毒很好地回收于水相中。病毒的纯化与保存第16页红细胞吸附法(熟悉)n用于一些与红细胞吸附病毒浓缩n选择适宜动物红细胞:鸡红
6、细胞n基本步骤:1)1%-3%红细胞与病毒悬液混合,2吸附1h以上;2)1000r/min离心10分钟,沉淀吸附病毒红细胞,弃上清,生理盐水洗涤2次;3)用1/50原体积磷酸缓冲液重悬红细胞沉淀,在37保温2-3h;4)1000r/min离心10分钟,上清即是浓缩病毒悬液。病毒的纯化与保存第17页葡聚糖柱层析法(熟悉)n葡聚糖凝胶是指由葡聚糖与其它交联剂交联而成凝胶。n最常见是Sephadex系列,主要型号是G-10G-200,后面数字是凝胶吸水率(单位是mL/g干胶)乘以10。如SephadexG-50,表示吸水率是5mL/g干胶。病毒的纯化与保存第18页葡聚糖柱层析法(熟悉)nSephad
7、ex亲水性很好,在水中极易膨胀,不一样型号Sephadex吸水率不一样,它们孔穴大小和分离范围也不一样。数字越大,排阻极限越大,分离范围也越大。G-25分离范围1000-5000适合用于脱盐、肽与其它小分子分离;G-200分离范围5000-600000适合用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定。病毒的纯化与保存第19页葡聚糖柱层析法n将初步浓缩材料,经过葡聚糖G150或G200柱层析,然后用0.020.15mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.6)洗脱,分部搜集,测定280nm波优点OD值,滴定各部分效价,将含病毒各部分相混合,再浓缩,透析之后,即可得到比较纯病毒。nNagano(1989年)用
8、Sephacryls-1000柱层析纯化了鸡传染性支气管炎病毒。病毒的纯化与保存第20页葡聚糖柱层析法病毒的纯化与保存第21页病毒的纯化与保存第22页差速离心法(掌握)n原理:不一样大小和比重粒子有不一样沉降速度n适合分离沉降速度差异较大粒子n适合用于从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附-释放病毒悬液中提纯病毒。n优点:能快速处理大量样品,作为病毒提纯精制第一步病毒的纯化与保存第23页n惯用方法(熟悉):以低速(-3000r/min)及中速(10000r/min)离心20-30分钟去除较大宿主细胞碎片、污染细菌及其它较大杂质,再选择较高速度离心1-2h使病毒沉淀。差速离心法病毒的纯化与保存
9、第24页密度梯度离心n原理:将样品加在惰性密度梯度介质上进行超速离心,在一定离心力下把样品颗粒分配到密度梯度介质中相等密度层中,吸出目标颗粒所在介质层,从而到达分离纯化目标。n惯用介质为氯化铯CsCl、蔗糖病毒的纯化与保存第25页1040蔗糖密度梯度制备n首先配置好不一样百分比(w/v)蔗糖溶液,然后在离心管中先加入浓度最小(10%)溶液,然后用吸管加入浓度稍大溶液,注意,加时吸管要插入离心管底部,迟缓加入,务求界面分明。然后按上法依次分层加入其余各浓度蔗糖溶液,即可配成蔗糖梯度液。n将事先用更低密度蔗糖溶液(小于10%)悬浮样品轻轻加入10%蔗糖溶液表面,进行密度梯度离心即可。病毒的纯化与保
10、存第26页梯度混合仪病毒的纯化与保存第27页等密度梯度离心(掌握)n原理:与密度梯度法相同,但不制备梯度介质,而是在样品中加入CsCl,离心过程中CsCl随离心力而下沉,形成连续密度梯度,样品中颗粒随其密度大小而下沉或上浮到相等密度梯层中。n每毫升病毒悬液加1gCsCl,混匀,40000g离心24-36h。病毒的纯化与保存第28页病毒蛋白分离SDS-PAGEnPAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳Poly-AcrylamideGelElectrophoresis以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质一个惯用电泳技术。病毒的纯化与保存第29页PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳n聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺
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