脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训专家讲座.pptx

器材准备器材准备浓汁标本浓汁标本1 1支，粪便标本支，粪便标本1 1支；碘酒棉球支；碘酒棉球1 1瓶，酒精棉球瓶，酒精棉球1 1瓶，眼科镊子瓶，眼科镊子2 2把；伊红美兰平板把；伊红美兰平板2 2个，营养琼脂平板个，营养琼脂平板5 5个。个。脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第1页自然界中微生物v已经发觉微生物大约13万5千各种，被认为非常危险有600种，在人间传染病原微生物380种。这些微生物存在于地球各个角落，从严寒极地到酷热赤道，从4.2千米地层深处到85千米高空（芽孢）,都有它们踪迹。v空气、水、土壤、人体体表以及与外界相通腔道，都 有 不 一 样 种 类 和 数 量 微 生 物 存 在。v存在于人体消化道细菌细菌超出800种，数量可达100万亿（1014），菌体重量11.5千克。脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第2页医学微生物学试验综合性试验三 Comprehensive Experiment 3 v空气与人体体表细菌学检验空气细菌学检验P38手指皮肤细菌学检验P41脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第3页空气细菌学检验P38 空气是人类赖以生存环境之一，也是主要疾病传输媒介。空气中病原菌主要来自病人排泄物和分泌物。这些污物，因风吹，以及人类日常活动，以气溶胶形式悬浮于空中，使空气受到污染。v环境：不利于微生物生长。v种类：主要是病毒、真菌和细菌。在医院，公共场所致病菌数量比较多。v作用：可快速全球传输。v危害：引发培养基、生物制品污染，病原菌引发呼吸道传染病。脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第4页v试验方法：自然沉降法是依据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力作用下，以垂直自然方式沉降到培养基表面；培养以后，计数菌落形成单位（colony forming unit，CFU），了解空气污染情况。v试验步骤：每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（试验室、宿舍、卫生间、饭堂或任选地点），将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁，平板暴露于空气中15分钟，然后盖上盖子，作标识。37温箱培养24小时，观察结果。CFU/m3 50000NAT86N(直径7cm平板）。N：平板上菌落数。A：平板面积(平方厘米)。T：采样时间(分钟)。脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第5页v空气细菌学检验 暴露法（Exposure Method)组号地点时间(min)菌落形成单位(CFU)1卫生间152食堂153门诊大厅154呼吸科病房155呼吸科ICU156外科病房157外科ICU158外科治疗室159婴儿室1510v试验室15脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第6页手指皮肤细菌学检验P41 在日常生活中，手接触范围广，使用频率高，受到污染机会也最多。一只外观比较“洁净”手，可携带10万个细菌、200各种病毒。所以，经手传输疾病很多，范围很广，包含肠道传染病、部分呼吸道传染病、皮肤传染病，以及一切可经手间接传输疾病。v常住菌：常住菌：存在于皮肤表面、毛囊和皮脂腺。种类和数量比较恒定。附着在皮肤上比较牢靠，用普通洗手方法，常不易去除。v暂住菌：暂住菌：存在于皮肤表面经常暴露部位。暂住菌是外来非正常菌群，种类和数量不定。引发人类致病通常是暂住菌。脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第7页v医务人员，经常要与病人接触，不论是直接接触，还是间接接触，都有传输病菌可能。即使病菌直接起源是患者,不过造成病菌扩散主要路径则是气溶胶和医务人员手。所以，经常洗手和消毒是控制医院内交叉感染主要方法。v实际上，预防感染办法中，最简单又十分有效方法就是洗手。据测定，只用自来水洗手可使暂住暂住菌菌总数降低40%，用肥皂洗手可降低80%以上。v洗手？脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第8页常规洗手方法常规洗手方法（甲和丙操作）v将手充分浸湿，涂抹肥皂或洗涤液。v重复搓揉双手，搓揉时间不应少于 30秒。v用流水冲洗洁净，整个洗手过程不少于1分钟。能有效地去除大多数手上暂住菌。脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第9页医学微生物学试验室标准洗手方法标准洗手方法（乙和丁操作）v用流动水冲洗，将手充分浸湿，涂抹肥皂、洗涤液。用流动水冲洗，将手充分浸湿，涂抹肥皂、洗涤液。v分别搓擦分别搓擦10101515次。次。v保持双手低于肘部，保持双手低于肘部，流水冲洗一分钟以上。流水冲洗一分钟以上。1.1.掌心对掌心搓擦掌心对掌心搓擦 2.2.手指交织掌心对手背搓擦手指交织掌心对手背搓擦 3.3.手指交织掌心对掌心搓擦手指交织掌心对掌心搓擦4.4.两手互握互搓指背两手互握互搓指背 5.5.拇指在掌中转动搓擦拇指在掌中转动搓擦 6.6.指尖在掌心中搓擦指尖在掌心中搓擦脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第10页1.掌心对掌心搓擦掌心对掌心搓擦 2.手指交织掌心对手背搓擦手指交织掌心对手背搓擦 3.手指交织掌心对掌心搓擦手指交织掌心对掌心搓擦4.两手互握互搓指背两手互握互搓指背 5.拇指在掌中转动搓擦拇指在掌中转动搓擦 6.指尖在掌心中搓擦指尖在掌心中搓擦脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第11页医务人员洗手指征v接触传染病患者之后。v接触携带多耐药性细菌病人之后。v接触病人血液、体液、分泌物和排泄物之后。v接触高危病室两个病人之间、新生儿室两个新生儿之间v接触旧钱币之后。v上厕所前前后。v进行微生物操作或作血、尿等生化、免疫测定之后。v在施行各种手术前后。v诊疗、治疗、护理尤其易感染病人之前。v进食之前。脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第12页1 3 2 4 1 3 2 4 手指皮肤细手指皮肤细菌学检验菌学检验第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。2人1个营养琼脂平板上:甲、丙常规洗手下:乙、丁标准洗手甲（丙）乙（丁）丙丁脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第13页医学微生物学试验综合性试验一(P2)v脓汁和粪便标本中病原菌检测(二）临床标本检验程序 细菌分离与培养P7目标要求：掌握分离、纯化微生物基本操作技术。脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第14页常见病原性球菌检验程序常见病原性球菌检验程序P47P47：直接涂片、革兰染色、镜检直接涂片、革兰染色、镜检脓汁、痰、咽部分泌物脓汁、痰、咽部分泌物 观察菌落性状、溶血性、色素观察菌落性状、溶血性、色素 血琼脂平板培养血琼脂平板培养 涂片染色镜检涂片染色镜检 挑取可疑菌落挑取可疑菌落 生化反应生化反应 纯培养纯培养 动物试验动物试验 药敏试验药敏试验血液、穿刺液血液、穿刺液 肉汤增菌培养肉汤增菌培养 培养液涂片染色境检培养液涂片染色境检 常见肠道致病菌检验程序常见肠道致病菌检验程序P48P48：粪便粪便 SS SS琼脂、伊红美蓝平板培养琼脂、伊红美蓝平板培养 挑取可疑菌落挑取可疑菌落 血清学判定血清学判定 血、骨髓血、骨髓 增菌培养增菌培养 双糖铁培养基双糖铁培养基 染色镜检染色镜检 生化反应生化反应 脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第15页平板划线分离法平板划线分离法 Streak Plate MethodStreak Plate Methodv借助于划线，将混杂各种各种细菌，在固体培养基表面分散成单个单个细菌，并固定在某一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖，形成肉眼可见细菌集团。在固体培养基表面或基内，由单个细菌在局部位置不停增值稠密群体称为单菌落单菌落。在固体培养基表面，由多个菌落融合在一起形成细菌堆积物,称为菌苔菌苔。脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第16页平板分区划线分离法步骤（平板分区划线分离法步骤（5 5区）区）v接种环烧灼灭菌，以免污染标本。v取标本在平板表面上方密集涂布510mm2。v烧掉接种环上多出标本（火焰后面烤干烧灼）。v晃动平板，当看到平板表面象镜面有反光时候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，方便控制划线。v接种环与平板呈3040度角，经过密集涂布部分13次，使接种环重新沾上少许标本(细菌)，然后在平板表面，以曲线形式，作大幅度往返连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30条。v转动平板，接种环经过第一区1次，一样 方法划第二区。如此依次划完35区。v接种环烧灼灭菌，以免污染环境。v将平板倒置37培养1824h。充分利用平板面积，不能划破琼脂。充分利用平板面积，不能划破琼脂。第四区脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第17页平板划线分离小组分工v甲脓汁标本营养琼脂平板(nutrient agar plate)v乙脓汁标本营养琼脂平板(nutrient agar plate）v丙粪便标本伊红美蓝平板(eosin methylene blue plate）v丁粪便标本伊红美蓝平板(EMB plate）脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第18页试验分组试验分组v俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。v每组按从前到后,从左到右次序，分别编号为甲、乙、丙、丁。甲 乙 4丙 丁甲 乙 3丙 丁甲 乙 2丙 丁甲 乙 1丙 丁甲 乙 5丙 丁甲 乙 8丙 丁甲 乙 7丙 丁甲 乙 6丙 丁甲 乙 10丙 丁甲 乙 9丙 丁 讲 台脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第19页杆1214cm环直径24mm柄10cm接种环接种环 inoculatinginoculating looploop杆1214cm柄10cm针46cm接种针接种针 straight wire straight wire inoculating inoculating wirewire,inoculatingneedleinoculatingneedle脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第20页接种环烧灼灭菌 Flame Loopv使用前，直接在酒精灯上烧灼灭菌，把环和金属丝烧红即可。v使用后，先在火焰后面将把环上标本烤干，再烧灼灭菌，以免标本汽化，爆烈四溅，污染环境。v金属杆快速经过火焰23次，杀灭表面微生物。脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第21页酒精灯无菌操作区外焰外焰:又称氧化焰又称氧化焰,火火焰呈淡紫色焰呈淡紫色,温度较高。温度较高。无菌操作区无菌操作区:火焰周火焰周围围101020cm20cm范围内。范围内。脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第22页环面水平水平离开液面：快速6ul,慢速2ul。环面垂直垂直离开液面：快速3ul,慢速1ul。接种环取液体标本方法：接种环取液体标本方法：环直径环直径3mm3mm脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第23页无菌取材基本步骤无菌取材基本步骤脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第24页接种环、平板握持方法接种环、平板握持方法脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第25页接种环、平板握持方法接种环、平板握持方法脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第26页正确正确correctcorrect错误错误incorrectincorrect平板划线示意图平板划线示意图涂布涂布spreadingspreading细菌大多分细菌大多分散成单个。散成单个。细菌前段很多，后细菌前段很多，后段太少，分离效果段太少，分离效果差。差。脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第27页脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第28页510mm2 30条线/区平板划线不少于150条线脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第29页37培养24小时 脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第30页37培养24小时 脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第31页生物安全警告v接种环接种平板一次，可产生几十个微生物气溶胶颗粒。v气溶胶粒径100um沉降很快，50um在0.4s内扩散开，5um经过呼吸道直接抵达肺泡。vPike博士对试验室感染统计分析结果发觉，不明原因感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引发。v试验时应坐着，在火焰周围1020厘米内操作，保持平静、有序，尽可能少说话、少走动，以免感染病原菌。脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第32页思索题v为何取链球菌作为空气卫生指标之一?v为何金黄色葡萄球菌是医院内感染常见主要病原菌?v为何接种环使用前后必须烧灼灭菌？忽略了有什么危害?v做细菌培养时，平板为何要倒置?v培养细菌惯用方法有哪些?v从临床标本中分离病原菌，应注意哪些事项?脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第33页试验内容v空气细菌学检验P38营养琼脂平板(黄色,1组1个）v手指皮肤细菌学检验P41营养琼脂平板(黄色,2人1个 划分8格）v平板划线分离法P8 甲脓汁标本营养琼脂平板(黄色）乙脓汁标本营养琼脂平板(黄色）丙粪便标本伊红美蓝平板(紫色）丁粪便标本伊红美蓝平板(紫色）脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第34页惯用器材摆放次序：电源插座惯用器材摆放次序：电源插座试管架试管架酒精灯酒精灯污物盘。污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第试管架上器材：靠近插座一侧第1 1和第和第2 2列分别放置接种针列分别放置接种针和接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。和接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第35页试验器材试验器材 整齐有序整齐有序脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第36页微生物学器材柜微生物学器材柜-2-2（边台东侧中段）（边台东侧中段）酒精棉球酒精棉球碘酒棉球碘酒棉球镊子镊子电炉、石棉网电炉、石棉网手套手套消毒器材收拾入柜消毒器材收拾入柜 依次摆整齐依次摆整齐脓汁和粪便标本中病原菌的检测培训第37页