重组质粒DNA转化大肠杆菌实验.pptx

试验三试验三重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌转化大肠杆菌重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第1页页实实 验验 目目 p 学习将重组质粒学习将重组质粒DNA导入大肠杆菌方法导入大肠杆菌方法p 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞方法学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞方法p 为下一步重组体筛选做准备为下一步重组体筛选做准备重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第2页页实实 验验 原原 理理 遗传学中转化基本含义是使细胞取得一新可遗传表型性遗传学中转化基本含义是使细胞取得一新可遗传表型性状。分子克隆中用人工方法将重组质粒状。分子克隆中用人工方法将重组质粒DNA导入大肠杆菌细导入大肠杆菌细胞，使携带有重组质粒大肠杆菌取得在抗生素平板上生长能胞，使携带有重组质粒大肠杆菌取得在抗生素平板上生长能力，从而与不携带重组质粒细菌区分开来，这个过程就是转力，从而与不携带重组质粒细菌区分开来，这个过程就是转化。化。将重组质粒转化进受体细菌时，需诱导受体细菌产生一将重组质粒转化进受体细菌时，需诱导受体细菌产生一个短暂感受态以摄取外源个短暂感受态以摄取外源DNA。大肠杆菌细胞经过一些特殊。大肠杆菌细胞经过一些特殊方法（电击法、方法（电击法、CaCl2等化学试剂法）处理后，细胞膜通透等化学试剂法）处理后，细胞膜通透性发生了暂时性改变，成为能允许外源性发生了暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入细胞即分子进入细胞即感受态细胞感受态细胞(Competent cells)。重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第3页页 转化转化(Transformation)是将外源是将外源DNA分子引入受体分子引入受体细细胞，使之取得新胞，使之取得新遗传遗传性状一个性状一个伎伎俩俩，它是微生物，它是微生物遗传遗传、分子、分子遗传遗传、基因工程等研究、基因工程等研究领领域基本域基本试试验验技技术术。0.1mol/L CaCl2是一个低渗溶液，在是一个低渗溶液，在0低温低温处处理大理大肠肠杆菌杆菌细细胞胞时时，细细胞膨胞膨胀胀成球形，成球形，DNA可吸附在其表面。在短可吸附在其表面。在短暂热暂热冲冲击击（如（如42 ）下，）下，细细胞可吸收外源胞可吸收外源DNA。为为了判定了判定这这些些转转化子，化子，须须利用利用质质粒粒编码筛选标识编码筛选标识，这这些些标识标识赋赋予予细细菌新表型，是成功菌新表型，是成功转转化化细细菌很菌很轻轻易被易被筛选筛选出来。出来。pET32a质质粒粒带带有氨有氨苄苄西林抗性基因（西林抗性基因（Ampr），其重），其重组组体体转转化大化大肠肠杆菌能杆菌能够够在含氨在含氨苄苄西林培养基上生西林培养基上生长长，而未，而未转转化受体菌化受体菌则则不能再不能再这这种培种培养基上生养基上生长长。重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第4页页Ampr：氨苄西林抗性基因：氨苄西林抗性基因 内酰胺酶内酰胺酶多克隆位点（多克隆位点（MCS）：外源）：外源DNA片段插入位点片段插入位点Amps菌株菌株Ampr涂布于含涂布于含Amp培养基上，能够生长。次培养基上，能够生长。次日可见白色菌落日可见白色菌落-转化子。转化子。培养基上含有培养基上含有X-Gal和和IPTG时，可使用蓝白时，可使用蓝白斑筛选方法判别真正斑筛选方法判别真正重组转化子。重组转化子。pET32apET32a重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第5页页结构三大要素：结构三大要素：多克隆位点 选择标识（耐药性，LacZ）复制起始位点种类：种类：质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC）反转录病毒载体 表示载体等重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第6页页重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第7页页pET-32a VectorThe pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E.coli.重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第8页页pET-32 cloning/expression region重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第9页页Vector(pET-32a)Gene fragment(SmPR10)pET32a-SmPR10重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第10页页材料、设备及试剂材料、设备及试剂 材料材料 E.coli DH5菌株菌株:R-、M-、Amp-(转化过程所用受体细胞普转化过程所用受体细胞普通是限制修饰系统缺点变异株，即不含限制性内切酶和甲基化通是限制修饰系统缺点变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶突变体酶突变体(R,M),它能够容忍外源它能够容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗分子进入体内并稳定地遗传给后代。）传给后代。）pET32a-SmPR10质粒质粒DNA（浓度：（浓度：2 ng/l):试验室自制试验室自制设备设备 恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第11页页 试剂试剂 1、LB固体和液体培养基固体和液体培养基 LB培养基配方：（单位培养基配方：（单位g/L）胰蛋白胨胰蛋白胨 10 酵母提取物酵母提取物 5 NaCl 10 琼脂粉（琼脂粉（1.5%）15g （注：（注：LB液体培养基不加琼脂粉）液体培养基不加琼脂粉）按配方称量药品按配方称量药品,加入一定量加入一定量ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂，后置电炉上加热熔解琼脂，待琼脂完全熔解后加入待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至定容至1000ml,用用NaOH调整调整pH至至7.0。121湿热高压灭菌湿热高压灭菌20分钟，待冷却至分钟，待冷却至60左右左右,在超净工作台中加在超净工作台中加入一定量入一定量Amp储存液储存液,使终浓度为使终浓度为100g/ml,摇匀后用培养皿铺板。摇匀后用培养皿铺板。重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第12页页2、Amp母液：母液：称取氨苄西林称取氨苄西林100mg溶于溶于1mlddH2O中，中，0.22m滤器滤器过过滤除菌滤除菌，用，用1.5ml离心管分装后储存于离心管分装后储存于-20冰箱冰箱.3、0.1mol/L CaCl2 溶液溶液:称称0.56gCaCl2(无水分析纯无水分析纯),溶于溶于50ml重蒸水中重蒸水中,定容至定容至100ml,用用0.22m滤器过滤除菌或高压灭菌。滤器过滤除菌或高压灭菌。EP管分装于管分装于4冰箱储存冰箱储存.4、pET32a-SmPR10质粒：试验室自制质粒：试验室自制重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第13页页操操 作作 步步 骤骤（一）（一）受体菌培养受体菌培养 1、取、取-70或或-20贮存大肠杆菌贮存大肠杆菌DH5菌种，菌种，在在LB培养液中培养过夜，培养液中培养过夜，进行活化进行活化;2、取几微升活化后菌液（取量视菌密度而定）在、取几微升活化后菌液（取量视菌密度而定）在LB平板上涂布平板上涂布,于于37培养箱中培养培养箱中培养24h；从；从LB平板上挑取单菌落平板上挑取单菌落,接种于接种于3-5ml LB液体培液体培养基中养基中,37下振荡培养下振荡培养12小时左右小时左右,直至对数生长后期。直至对数生长后期。3、将该菌悬液以、将该菌悬液以1:100-1:50百分比接种于百分比接种于LB液体培养基中液体培养基中,37振荡培振荡培养养2-3小时至小时至OD600 0.5左右左右(生长对数期）。生长对数期）。（注：这一步非常关键。（注：这一步非常关键。培养过分菌液含有较多培养过分菌液含有较多“老老”细胞，制备成感受态细胞后其接收外援细胞，制备成感受态细胞后其接收外援DNA能力较低，从而造成转化率降低。）能力较低，从而造成转化率降低。）重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第14页页（二）、（二）、感受态细胞制备感受态细胞制备 (CaCl2 法法)1、将菌液、将菌液转转入入1.5ml离心管中离心管中,冰上冰上放置放置10分分钟钟,然后于然后于4、4000rpm离心离心10分分钟钟。2、弃去上清、弃去上清,用用预预冷冷0.1mol/LCaCl2 溶液溶液1ml轻轻悬轻轻悬浮浮细细胞胞,冰上放置冰上放置10分分钟钟后后,4、4000rpm离心离心10分分钟钟。3、弃去上清、弃去上清,加入加入0.1ml预预冷冷0.1mol/LCaCl2 溶液溶液,轻轻悬轻轻悬浮浮细细胞。每份胞。每份100l（注意（注意悬悬液密度要均匀）液密度要均匀）,冰上放冰上放置置备备用。用。4、暂时暂时不用感受不用感受态细态细胞可置于胞可置于-80保留。保留。注：注：CaCl2处理后细胞比较脆弱，尽可能温柔操作！处理后细胞比较脆弱，尽可能温柔操作！重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第15页页（三）（三）重组质粒重组质粒DNADNA转化转化 1.质质粒和感受粒和感受态细态细胞混和：在胞混和：在100l感受感受态细态细胞胞悬悬液中加液中加入入5l重重组质组质粒粒DNA（pET32a-SmPR10），），轻轻轻轻混匀混匀后冰上放置后冰上放置30分分钟钟。2.热击热击：42水浴中水浴中热击热击60秒（秒（注：准确注：准确计计算算时间时间，热热击过长击过长将将对细对细胞造成胞造成伤伤害害）,热击热击后后马马上置于冰上冷上置于冰上冷2-5分分钟钟。3.复复苏苏：向每管中加入：向每管中加入800l LB液体培养基液体培养基(注：不含注：不含Amp),混匀后在混匀后在37150rpm轻摇轻摇培养培养1小小时时，使，使细细菌恢菌恢复正常生复正常生长长状状态态，并表示，并表示质质粒粒编码编码抗生素抗性基因抗生素抗性基因(Ampr)。思索：思索：热击后细胞已吸入外源质粒，如本试验中热击后细胞已吸入外源质粒，如本试验中pET32a，该质粒可赋予宿主氨苄青霉素抗性。不过为，该质粒可赋予宿主氨苄青霉素抗性。不过为何复苏时用何复苏时用LB培养液不加培养液不加Amp？重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第16页页（四）涂布平板筛选转化质粒（四）涂布平板筛选转化质粒 1.将管中培养液摇匀后取将管中培养液摇匀后取100l 均匀涂布于含均匀涂布于含Amp筛选平筛选平板上。板上。（注：将培养液摇匀后涂布。）（注：将培养液摇匀后涂布。）2.正面向上放置半小时正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后待菌液完全被培养基吸收后倒置倒置培培养皿养皿，37温箱中培养过夜温箱中培养过夜，次日观察试验结果，次日观察试验结果。重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第17页页预期试验结果预期试验结果感受态细胞感受态细胞+重组质粒重组质粒0.1MCaCl2+重组质粒重组质粒感受态细胞感受态细胞+无菌水无菌水重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第18页页试验汇报 思索题思索题(1).依据本试验你认为影响转化率原因有哪些？依据本试验你认为影响转化率原因有哪些？(2).假如试验中对照组本不该长出菌落平板上长出了一些菌落，你假如试验中对照组本不该长出菌落平板上长出了一些菌落，你将怎样解释这种现象？将怎样解释这种现象？重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第19页页试验中要考虑主要原因试验中要考虑主要原因 为了提升转化效率为了提升转化效率,试验中要考虑以下几个主要原因：试验中要考虑以下几个主要原因：1.细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度:不要用经过屡次继代或储于不要用经过屡次继代或储于培养培养菌，最好从菌，最好从-70或或-20甘油保留菌种中直接转接用于制备感受甘油保留菌种中直接转接用于制备感受态细胞菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长久时为好，可经态细胞菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长久时为好，可经过监测培养液过监测培养液OD600 来控制。来控制。DH5菌株菌株OD600 为为0.5时时,细胞密细胞密度在度在5107 个个/ml左右左右(不一样菌株情况有所不一样不一样菌株情况有所不一样),这时比较适这时比较适当。密度过高或不足均会影响转化效率。当。密度过高或不足均会影响转化效率。重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第20页页 2.质粒质量和浓度质粒质量和浓度:用于转化质粒用于转化质粒DNA应主要是超螺旋态应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源。转化效率与外源DNA浓度在一定范围内成正比浓度在一定范围内成正比,但当但当加入外源加入外源DNA量过多或体积过大时量过多或体积过大时,转化效率就会降低。转化效率就会降低。10ngcccDNA即可使即可使100l 感受态细胞到达饱和。普通情况下感受态细胞到达饱和。普通情况下,DNA溶液体积不应超出感受态细胞体积溶液体积不应超出感受态细胞体积5。3.试剂质量试剂质量:所用试剂，如所用试剂，如CaCl2 等均需是高纯度等均需是高纯度(GR.或或AR.),并用超纯并用超纯水配制，最好分装保留于干燥冷暗处水配制，最好分装保留于干燥冷暗处。4.预防杂菌和杂预防杂菌和杂DNA污染：污染：严格来说，整个操作过程均应在无菌条件下严格来说，整个操作过程均应在无菌条件下进行进行,所用器皿所用器皿,如离心管如离心管,tip头等最好是新头等最好是新,并经高压灭菌处理并经高压灭菌处理,全部全部试剂都要灭菌试剂都要灭菌,且注意预防被其它试剂、且注意预防被其它试剂、DNA酶或杂酶或杂DNA所污染所污染,不然不然均会影响转化效率或杂均会影响转化效率或杂DNA转入转入,为以后筛选、判定带来无须要麻烦。为以后筛选、判定带来无须要麻烦。重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌实验转化大肠杆菌实验第第21页页