详细介绍抗体的分离纯化.pptx

.12.051抗体制抗体制备备、纯纯化及其化及其应应用用详细介绍抗体的分离纯化1/49 12/12/1212/2抗体分离和抗体分离和抗体分离和抗体分离和纯纯纯纯化化化化详细介绍抗体的分离纯化2/4912/12/1212/抗体分离纯化3l不论是将抗体用于研究还是用于检测或临床治疗，均需反抗体进行分不论是将抗体用于研究还是用于检测或临床治疗，均需反抗体进行分离与纯化。离与纯化。l分离：将抗体从其存在体液或培养液中分离出来并加以初步纯化。分离：将抗体从其存在体液或培养液中分离出来并加以初步纯化。l纯化：纯化：提升分离出来抗体纯度，并将其中杂质控制在所需低水平。提升分离出来抗体纯度，并将其中杂质控制在所需低水平。对治疗性抗体尤为主要。对治疗性抗体尤为主要。详细介绍抗体的分离纯化3/49 12/9/12/9/4一、样品处理分子类型产量特定污染物起源：野生型人类血清多克隆IgG，IgM，IgA，IgD，IgEIgG8-16mg/ml，IgM0.5-2mg/ml；IgA1-4mg/ml；IgD10-400mg/ml；IgE0.4mg/ml白蛋白，转运蛋白，a大球蛋白和其它血清蛋白杂交瘤细胞悬浮培养物单克隆多达1mg苯酚红，白蛋白，转运蛋白，牛IgG，a大球蛋白和其它血清蛋白，或者病毒无血清杂交瘤细胞悬浮培养物单克隆1-4mg/ml白蛋白，转运蛋白，经常取决于培养基情况腹水单克隆1-15mg/ml酯类，白蛋白，转运蛋白，脂蛋白，内源IgG和其它宿主蛋白蛋清IgY3-4mg/ml酯类，脂蛋白起源：重组表示胞外蛋白，表示到上清里面挂有表示标签抗体，抗体融合蛋白，Fab，或者其片段取决于表示系统宿主起源蛋白，如大肠杆菌中蛋白等，通常污染物较少胞内表示取决于表示系统来自宿主蛋白，如大肠杆菌或者噬菌体等天然和重组型抗体主要污染物起源总结详细介绍抗体的分离纯化4/49 12/9/12/9/5在样品纯化前要做主要工作有：除去一些杂质，如脂蛋白或者苯酚红等。除去大量杂志，如粗品中含量大杂蛋白等。更换缓冲液并除盐，把样品换到适当缓冲液中（PH和盐浓度），并除去没有用处小分子。详细介绍抗体的分离纯化5/49 12/9/12/9/6纯化前除去特定杂质脂蛋白脂蛋白和其它含脂物质能够阻塞色谱层析柱，最好能在纯化前除去，腹水通常含有高浓度脂蛋白。方法一：在二价离子存在情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋白，沉淀能够经过离心除去。步骤以下：1每毫升样品中加入0.04ml 10%硫酸右旋葡糖酐和1ml 1MCaCl2；2混合15分钟；310,000g离心10分钟；4丢弃沉淀；5使用脱盐柱将样品换到适合纯化缓冲液中；注意：离心通常能够防止过滤时造成蛋白非特异性吸附，血清蛋白样品能够经过玻璃绒毛过滤以除去酯类。详细介绍抗体的分离纯化6/49 12/9/12/9/7步骤以下:1.加入固体PVP到样品溶液中,至最终浓度为3%(w/v);2.在4度搅拌4小时;3.17,000g离心;4.丢弃沉淀;5.使用脱盐柱将样品换到适合纯化缓冲液中;方法二方法二:PVPPVP(聚乙烯聚乙烯吡咯烷吡咯烷酮酮)能能产生一个产生一个pHpH值依赖沉淀效应值依赖沉淀效应,PVP,PVP在在pH=7.0pH=7.0时能够沉淀时能够沉淀b-b-脂蛋白和球脂蛋白和球蛋白蛋白,不过脂蛋白不过脂蛋白不能够不能够在低于在低于pH4.0pH4.0时沉淀。时沉淀。详细介绍抗体的分离纯化7/49 12/9/12/9/8苯酚红是一个在试验室细胞培养中苯酚红是一个在试验室细胞培养中pHpH指示剂指示剂,即使并不直接影响纯化即使并不直接影响纯化,不过苯酚红可能结合到一不过苯酚红可能结合到一些纯化介质上些纯化介质上,应该尽可能早被除去。苯酚红能够在应该尽可能早被除去。苯酚红能够在pH7pH7时结合在阳离子柱上。时结合在阳离子柱上。苯酚红苯酚红 注意：使用脱盐柱除去苯酚红,而且把样品转移到适当缓冲液中以做深入纯化。详细介绍抗体的分离纯化8/49 12/9/12/9/9血清、腹水、细胞悬浮物或者细胞裂解物净化离心或者过虑是试验室净化样品最惯用到伎俩，这些方法适合用于任何起源少许样品。注意：离心或者过虑后马上进行色谱层析纯化。离心用于除去大多数颗粒物质，如细胞碎片。假如在离心后样品依然混浊，能够再选取一次5um滤膜过滤，再用滤膜再次过滤。注意：对于少许样品或者蛋白能吸附在滤膜上，能够用10000g离心15分钟。对于细胞样品，能够在40000到50000g离心15分钟，若样品需要短处理时间，能够降低到10到15分钟。离心时使用冷冻功效，而且在冷室或者离心机中提前预冷转子。血清样品能够在离心之后用玻璃绒毛过滤以除去剩下酯类。一、离心和过滤详细介绍抗体的分离纯化9/49 12/9/12/9/10过滤能除去颗粒物质。醋酸纤维素膜和PVDF(聚偏氟乙烯)膜能够有效降低对蛋白非特异性吸附。在色谱层析前，依照色谱层析胶粒大小选择适当滤膜孔径，这些列在下表中。滤膜通常孔径大小色谱层析柱中柱材颗粒大小1um90um或者更大0.45um30或者40um0.22um3，10，15um，或者需要愈加洁净样品时采取选择滤孔大小注意：用一个预跑来检测目标蛋白收率，因为有时候样品可能被滤膜表面非特异性吸附。过滤器可能会饱和就是滤膜有一个特定载量，所以在建立一个纯化步骤时，需要考虑这些。详细介绍抗体的分离纯化10/49影响离心法原因影响离心法原因离心机种类种类、离心方法离心方法、离心介质离心介质以及以及密度梯度密度梯度（一）离心速度（一）离心速度l低速离心普通用离心速度，即转子每分钟转数表示，如5000r/min等。l高速离心和超速离心时，往往以相对离心力（RCF）表示，如60000g等。l相对离心力是指颗粒所受到离心力与地心引力之比值。即：12/9/12/9/7详细介绍抗体的分离纯化11/49（二）离心时间（二）离心时间依据离心方法不一样，离心时间概念也有差异。依据离心方法不一样，离心时间概念也有差异。常常速速离离心心、高高速速离离心心和和差差速速离离心心离离心心时时间间，是是指指颗颗粒粒从从离离心心管管中中样样品品液液液液面面完完全全沉降到管底时间，即沉降时间；沉降到管底时间，即沉降时间；密密度度梯梯度度离离心心离离心心时时间间，是是指指形形成成界界限限分分明明区区带带时时间间，即即区区带带形形成成时时间间；等等密密度度梯度离心所需离心时间，是指颗粒完全抵达等密度点平衡时间，即平衡时间。梯度离心所需离心时间，是指颗粒完全抵达等密度点平衡时间，即平衡时间。8离心离心时间过时间过长或过短，都会影响颗粒在离心管长或过短，都会影响颗粒在离心管内预期位置，降低分离效果。内预期位置，降低分离效果。12/9/12/9/详细介绍抗体的分离纯化12/49 12/9/12/9/（三）温度l为预防欲分离物质在离心过程中聚集、变形和失活，离心温度普通控制为预防欲分离物质在离心过程中聚集、变形和失活，离心温度普通控制在在4 4 左右。左右。l离心速度较低或者物质耐热性很好，也能够在室温条件下进行。离心速度较低或者物质耐热性很好，也能够在室温条件下进行。l超速离心和高速离心，转子高速旋转会发烧而引发温度升高，必须采取超速离心和高速离心，转子高速旋转会发烧而引发温度升高，必须采取冷冻系统。冷冻系统。13（四）（四）（四）（四）pHpHpHpHl离心介质离心介质pHpH必须是处于待分离物质稳定必须是处于待分离物质稳定pHpH范围内，必要时可用缓冲溶液。范围内，必要时可用缓冲溶液。lpHpH过高或过低都可能引发生物活性物质变过高或过低都可能引发生物活性物质变性性、失活，还可能引发转子和离心机、失活，还可能引发转子和离心机其它部件腐蚀，应加以注意。其它部件腐蚀，应加以注意。详细介绍抗体的分离纯化13/49 12/9/12/9/第二节 沉淀分离14 假如假如样样品中含有大量低分子品中含有大量低分子污污染物染物,使用脱使用脱盐盐柱作柱作为为第一步色第一步色谱层谱层析析制制备样备样品品。增加盐浓度能够增强蛋白间疏水相互作用,疏水性不一样造成了一个选择性沉淀。使用沉淀法去除大量杂质低分子污染物一、盐析法一、盐析法一、盐析法一、盐析法在物质水溶液中添加一定浓度中性盐，使物质溶解度减小而沉淀析出，这一过程称为在物质水溶液中添加一定浓度中性盐，使物质溶解度减小而沉淀析出，这一过程称为“盐析盐析”。优点：优点：成本低，不需要昂贵设备成本低，不需要昂贵设备；操作简便，安全操作简便，安全；对许多生物活性物质含有稳定作用对许多生物活性物质含有稳定作用；对对pHpH、温度要求不严格。、温度要求不严格。缺点：分离效果有限缺点：分离效果有限详细介绍抗体的分离纯化14/49 12/9/12/9/15沉淀剂沉淀剂使用经典条件 样品类型 备注 硫酸铵硫酸铵下文有叔 大于1mg/ml蛋白,尤其使免疫球蛋白 用于稳定蛋白,不会变 性,上清能够直接上到 HIC（疏水层析柱）,降低了脂蛋白含量 右旋硫糖苷 加入0.04 ml of 10%右旋硫糖苷和1 ml of 1 M CaCl2/ml混匀 15 min并10 000 g离心 可用于高脂蛋白样品,比如腹水 沉淀脂蛋白 乙烯聚合物 加入3%(w/v)后搅拌4 小时,并17000g离心 可用于高脂蛋白 样品,比如腹水 能够选择右旋硫糖苷 PEG(Mr 4000)最多到20%血浆蛋白 没有变性,上清能够直接 过离子交换或亲和柱,完 全除去比较困难 丙酮(冷)在0摄氏度最多到 80%,在最高转速离 心后搜集小球 可能会不可逆使蛋白变 性,适合于小肽制备或 者制备电泳样品 聚乙烯亚胺 0.1%(w/v)沉淀聚集核酸蛋白 硫化精蛋白 1%(w/v)沉淀聚集核酸蛋白 硫酸链霉素 1%(w/v)沉淀核酸 辛酸 1:15(w/w)抗体含量应该大于 1mg/ml 沉淀血清或者腹水中大 量蛋白,仅把免疫球蛋白留在溶液中 惯用沉淀剂详细介绍抗体的分离纯化15/49 12/12/1212/l蛋白质在水溶液中溶解度是由蛋白质亲水基团、与水形成水化膜程度、以及所带有电荷情况决定。l当中性盐加入蛋白质溶液中，盐离子对水分子亲和力大于蛋白质，于是减弱甚至消除蛋白质分子周围水化膜。同时，盐离子所带电荷中和部分蛋白质分子表面电荷，愈加造成其溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。16 （一）盐析基本原理（一）盐析基本原理（一）盐析基本原理（一）盐析基本原理详细介绍抗体的分离纯化16/49 12/12/1212/p惯用中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和惯用中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠磷酸钠等等p硫酸铵最为惯用硫酸铵最为惯用，其优点是：溶解度大；温度系数小；密度，其优点是：溶解度大；温度系数小；密度小，有利于析出蛋白离心分离；蛋白沉淀物在小，有利于析出蛋白离心分离；蛋白沉淀物在2 mol/L2 mol/L 3 3 mol/Lmol/L硫酸铵溶液中稳定，低温下可保留一年；价廉易得；分硫酸铵溶液中稳定，低温下可保留一年；价廉易得；分离效果比其它盐好离效果比其它盐好。p但硫酸铵缓冲能力比较弱，但硫酸铵缓冲能力比较弱，pHpH难控制；铵离子干扰蛋白质测难控制；铵离子干扰蛋白质测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。p高浓度盐析法高浓度盐析法是粗纯样品惯用方法。是粗纯样品惯用方法。17 （二）（二）（二）（二）盐类和浓度选择盐类和浓度选择盐类和浓度选择盐类和浓度选择硫酸铵沉淀通常作为蛋白浓缩纯化第一步。这个方法通常能够有效除去大硫酸铵沉淀通常作为蛋白浓缩纯化第一步。这个方法通常能够有效除去大量白蛋白、铁传递蛋白和其它大量可溶杂质。量白蛋白、铁传递蛋白和其它大量可溶杂质。详细介绍抗体的分离纯化17/4918饱和硫酸铵溶液:100ml蒸馏水中加入100g硫酸铵,搅拌溶解;1M Tris Hcl pH8.0;作为第一步纯化缓冲液 所需溶液:1.过滤(0.45um),或者10,000g 4度离心;2.在10份样品中加入1份Tris Hcl pH8.0,以保持pH值;3.温和搅拌,逐滴加入硫酸铵溶液到50%饱和度,搅拌一小时;4.10,000g离心20分钟5.去除上清,用等体积硫酸铵重悬洗涤沉淀两次(比如,不能够重悬蛋白或者深入沉淀蛋白溶液),再次离心;6.用少许下步中所用缓冲液重悬沉淀;7.硫酸铵能够在superdex G25中得到除去;*经过调整硫酸铵浓度既能够沉淀目标分子,又能够沉淀杂质。离心后丢弃脂蛋白,样品能够经过玻璃绒毛以出去脂类。一些抗体可能被直接使用固体硫酸铵所破坏,硫酸铵沉淀应该尽可能使用液体,在重悬时尽可能防止气泡产生。在硫酸铵沉淀后,使用HIC作为后续步骤是最方便。通常,可重复纯化过程,应该防止使用硫酸铵沉淀,而选择用proteinG 或proteinA Sepharose柱子。通常,盐沉淀应该在蛋白浓度低于1mg/ml时进行。加入等体积饱和溶液(甚至35%-40%),能够降低铁转移蛋白和白蛋白污染。硫酸硫酸铵铵沉淀沉淀详细介绍抗体的分离纯化18/49 12/12/1212/（三）（三）影响盐析原因影响盐析原因1.1.蛋白质浓度蛋白质浓度l过高过高过低都不好，普通认为过低都不好，普通认为2.5 2.5%3.03.0%蛋白质浓度比较适当。蛋白质浓度比较适当。2.pH l蛋白质蛋白质所带净电荷越多，溶解度越大。盐析时溶液所带净电荷越多，溶解度越大。盐析时溶液pHpH常选择靠近蛋常选择靠近蛋白质等电点，使蛋白质净电荷靠近零。白质等电点，使蛋白质净电荷靠近零。3.温度l盐析盐析普通对温度要求并不严格，可在室温下进行。但对温度敏感物普通对温度要求并不严格，可在室温下进行。但对温度敏感物质，要求在质，要求在0 4 0 4 进行，预防蛋白质变性。进行，预防蛋白质变性。4.离子强度l离子强度离子强度越高，蛋白质溶解度越低，盐析也越易发生。不一样蛋白越高，蛋白质溶解度越低，盐析也越易发生。不一样蛋白质发生盐析所需要离子强度不一样质发生盐析所需要离子强度不一样 19 详细介绍抗体的分离纯化19/49 12/12/1212/蛋白质用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中盐除蛋白质用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中盐除去，惯用方法有去，惯用方法有：l透析法透析法l超滤法超滤法l葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G50G50层析法。层析法。20 （四）脱盐（四）脱盐（四）脱盐（四）脱盐详细介绍抗体的分离纯化20/49 12/12/1212/第三节第三节 离子交换层析法离子交换层析法离子交换层析法（ionexchangechromatography，IEC）是是利用离子交换剂上可交换离子与组分中离子发生可逆利用离子交换剂上可交换离子与组分中离子发生可逆交换时交换时结协力结协力差异，而进行分离一个技术。差异，而进行分离一个技术。广泛广泛应用于很多生命物质分析、制备和纯化等。应用于很多生命物质分析、制备和纯化等。21优点：优点：重现性好，简单易行；重现性好，简单易行；分辨力强，回收率高；分辨力强，回收率高；含有多孔性，表面积大、交换容量大；含有多孔性，表面积大、交换容量大；含有亲水性，对大分子吸附不牢靠，层析条件温和，不致引发物含有亲水性，对大分子吸附不牢靠，层析条件温和，不致引发物质变性或失活。质变性或失活。详细介绍抗体的分离纯化21/49 12/12/1212/22离子交换法离子交换法固定相是离子交固定相是离子交换剂换剂；若担体带有正电荷，可吸附若担体带有正电荷，可吸附着负电荷分子，则为阴离子着负电荷分子，则为阴离子交换法；不带净电荷分子，交换法；不带净电荷分子，以及阳离子则直接流出，不以及阳离子则直接流出，不会被吸附上去。会被吸附上去。这些被固相单体所吸附离子，这些被固相单体所吸附离子，统称为统称为counterion（抗衡离（抗衡离子），子），因为其电荷与担体上因为其电荷与担体上电荷相反电荷相反(counter是是相反相反意思意思)离子交换剂为人工合成惰性高分子聚合物，其上带有许多可电离基团，离子交换剂为人工合成惰性高分子聚合物，其上带有许多可电离基团，依据这些基团所带电荷不一样，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。依据这些基团所带电荷不一样，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。它可分三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。它可分三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。一、一、基本原理基本原理详细介绍抗体的分离纯化22/49 12/12/1212/阳离子交换反应：阳离子交换反应：R-A-H+Y+R-A-Y+H+阴离子交换反应：阴离子交换反应：R-B+OH-+X-R-B+X-+OH-lR代表离子交换剂高分子聚合物基质，代表离子交换剂高分子聚合物基质，lA-和和B+分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合电荷基团，分子聚合物共价结合电荷基团，lH+和和OH-分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂平衡分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂平衡离子，离子，lY+和和X-分别代表溶液中离子基团。分别代表溶液中离子基团。23详细介绍抗体的分离纯化23/49 12/12/1212/24离子交换层析对物质分离通常是在一根充填有离子交换剂玻离子交换层析对物质分离通常是在一根充填有离子交换剂玻璃管（璃管（1.5cm15cm）中进行。中进行。l含有预被分离离子含有预被分离离子溶液经过离子交换柱溶液经过离子交换柱时，各种离子即与离时，各种离子即与离子交换剂上荷电部位子交换剂上荷电部位竞争结合。竞争结合。l任何离子经过柱时任何离子经过柱时移动速率取决于与离移动速率取决于与离子交换剂亲和力、电子交换剂亲和力、电离程度和溶液中各种离程度和溶液中各种竞争性离子性质和浓竞争性离子性质和浓度。度。详细介绍抗体的分离纯化24/49 12/12/1212/25详细介绍抗体的分离纯化25/49 12/12/1212/l两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂结协力，主要取决于它们两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂结协力，主要取决于它们理化性质和在特定理化性质和在特定pHpH条件下展现离子状态条件下展现离子状态。l大多数蛋白在生理大多数蛋白在生理pHpH（pH6pH68 8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端，极端pHpH下下蛋白会变性失活，应尽可能防止。蛋白会变性失活，应尽可能防止。l洗脱可采取改变溶液洗脱可采取改变溶液pHpH或离子强度，也可同时改变或离子强度，也可同时改变pHpH与离子强度方法。改变与离子强度方法。改变pHpH可可能对蛋白稳定性有较大影响，能对蛋白稳定性有较大影响，普通采取改变离子强度梯度洗脱普通采取改变离子强度梯度洗脱。l用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵辅助能够使流入柱缓冲液中盐浓度平稳用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵辅助能够使流入柱缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。地上升，当离子强度能够中和蛋白电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。26详细介绍抗体的分离纯化26/49 12/12/1212/三、技术关键点三、技术关键点（一）离子交换剂选择和处理（一）离子交换剂选择和处理l两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂结协力，主要取决于它两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂结协力，主要取决于它们理化性质和在特定们理化性质和在特定pHpH条件下展现离子状态。条件下展现离子状态。l大多数蛋白在生理大多数蛋白在生理pHpH（pH6pH68 8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端pHpH下蛋白会变性失活，应尽可能防止。下蛋白会变性失活，应尽可能防止。l处理目标：使交换剂充分溶胀，使其颗粒孔隙增大，让含有交换活性电荷基团处理目标：使交换剂充分溶胀，使其颗粒孔隙增大，让含有交换活性电荷基团充分暴露出来，再用酸碱浸泡，除去杂质并使其带上需要反离子。充分暴露出来，再用酸碱浸泡，除去杂质并使其带上需要反离子。（二）装柱和加样（二）装柱和加样l选择平衡缓冲液离子强度和选择平衡缓冲液离子强度和pHpH时，首先要确保待分离物质稳定；其次是使离子时，首先要确保待分离物质稳定；其次是使离子交换剂与待分离物质有适当结合，而不与样品中杂质结合，以到达分离目标。交换剂与待分离物质有适当结合，而不与样品中杂质结合，以到达分离目标。l溶液离子强度惯用不影响蛋白质吸附到交换剂上最高离子强度液，惯用离子强溶液离子强度惯用不影响蛋白质吸附到交换剂上最高离子强度液，惯用离子强度为度为20 mmol/L 50 mmol/L NaCl20 mmol/L 50 mmol/L NaCl。27详细介绍抗体的分离纯化27/49 12/12/1212/28（三）洗脱和搜集（三）洗脱和搜集洗脱可采取改变溶液洗脱可采取改变溶液pHpH或离子强度，也可同时改变或离子强度，也可同时改变pHpH与离子强度方法。改变与离子强度方法。改变pHpH可能对蛋白稳定性有较大影响，普通采取改变离子强度梯度洗脱。可能对蛋白稳定性有较大影响，普通采取改变离子强度梯度洗脱。用一定盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵辅助能够使流入柱缓冲液中盐浓用一定盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵辅助能够使流入柱缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。（四）离子交换剂再生与保留（四）离子交换剂再生与保留使其带上所需平衡离子。使其带上所需平衡离子。详细介绍抗体的分离纯化28/49 12/12/1212/四、影响交换容量原因四、影响交换容量原因离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及分离样品组分质量大小：离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及分离样品组分质量大小：普通普通离子交换剂孔隙应尽可能让样品组分进入，使样品组分与离子交换剂孔隙应尽可能让样品组分进入，使样品组分与离子交离子交换剂作用换剂作用面积增大。充分暴露电荷基团增加有效交换容量；面积增大。充分暴露电荷基团增加有效交换容量；离子强度：离子强度：溶液溶液中离子强度增大时，离子对交换剂上束缚位点就会增强竞争作用，中离子强度增大时，离子对交换剂上束缚位点就会增强竞争作用，降低有效交换容量；降低有效交换容量；pHpH：弱酸型离子交换剂弱酸型离子交换剂伴随伴随pHpH增大，电荷基团解离增加，交换容量加大。增大，电荷基团解离增加，交换容量加大。但弱碱型离子交换剂交换容量伴随但弱碱型离子交换剂交换容量伴随pHpH下降而增大。下降而增大。带有带有强电荷基团离子交换剂在任何强电荷基团离子交换剂在任何pHpH溶液中都处于解离状态，所以交溶液中都处于解离状态，所以交换容量基本与换容量基本与pHpH改变无关。改变无关。29详细介绍抗体的分离纯化29/49 12/12/1212/第四第四节节 凝胶层析（凝胶层析（gel chromatographygel chromatography）凝胶凝胶排阻层析（排阻层析（gel exclusion chromatographygel exclusion chromatography）分子筛分子筛层析（层析（molecular sieve chromatographymolecular sieve chromatography）l是以各种多孔凝胶为固定相，当混合物随流动相经过凝胶层是以各种多孔凝胶为固定相，当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不一样而被分离技术。析柱时，其中各组分按其分子大小不一样而被分离技术。l该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高，不需该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高，不需要有机溶剂、不改变样品生物学活性要有机溶剂、不改变样品生物学活性 ，l除惯用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等物质外，还除惯用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等物质外，还能够用于测定蛋白质相对分子质量，以及样品脱盐和浓缩等。能够用于测定蛋白质相对分子质量，以及样品脱盐和浓缩等。30详细介绍抗体的分离纯化30/49 12/12/1212/31详细介绍抗体的分离纯化31/49 12/12/1212/32凝胶是一个不带电含有三维空间多空网状结构、呈珠状颗粒凝胶是一个不带电含有三维空间多空网状结构、呈珠状颗粒物质，每个颗粒细微结构及筛孔直径均匀一致，像筛子，小物质，每个颗粒细微结构及筛孔直径均匀一致，像筛子，小分子能够进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。分子能够进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。一一、基基本本原原理理详细介绍抗体的分离纯化32/49 12/12/1212/33（1 1）蛋白质混合物上柱）蛋白质混合物上柱;（2 2）洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子则被排阻于颗粒）洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子则被排阻于颗粒之外之外;（3 3）小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开）小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开;（4 4）大小分子完全分开）大小分子完全分开;（5 5）大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行进中。）大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行进中。详细介绍抗体的分离纯化33/49 12/12/1212/34l假如两种以上不一样相对分子质量分子都能进入凝胶颗假如两种以上不一样相对分子质量分子都能进入凝胶颗粒网孔，但因为它们被排阻和扩散程度不一样，在凝胶粒网孔，但因为它们被排阻和扩散程度不一样，在凝胶柱中所经过旅程和时间也不一样，从而彼此也能够分离柱中所经过旅程和时间也不一样，从而彼此也能够分离开来。开来。l凝胶层析中物质分子量不是唯一分离依据，有些物质分凝胶层析中物质分子量不是唯一分离依据，有些物质分子量相同，但因为分子形状不一样，再加上各种物质与子量相同，但因为分子形状不一样，再加上各种物质与凝胶之间存在着非特异性吸附作用，故依然可分开。凝胶之间存在着非特异性吸附作用，故依然可分开。详细介绍抗体的分离纯化34/49 12/12/1212/二、惯用凝胶二、惯用凝胶l凝胶是一类不溶于水，在水中有较大膨胀度和很好分子筛凝胶是一类不溶于水，在水中有较大膨胀度和很好分子筛功效化合物。惯用有：功效化合物。惯用有：l葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（dextrandextran）l聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidepolyacrylamide）l琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（agaroseagarose）l聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶l另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等。另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等。35详细介绍抗体的分离纯化35/49 12/12/1212/第五节 亲和层析法l亲和层析是利用一些生物分子之间专一可逆结合亲和层析是利用一些生物分子之间专一可逆结合特征一个高度专一吸附层析类型。特征一个高度专一吸附层析类型。l配体是发生亲和反应功效部位，也是载体和被亲配体是发生亲和反应功效部位，也是载体和被亲和分子之间桥梁。和分子之间桥梁。l配体本身必须有两个基团：配体本身必须有两个基团：l一一个能与载体共价结合，连接后配体对互补分子个能与载体共价结合，连接后配体对互补分子亲和力不会改变亲和力不会改变l一一个能与被亲和分子结合。个能与被亲和分子结合。36详细介绍抗体的分离纯化36/49 12/12/1212/37亲和层析法有点像在钓鱼，鱼是我们所要分子亲和层析法有点像在钓鱼，鱼是我们所要分子 (B)(B)杂夹在一堆蛋白质当中，杂夹在一堆蛋白质当中，鱼饵是与鱼饵是与 B B 含有专一性分子含有专一性分子 (A,(A,上图上图 1)1)；A A 与与 B B 专一性很高，只会在样本专一性很高，只会在样本中与中与 B B 结合，而排除其它杂质结合，而排除其它杂质 (上图上图 2)2)；若把结合在吸着剂上；若把结合在吸着剂上 B B 溶离下来，溶离下来，就能够得到均质就能够得到均质 B(B(上图上图 3)3)。详细介绍抗体的分离纯化37/49 12/12/1212/38详细介绍抗体的分离纯化38/49 12/12/1212/二、载体和配体选择二、载体和配体选择（一）（一）载体载体理想载体应具备以下特征：理想载体应具备以下特征：1.1.高度亲水性，使固相配体易与水溶液中生物大分子物质靠近。高度亲水性，使固相配体易与水溶液中生物大分子物质靠近。2.2.惰性载体，非特异吸附性极低。惰性载体，非特异吸附性极低。3.3.含有相当量化学基团可供活化，而且轻易和配体结合，不改变载体和配含有相当量化学基团可供活化，而且轻易和配体结合，不改变载体和配体基本性质。体基本性质。4.4.含有很好理化稳定性，不易受到周围条件（如含有很好理化稳定性，不易受到周围条件（如pHpH、离子强度、温度、变、离子强度、温度、变性剂和去污剂等）影响。机械性能好，含有一定颗粒形式以保持一定流性剂和去污剂等）影响。机械性能好，含有一定颗粒形式以保持一定流速。速。5.5.含有均匀多孔网状结构，能使被亲和大分子自由经过而增加配体有效浓含有均匀多孔网状结构，能使被亲和大分子自由经过而增加配体有效浓度。度。惯用载体有纤维素、琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多惯用载体有纤维素、琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等。孔玻璃等。39详细介绍抗体的分离纯化39/49 12/12/1212/（二）（二）配体配体优良配体须具备以下特征：优良配体须具备以下特征：1.1.配体与待分离物质有适当亲和力。配体与待分离物质有适当亲和力。2.2.配体与待分离物质之间亲和力要有较强特异性，不与配体与待分离物质之间亲和力要有较强特异性，不与其它组分有非特异性吸附作用。其它组分有非特异性吸附作用。3.3.配体必须具备与载体共价结合功效基团，而且这种结配体必须具备与载体共价结合功效基团，而且这种结合不能严重影响配体间亲协力及结合特异性。合不能严重影响配体间亲协力及结合特异性。4.4.配体应含有很好稳定性，能够耐受偶联以及洗脱时可配体应含有很好稳定性，能够耐受偶联以及洗脱时可能较猛烈条件，能够屡次重复使用。能较猛烈条件，能够屡次重复使用。40详细介绍抗体的分离纯化40/49 12/12/1212/41亲和层析亲和层析中部分蛋白配体中部分蛋白配体配基配基纯化物质蛋白蛋白A/蛋白蛋白G各种免疫球蛋白各种免疫球蛋白单克隆抗体单克隆抗体各种抗原、蛋白各种抗原、蛋白A抗原抗原特异性单克隆抗体、特异性多克隆抗体特异性单克隆抗体、特异性多克隆抗体核苷酸核苷酸核苷酸结合蛋白、核苷酸酶核苷酸结合蛋白、核苷酸酶血凝素血凝素糖蛋白糖蛋白蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶蛋白酶脂肪酸脂肪酸脂肪酸结合蛋白、清蛋白脂肪酸结合蛋白、清蛋白糖糖血凝素、糖血凝素、糖苷苷甘酶甘酶生物素生物素亲和素、生物素结合蛋白亲和素、生物素结合蛋白肝素肝素凝血因子、酯酶、凝血因子、酯酶、DNA聚合酶、连接组织蛋白聚合酶、连接组织蛋白酶酶钙调蛋白钙调蛋白钙调蛋白结合酶钙调蛋白结合酶Triazine染料染料脱氢酶、激酶、多聚酶、干扰素、限止酶等脱氢酶、激酶、多聚酶、干扰素、限止酶等详细介绍抗体的分离纯化41/49 12/12/1212/l一个可应用亲和纯化标签：一个可应用亲和纯化标签：6 6组氨酸标签组氨酸标签l组氨酸咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子组氨酸咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子l在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签目标蛋白与镍柱结合在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签目标蛋白与镍柱结合l在低在低pHpH下用咪唑竞争洗脱下用咪唑竞争洗脱 42详细介绍抗体的分离纯化42/49 12/12/1212/43抗体纯化填料选择关键点一、填料种类选择1）血清中抗体含量 备注：Protein A/G通常结合抗体重链，而protein L 通常结合抗体轻链。重链和轻链都有亚型之分，不一样亚型对protein A/G/L结合能力不一样。其中protein L 结合kappa链，不一样物种血清总抗体中kappa链百分比不一样。详细介绍抗体的分离纯化43/49 12/12/1212/442）protein A/G/L结合特异性Binding Affinities of recombinant Protein L,Protein A,and Protein G Immunoglobulin binding domains备注：上面这张表来自于pierce说明书，给出了主要信息，对于不一样抗体，Protein A/G/L结合能力不一样。通常我们推荐首选protein A填料，这种填料使用最广泛，有耐碱性填料能够选择。只有当protein A填料结合不好，才选择protein G填料。L不到最终要考虑。因为 protein L 即使在上表中看起来能够结合很多种类抗体，其实它只结合kappa链，而kappa链本身还有深入亚型之分，所以对于单抗来说，不结合protein L 填料概率是比较大。详细介绍抗体的分离纯化44/49 12/12/1212/45二、结合条件优化1）protein A结合条件备注：亲和填料选定以后，需要考虑结合条件，洗脱条件优化。只有经过优化，才能取得最高纯度同时保持抗体活力,尤其需要优化是pH。相对而言proteinA反抗体结合需要稍高一点pH,详细选择见上表。详细介绍抗体的分离纯化45/49 12/12/1212/46由protein A/G对鼠抗igG1亲和力表，我们能够知道，这两种填料对小鼠igG1结合，protein G 要大于protein A,所以做鼠抗纯化，能够优先考虑protein G 亲和填料。假如使用protein A填料，下列图结合pH依赖性可供参考。2）protein A 结合鼠抗igG1pH依赖性详细介绍抗体的分离纯化46/49 12/12/1212/47四、抗体结合亲和填料选择1）首选protein Aprotein A 有耐碱形式突变体，它愈加稳定，脱落更少。所以，在proteinA能够结合情况下，它一些纯化性质比protein G/L愈加清楚，首选protein A亲和填料。选择protein A 亲和填料，需要配套选择pH8.5-9.0结合缓冲液，实现愈加好结合。2）次选protein G羊抗体和protein A结合性质不好，小鼠igG1和protein A结合也不好，此时能够选择protein G,人抗体和protein A/G结合都不错，但考虑到盐浓度，pH梯度等影响，选择protein G操作更简单，方便，只要使用PBS对样品进行一定程度稀释，就能够很好和protein G 亲和填料结合。详细介绍抗体的分离纯化47/49 12/12/1212/483）protein L选择在protein A/G结合效果都不好时候，protein L 是一个很好补充,它结合抗体kappa轻链。对于多抗来说，需要判断kappa和lamda轻链百分比，假如lamda轻链百分比占优势，使用protein L 纯化，将损失较多目标抗体。对于单抗来说，假如不论是鼠抗，还是兔抗，kappa链都占有优势，能够尝试protein L 纯化。这种填料纯化纯度也很不错，不过请注意是：kappa轻链也有各种亚型，并不是每一个都能够和protein L 结合。4）thiophilic resin 选择有一些单抗，对于protein A/G/L结合都不好，在优化了pH、盐浓度之后，还是处理不了问题。此时我们推荐尝试亲硫胶纯化（thiophilic resin）。这种填料和抗体之间结合并不是十分特异，基本上经过缓冲液中硫酸根桥联作用和目标分子上巯基发生作用。要提升纯度话，推荐使用盐梯度洗脱（硫酸盐从500 mM 逐步降低）。这种填料优势在于，洗脱条件非常温和（能够PBS洗脱），对于不稳定抗体来说，有主要价值。详细介绍抗体的分离纯化48/49 12/9/12/9/49THANKS!详细介绍抗体的分离纯化49/49